Method Article

마우스 고환에서 단백질 결합 RNA를 효율적으로 식별 하기 위한 향상 된 가교 면역 침전 (eCLIP) 방법

DOI:

10.3791/59681

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May 10th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Reproductive Medicine, Nanjing Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서, 우리는 고환에서 RBP 후보자의 주요 RNA 표적을 결정 하는 eCLIP 프로토콜을 제시 합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

정자 생성은 포유류에서 남성 생식 세포 분화의 고도로 주문 된 과정을 정의 합니다. 고환에서, 전사 및 번역은 결합 되지 않습니다, RBPs에 의해 조율 된 유전자 발현의 포스트 전사 조절의 중요성을 밑줄. RBP의 기계적 역할을 명료 하 게 하기 위해, 가교 면역 침전 (CLIP) 방법론은 내 인 성 직접 RNA 표적을 포착 하 고 실제 상호작용 부위를 정의 하는데 사용 될 수 있다. 향상 된 클립 (eCLIP)은 기존 클립에 비해 여러 가지 장점을 제공 하는 새롭게 개발 된 방법입니다. 그러나, eCLIP의 사용은 지금까지 확장 된 응용 프로그램에 대 한 호출, 셀 라인에 제한 되었습니다. 여기에서, 우리는 마우스 고환에서 두 개의 알려진 RNA 결합 헬 리 아 제를 연구 하기 위해 eCLIP을 사용 했습니다. MOV10 및 MOV10L1 예상한 바와 같이, 우리는 MOV10 우세 하 게 mRNA의 3 ' 미 번역 지역 (UTRs)에 결합 하 고 MOV10L1 선택적으로 Piwi 상호 작용 RNA (피 르 나) 전 구체 전사체에 묶는 것을 발견 합니다. 우리의 eCLIP 방법은 깊은 시퀀싱을 진행 하기 위한 영장으로 서브 클론의 소규모 시퀀싱 및 자격을 갖춘 라이브러리의 가용성을 통해 다양 한 RBPs에 의해 바인딩된 주요 RNA 종의 빠른 결정을 할 수 있습니다. 본 연구는 포유류 고환에서의 eCLIP에 대 한 적용 가능한 기초를 확립 한다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

포유류 고환은 다 수의 정자를 생산 하기 위해 복잡 한 세포 분화 프로그램이 순환적으로 실행 되는 우수한 발달 모델을 나타낸다. 이 모델의 독특한 가치는 정자의 특정 단계에서 전사 불 활성화의 출현에 놓여 있으며, 일반적으로 meiotic 성 염색체 불 활성화 (MSCI)가 발생 하면1,2 및 둥근 spermatogenesis가 발생할 때 세정 동안 급격 한 핵 압축. 이 연속적인 전사 이벤트는 RNA 결합 단백질 (RBPs)이 전사체를 형성 하 고 남성의 비 옥을 유지 하는 중요 한 역할을 하는 전사 후 유전자 조절을 필요로 합니다.

생체 내에서 개별 rbp의 선의의 rna 표적을 규명 하기 위해, 상기 가교 면역 침전 (CLIP) 법은 통상의 rna 면역 침전 (RIP)을 넘어서는것을 기준으로4,5를 개발 하였으며,7 , 자외선 (UV) 가교 결합, 엄격한 세척 및 겔 전달을 포함 하는 주요 단계의 혼 입에 의해 신호 특이성을 향상 시킨다. 고 처리량 시퀀싱과 결합 된 클립의 진보 된 응용은 게놈 전체 수준8에서 단백질 RNA 상호작용을 프로 파일링 하는 것에 큰 관심을 불러 일으킨 것입니다. RBP 기능에 대 한 유전 연구 외에, 내 인 성 단백질과 RNA의 직접적인 상호 작용을 식별 하는 이러한 생화학 적 방법은 Rbp의 RNA 규제 역할을 정확 하 게 해명 하는 데 필수적입니다. 예를 들어, MOV10L1는 남성의 비 옥 및 Piwi 상호작용 RNA (피 르 나) 생물 발생9에 필요한 고환 특이 rna 헬 리 아 제 이다. 그것의 paralogue MOV10는 rna 생물학의 다 양상에서 역할을 가진 ubiquitously 표현 되 고 다기능 rna 헬 리 아 제로 알려져 있습니다10,11,12,13 , 15 , 16 , 17 , 18. 종래의 클립-서 열을 채용 함으로써, 우리는 MOV10L1이 초기 피 르 나 전 구체를 결합 하 고 조절 하는 것을 발견19,20, 그리고 MOV10 mRNA 3 ' utrs 뿐만 아니라 비 코딩 RNA를 개시 하기 위하여 고환 배아 세포의 종 (데이터가 표시 되지 않음).

그럼에도 불구 하 고, 클립은 원래 힘든, 클립 태그의 현저한 손실로 시퀀싱 라이브러리 준비 뒤에 방사성 절차. 종래의 클립에 있어서, cDNA 라이브러리는 양쪽 RNA 말단에서 결 찰 어댑터를 사용 하 여 제조 된다. 단백질 소화 후, 가교 된 짧은 폴 리 펩타이드는 RNA 단편에 부착 된 상태로 유지 됩니다. 이 가교 마크는 cdna 합성 동안 부분적으로 역방향 역전사 (rtase) 진행을 차단 하 여, cdna 라이브러리21,22의 약 80%를 나타내는 잘린 cdnas를 생성 한다. 따라서, 가교 결합 부위 (read)를 우회 하는 RTase에서 기인 하는 cDNA 단편만이 시퀀싱 된다. 최근에는 파 클립, iCLIP, eCLIP 및 uvCLAP와 같은 다양 한 클립 접근법이 살아있는 세포에서 RBPs의 크로스 링크 사이트를 식별 하는 데 사용 되었습니다. PAR 클립은 365 nm UV 방사선 및 광 활성화 가능한 뉴클레오티드 유사 체의 적용을 포함 하 고, 따라서 배양 살아있는 세포에 배타적 이며, 새로 합성 된 전사체에 뉴 클레 오 유사 체의 혼 입은 편견을 일으키기 쉽다 RNA가 물리적으로 단백질23,24와 상호 작용 하는 곳. ICLIP에서 단일 어댑터만이 가교 된 RNA 단편의 3 ' 말단에 결 찰 됩니다. 역 전사 (RT) 후에, 잘린 및 읽기-스루 cdnas는 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭25,26에의 한 인트라 내 순환 화 및 재 선형화에 의해 얻어진 다. 그러나, 분 자체 순환의 효율은 상대적으로 낮다. 구형 클립 프로토콜은 방사성 동위 원소, 자외선 가교 결합 및 친화성 정제 (uvCLAP)와 함께 가교 된 RNA의 라벨링이 필요 하지만, 엄격한 탠덤 친화성 정제 과정을 통해 방사능27에 의존 하지 않는다. 그럼에도 불구 하 고, uvCLAP는 탠덤 친화성 정제를 위해 3x FLAG-HBH 태그를 운반 하는 발현 벡터로 형질 감염 되어야 하는 배양 세포로 제한 된다.

ECLIP에서, 어댑터는 RT의 3 인치 말단에서 먼저, 그리고 분자 간 모드에서 cDNAs의 3 가지 말단에서 다음으로 결 찰 되었습니다. 따라서, eCLIP은 모든 절단 및 판독을 통해 cDNA (28)를 캡처할 수 있다. 또한, 단일 뉴클레오티드 분해능을 유지 하면서도, 방사성 라벨링에 국한 되지 않고, 그 원리에 기초한 세포 주를 사용 하지 않는다.

여기서는 마우스 고환에 적합 한 eCLIP 프로토콜에 대 한 단계별 설명을 제공 합니다. 간단히 말해서,이 eCLIP 프로토콜은 고환 세관의 UV 가교 결합으로 시작 하 여 단백질 특이 적 항 체를 사용 하는 부분적인 RNase 소화 및 면역 침전이 이어집니다. 다음으로, 단백질 결합 RNA는 dephosphorylated이 고, 어댑터는 3 ' 말단으로 결 찰 된다. 단백질 겔 전기 영동 및 겔-막 전달 후, RNA는 예상 된 크기 범위의 멤브레인 영역을 절단 하 여 분리 된다. RT 후, DNA 어댑터는 PCR 증폭에 이어서 cDNA의 3 ' 말단에 결 찰 된다. 높은 처리량 시퀀싱 전에 서브 클론의 스크리닝은 라이브러리 품질 관리로 취합니다. 이 프로토콜은 두 개의 고환 발현 RNA 헬 리 아 제 MOV10L1 및 MOV10에 의해 예시 되는 RBPs의 단백질 결합 RNA의 주요 종을 식별 하는 데 효율적입니다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 수행 동물 실험은 난징 의료 대학 위원회에 의해 승인 되었습니다. 수 컷 C57BL/6 마리의 마우스는 조절 된 광 기간 조건 하에서 유지 되었고, 음식과 물과 함께 공급 되었다.

1. 조직 수확 및 UV 가교 결합

  1. 성인 마우스 2 개를 1-2 분 동안 또는 호흡이 멈출 때까지 이산화탄소를 이용 하 여 안락사 시켰다. 다음, 각 마우스에 자 궁 경부 탈 구를 수행.
  2. 각각의 면역 침전 실험에 대 한 적절 한 연령 (본 연구에서 1 성인 고환)의 생쥐 로부터 고환의 약 100 mg을 수확 하 고,이 조직을 빙 냉 인산 완충 식 염 액 (PBS)에 배치 한다.
  3. 섬세 한 팁을 가진 핀셋을 사용 하 여 튜 니 카 알 부 니 아를 부드럽게 제거 하세요.
  4. 티슈 분쇄기에 3 mL의 얼음 차가운 PBS를 첨가 하 고 느슨한 유리 유 봉 (유리 유 봉)을 사용 하 여 온화한 기계적 힘으로 조직을 삼 출 합니다.
    참고: 이 단계의 목적은 세포를 lyse 하는 것이 아니라 조직을 분리 하는 것입니다. 세포 생존 력과 완전성의 보전이 중요 합니다.
  5. 조직 현 탁 액을 세포 배양 접시에 옮겨 넣고 (지름 10cm), 최대 6ml의 얼음 차가운 PBS를 추가 합니다.
  6. 접시를 빨리 흔들어 액체가 접시 바닥을 고르게 덮으 십시오. 조직이 제대로 지상에 있는 경우에, 균등 하 게 분산 된 수 관 세관은 보일 것입니다, 반면 조직 덩어리의 존재는 조직 분산이 최적이 아님을 나타냅니다.
  7. Ice에서 254 nm에서 400 mJ/cm2 로 현 탁 액을 세 번 교차 연결 합니다. 각 조사 사이에 서 스 펜 션을 섞는다.
    참고: 각각의 새로운 실험에 대해 가교를 최적화 해야 합니다.
  8. 4 ° c에서 5 분 동안 1200 x g 에서 15 mL 원뿔형 튜브 및 펠 릿에서 현 탁 액을 수집 한다. 상층 액을 제거 하 고, 펠 렛을 PBS 1 mL에 소생 시킨 다음, 현 탁 액을 1.5 mL 원심 분리기 튜브로 옮깁니다. 4°c 및 1000 x g 에서 2 분간 스핀 하 고 상층 액을 제거 한다.
  9. 이 시점에서, 즉시 프로토콜의 나머지 부분을 진행 하거나, 액체 질소로 펠 렛을 스냅 동결 하 고, 사용 될 때까지-80 ° c에서 저장 한다.

2. 구슬 준비

  1. 125 µ L의 단백질을 시료 당 자기 비드 (펠 렛)에 넣고 신선한 원심 분리기 튜브에 추가 합니다.
    참고: 마우스 항 체를 위한 단백질 G 마그네틱 비드를 사용 합니다.
  2. 용액에서 비드를 분리 하기 위해 자석에 튜브를 놓습니다. 10 초 후 상층 액을 제거 합니다. 구슬 2 개를 얼음-차가운 용 해 완충 액 1Ml 씩 두 번 씻으십시오.
    참고: 후속 단백질의 분리 자성 비드는이 단계를 따른다. 용 해 완충 제 조성 물은 50 mM 트리-HCl, pH 7.5; 100 mM 염화 나트륨; 1% NP-40; 0.1% SDS; 0.5% 나트륨 deoxycholate; 1/50 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)-프리 프로 테아 제 억제제 칵테일 (신선 하 게 추가).
  3. 10 µ g eCLIP 항 체를 가진 차가운 용 해 완충 액의 100 µ L에 있는 구슬의 소생. 45 분 동안 실 온에서 튜브를 돌립니다.
    참고: 면역 침전에 대 한 최종 항 체 농도는 10 µ 이다. 항 체 농도가 알려지지 않은 경우, 항 체의 양은 최적화 되어야 한다.
  4. 구슬 2 개를 얼음-차가운 용 해 완충 액 1Ml 씩 두 번 씻으십시오.

3. 조직 용 해 및 부분적인 RNA 소화

  1. 차가운 용 해 완충 액 1Ml의 소생 조직 펠 렛 (EDTA) 무 첨가 단백질 억제제 칵테일과 µ의 RNase 억제제의 11 µ L을 용 해 완충 액 1 mL에 추가 한다.
    1. 실험 군 당 2 개의 자외선 가교 펠 렛과 2 개의 비 가교 된 펠 렛을 소생: UV-가교 된 eCLIP 라이브러리 용 펠 렛 (UV-1); UV 가교-eCLIP 라이브러리에 대 한 2 개의 펠 릿 (UV-2); 대조 군으로 서 eCLIP 라이브러리를 위한 비 가교-1 펠 렛 (비 UV); IgG IP에 대 한 비 가교-2 개의 펠 렛은 항 체의 특이성을 입증 한다.
      참고: UV 가교 된 넓은 유형의 고환의 eCLIP 라이브러리에 대 한 이상적인 제어는 동일한 쓰레기의 쥐에서 UV 가교 된 녹아웃 고환의 것입니다.
  2. 단백질 및 RNA의 분해를 방지 하기 위해 15 분 동안 얼음에 샘플을 보관 하십시오.
  3. 디지털 초음파 발생기에서 10%의 진폭에서 30 초/30 초 off로 5 분 동안 초음파 처리 합니다. 샘플을 항상 얼음 위에 놓고 각 시료 사이에 뉴 클레 아 제가 없는 물로 프로브를 청소 하십시오.
  4. 각 튜브에 DNase의 4 µ L을 추가 하 고 잘 섞는다. 37 ° c에서 10 분 동안 배양 하 여 1200 rpm으로 흔들어 준다.
  5. 희석 된 RNase I (PBS에 4U/µ L RNase I)의 10 µ L을 추가 하 고 잘 섞는다. 37 ° c에서 5 분 동안 배양 하 여 1200 rpm으로 흔들어 준다.
  6. 15000 x g 에서 4 ° c에서 20 분간 원심 분리 하 여 파쇄 물을 지웁니다.
  7. 상 등 액을 조심 스럽게 모으십시오. 50 µ L의 용 해물을 남겨 두고 펠 렛을 버리십시오.
  8. 입력 샘플을 Rwb (웨스턴 블랏을 위해 실행) 및 RWB (RNA 격리를 위해 실행)로 저장 합니다. 저장 20 µ (2%) uv-1, uv 2, 비 UV 및 IgG 샘플의 RWB 겔 로딩에 대 한 입력으로. 저장 20 µ (2%) RRI 겔 로딩을 위한 입력으로 서의 UV-1 또는 UV-2 샘플.

4. 면역 침전

  1. 상기 파쇄 물 (3.7 단계부터)을 비드에 1 mL 첨가 하 여 2 시간 또는 하룻밤 동안 4°c에서 샘플을 회전 시켰다.
  2. 마그네틱 스탠드를 사용 하 여 구슬을 수집 하 고 상층 액을 버립니다. 900 µ l의 고 염 완충 액 (50 mM 트리 스-HCl을 사용 하 여 구슬 두 번 세척 ph 7.5; 1%의 염화 나트륨; 1% NP-40; 0.1% deoxycholate 나트륨)을 사용 하 여 구슬 2 개를 세척 완충 액의 µ l로 세척 하 고 0.5, 10mmmgcl 2; 900% 트윈-20).
    참고: IgG 샘플의 경우 여기에서 절차를 일시 중지 하 고 얼음 위에 세척 완충 액에 보관 하십시오.
  3. 500 µ L의 1 배의 탈 인 산화 완충 액 (10mm 트리 스-HCl, pH 7.5, 5Mmmgcl2; 100 mm KCl; 0.02% 트리톤 X-100).

5. RNA 3 ' 말단의 탈 인 산화

  1. 마그네틱 스탠드를 사용 하 여 구슬을 수집 하 고 상층 액을 버립니다. 미세한 파이 펫 팁을 사용 하 여 잔류 액체를 제거 합니다. 추가 100 µ L의 탈 인 산화 마스터 믹스 (10 µ L의 탈 인 산화 완충 액 [100 mM 트리 스-HCl, pH 8.0; 50. 1 mg의 보 소 혈 청 알 부 민; 1 밀리 그램/m l. 뉴 클레 아 제 무 첨가 물; µ의 µ l의 rnase ase 억제제; 2 µ 78의 l 0.2 칼 린 인산 가수분해 효소)를 각각의 샘플에, 37 ° c에서 15 분 동안 배양 하 고, 1200 rpm에서 흔들어 준다.
  2. 추가 300 µ L 폴 리 뉴클레오티드 키나 제 (PNK) 마스터 믹스 (60 µ L의 PNK pH 6.5 완충 액 [350 mM 트리 스-HCl, pH 6.5; 50);; 223 µ l의 뉴 클레 아 제 불포함 물; 5 µ l rnase 억제제; pnk 효소의 7 µ l; 각 시료에 대해 3 µ l의 0.1 M 디 티 오 스 톨) 1200 rpm에서 37 ° c에서 20 분 동안 배양 합니다.
  3. 마그네틱 스탠드를 사용 하 여 구슬을 수집 하 고 상층 액을 버립니다. 500 µ L의 차가운 워시 버퍼를 사용 하 여 구슬을 한 번 씻으십시오. 그런 다음 차가운 고 염 완충 액의 500 µ L로 한 번 구슬을 씻으십시오. 이 순서 대로 한 번 더이 세척을 반복 합니다.
  4. 차가운 세척 완충 액의 500 µ l을 한 번 세척 하 고, 300 µ의 차가운 1 배 결 찰 7.5 50 완충 액으로 2 번 씻는 다. 10 mm mgcl 2).

6. rna 어댑터는 RNA 3 ' 끝에 결 찰

  1. 상층 액을 버리고 미세한 파이 펫 팁으로 잔류 액체를 제거 하십시오. 각 샘플에 3 ' 결 찰 마스터 믹스 25 µ L을 추가 합니다. 파이 펫 팅으로 조심 스럽게 섞으 세요. 이 단계는 기포를 생성 하는 경향이 있다.
    참고: 결 찰 마스터 믹스는 10 배 결 찰 완충 액의 3 µ L를 포함 합니다 [500 mM 트리 스-HCl, pH 7.5; 100 mM MgCl2]; 9 µ L 뉴 클레 아 제 무-물; RNase 억제제의 0.4 µ L; 0.3 µ L 0.1 M ATP; 디 메 틸 설 폭 사이드의 0.8 µ L; 50% 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) 8000의 9 µ L; 2.5 µ l의 RNA 리가 제 [30u/µ l].
  2. 추가 2.5 µ L의 RNA 어댑터 X1A (표 1) 및 2.5 µ l의 RNA 어댑터 X1B (표 1) 각 샘플에. 피 펫 팅 또는 25 ° c에서 75 분 동안 배양 하 여 신중 하 게 혼합 하 고 10 분 마다 섞어 쓸으 십시오.
  3. 500 µ L의 콜드 워시 완충 액으로 한 번 비드를 씻으 세요 (여기에서 IgG 샘플을 재개 하십시오).
  4. 500 µ L의 차가운 고 염 완충 액으로 한 번 비드를 씻고 500 µ L 콜드 워시 버퍼를 사용 하십시오. 이 세척을 한 번 더 반복 하십시오.
  5. 비드를 자기적으로 분리 하 고 미세한 파이 펫 팁으로 잔류 액체를 제거 합니다.
  6. 콜드 워시 완충 액의 100 µ L에 구슬을 소생 (여기에 IgG 샘플을 일시 중지 하 고 세척 버퍼에 얼음에 저장). RWB 샘플로 20 µ L을 새 튜브로 옮깁니다. 나머지 80 µ L을 RRI 샘플로 자기적으로 분리 합니다. RRI 샘플의 상층 액을 제거 하 고 세척 완충 액의 20 µ L에서 비드를 소생 시킵니다.
  7. 37.5 µ L의 4 배 리튬도 데 실 황산 염 (LDS) 샘플 완충 액 및 15 µ L의 10 배 시료 감소 제를 IgG 시료에 추가 합니다. 7.5 µ L의 LDS 샘플 버퍼 4 개를 추가 하 고 (나머지) 샘플에 3 µ L의 10 배 샘플을 줄입니다. (파이 펫 팅으로 혼합 하지 마십시오). 70 ° c에서 10 분 동안 배양 하 여 1200 rpm으로 흔들어 준다. 얼음을 1 분간 식힌 후 4°c에서 1 분 동안 1000 x g 에서 원심 분리 합니다.

7. SDS 페이지 및 멤브레인 전송

  1. 젤을 로드 합니다.
    1. RRI 젤 (4-12% 비스 트리 스 프로 틴 젤, 10 웰, 1.5 mm) 용 출 액에서 튜브를 자석에 놓고 분리 된 단백질을 구슬에서 넣습니다. 웰 당 샘플 30 µ L을 로드 합니다. 샘플은 미리 염색 된 단백질 크기 마커로 이격 되어 있습니다.
    2. RWB 젤 (4-12% Bis-트리 스 프로 틴 젤, 10well 1.5 mm)에 튜브를 자석에 놓고 분리 된 단백질을 구슬에서 용 출 액. 웰 당 샘플 15 µ L을 로드 합니다. 나머지 샘플을-20°c에서 백업으로 저장 합니다.
  2. 500 µ L의 항 산화 제를 500 mL의 1x SDS 실행 버퍼에 추가 하십시오. 50 분 동안 또는 염료 전면이 하단에 있을 때까지 1x SDS 실행 버퍼에서 200 V에서 실행 하십시오.
    참고: 산화 방지 제에는 N, Dimethylformamide, 아 황산 수소 나트륨이 포함 되어 있으며,이는 감소 된 단백질로 마이그레이션하여 메티오닌 및 트립토판과 같은 민감한 아미노산의 재 산화를 예방 합니다.
  3. 겔에서 니트로 멤브레인으로 10% 메탄올에서 70 분의 단백질 RNA 복합체를 10v/min의 1xtransfer 버퍼로 전달 합니다. RRI 멤브레인을 차가운 PBS에 헹 구 고 플라스틱 랩으로 싸서-80 ° c로 보관 하십시오.
  4. RWB 멤브레인을 1 시간 동안 실 온에서 TBST의 5% 우유로 차단 하십시오. TBST에서 멤브레인을 헹 구 십시오. 4 ° c 하룻밤 동안 TBST에서 일차 항 체와 함께 배양 합니다. Tbst로 5 분간 2 회 세척 하 고, 상 온에서 1 시간 동안 2 차 항 체 (1:5000 HRP 염소 반 토끼 IgG)를 사용 하 여 5 분간 TBST로 3 회 세척 합니다.
  5. 동일한 부피의 전기 발광 (ECL) 버퍼 A와 버퍼 B를 혼합 하 여 멤브레인에 추가 하 고 1 분간 배양 합니다. 플라스틱 랩으로 멤브레인을 덮고 2-3 분 동안 실 온에서 X 선 필름에 노출 시킵니다. 그런 다음 필름을 개발 합니다.
    참고: 과다 노출을 가진 필름은 막이 RWB 막에 다시 정렬 될 수 있는 멤브레인의 가장자리의 모양을 명확 하 게 보여줍니다. 그런 다음 내부 마커의 위치를 기준으로 RWB 및 RWB 멤브레인을 정렬 합니다. 바닥에서 상부로 순차적으로 층은 필름, RWB 멤브레인 및 RWB 멤브레인을 순차적으로 계층화 한다.

8. RNA 분리

  1. 단백질 밴드에서 75 kDa (RNA의 약 220 nt)의 영역을 가이드로 서 RWB 멤브레인과 필름을 사용 하 여 절단 한다.
    참고: 단백질 보호 RNA 분자는 225 염기의 최대 길이를 가질 수 있는 것으로 서, 염기 당 약 340 Da와 함께, 모든 단백질 RNA 복합체를 회수 하기 위해 RBP 밴드 이상의 75 kDa에 대 한 영역을 절단 하는 것이 합리적 이다.
  2. 멤브레인을 적 출하 여 몇 개의 작은 조각으로 자른 후 신선한 1.5 mL 원심 분리기 튜브에 넣습니다. 추가 200 µ l의 프로 테이 나 제 K (pk) 완충 액 (100 mm 트리 스-HCl pH 7.5, 50 mm 염화 나트륨 10mmedta 40)을 첨가 하 여 멤브레인 조각에 µ. 37 ° c에서 20 분 동안 혼합 하 고 배양 하 여 1200 rpm에서 흔들어 줍니다.
  3. 각 시료에 200 µ l의 PK 우 50 7.4 레 아 완충 액 (100 mm)을 추가 합니다. 37 ° c에서 20 분 동안 배양 하 여 1200 rpm으로 흔들어 준다.
  4. 400 µ L의 페 놀/클로로 포 름/isoamyl 알콜 (25:24:1)을 첨가 하 고 37 ° c에서 5 분 동안 잘 섞어 1200 rpm에서 흔들어 줍니다.
  5. 원심 분리기에 2 mL 상 락 젤 (PLG)을 넣고 25 초 동안 15000 x g 에서 회전 시킵니다.
  6. 멤브레인 슬라이스를 제외한 모든 내용물을 PLG 무거운 튜브로 전송 합니다. 37 ° c에서 5 분 동안 배양 하 여 1200 rpm으로 흔들어 준다.
  7. 실 온에서 스핀을 하 고 15 분 동안 15000 x g 의 새 15 mL 원추형 튜브로 수성 층을 전달 합니다.
  8. Rna 정제 및 농축 컬럼을 사용 하 여 RNA를 추출 합니다.
    1. 각 샘플 (8.7 단계에서)에 RNA 결합 버퍼의 2 개의 볼륨 (800 µ L)을 추가 하 고 섞는다. 100% 에탄올과 혼합의 동등한 부피 (1200 µ L)를 추가 합니다.
    2. 750 µ L 샘플 (단계 8.8.1에서)을 수집 튜브에 있는 RNA 정제 및 농축 칼럼에 전달 하 고 30 초 동안 15000 x g 에서 원심 분리기를 통과 시켰다.
    3. 모든 샘플이 열을 통과할 때까지 8.8.2 단계를 반복 합니다. 추가 400 µ L에 RNA 준비 버퍼를 열 및 원심 분리기에서 30 초 동안 15000 x g . 플로우 스루를 버리고, rna 세척 완충 액의 700 µ l를 바르고 30 초 동안 15000 x g 에서 컬럼을 원심 분리 하십시오. 흐름을 취소 합니다.
    4. 400 µ L을 추가 하 고 2 분 동안 원심 분리기를 15000 x g 에서 열을 세척 합니다. 열을 조심 스럽게 새 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. 열 매트릭스에 뉴 클레 아 제 없는 물 10 µ L을 추가 하 고 2 분간 방치 한 후 30 초 동안 15000 x g 에서 원심 분리기를 사용 하십시오. RT (단계 11.1)까지-80 ° c에서 eclip 샘플을 저장 하십시오.

9. 입력 RNA 3 ' 말단의 탈 인 산화

  1. 추가 15 µ L의 탈 인 산화 마스터 믹스 (2.5 µ L의 10 배 인 산화 버퍼 [100 mM 트리 스-HCl, pH 8.0; 50 mM MgCl2; 1m KCl; 0.2% 트리톤 X-100; 9.5 µ l-뉴 클레 아 제 무 함유 물; RNase 억제제의 0.5 µ l) 내지 10 µ l의 입력 샘플 (단계 8.8.4에서). 37 ° c에서 15 분 동안 1200 rpm으로 흔들어 배양 합니다.
  2. Pnk 마스터 믹스 75 µ l 추가 (20 µ l/5 pnk PH 6.5 버퍼 [350 mM 트리 스-HCl, PH 6.5; 50); 44 µ l의 뉴 클레 아 제 불포함 물; 1 µ l의 rnase 억제제; pnk 효소의 2 µ l;의 7µ l을 샘플에. 0.1 37 ° c에서 20 분 동안 배양 하 여 1200 rpm으로 흔들어 준다.
  3. 입력 RNA의 정리
    1. 인공 thenucleic 산을 추출 하는 인공 바이 알 (소용돌이 30 초 이상). 새로운 튜브에 각 샘플에 대 한 핵 산 추출 자기 비드의 20 µ L을 추가 합니다. 마그네틱 스탠드를 사용 하 여 구슬을 수집 하 고 상층 액을 버립니다.
    2. 1 mL의 RNA 정제 용 해 완충 액 (RLT 완충 액)을 한 번에 비드를 씻으십시오. 30 초 동안 자석에 튜브를 놓고 상층 액을 버립니다.
      참고: 이후 핵 산 추출 자성 비드의 분리는이 단계를 따랐습니다.
    3. 300 µ L의 RLT 버퍼를 사용 하 여 구슬을 소생 하 고 샘플에 추가 합니다. Μ의 5m 염화 나트륨 및 615 µ L의 100% 에틸 알콜을 추가 하 고 피 펫 팅 하 여 혼합 합니다. 실 온에서 15 분간 회전 시켜 서 비드를 자기적으로 분리 하 고 상층 액을 제거 합니다.
    4. 75%에 토에의 한 1 mL의 구슬을 소생 하 고 새로운 튜브로 이송 한다. 30 초 후, 마그네틱 스탠드를 사용 하 여 비드를 수집 하 고 상층 액을 버립니다. 에 토 h 75%로 두 번 세척 하 고, 구슬을 자기 분리 하 고, 잔류 액체를 미세한 파이 펫 팁으로 버리십시오. 5 분 동안 공기 건조 (과도 한 건조를 피하십시오).
    5. 뉴 클레 아 제 없는 물 10 µ L로 비드를 소생 하 고 5 분간 자기 분리 된 비드를 배양 하 고, 상층 액의 5 µ L을 새로운 튜브 (아래 3 ' 어댑터 결 찰)로 이동 한다. 나머지 RNA는-80 ° c에서 백업으로 저장 될 수 있다.

10. rna 어댑터는 입력 RNA 3 ' 끝에 결 찰

  1. RiL19 어댑터의 DMSO 및 0.5 µ L의 1.5 µ L을 추가하 고 (단계 9.3.5에서) 입력 RNA의 5 µ l을 65 ° c에서 2 분 동안 배양 하 고 얼음 위에 1 분 이상 둡니다. 각 샘플에 3 ' 결 찰 마스터 믹스의 13.5 µ l 추가 , 피 펫 팅으로 혼합 하 고, 25 ° c에서 75 분 동안 배양 하 고, 15 분 마다 섞으 세요.
    참고: 결 찰 마스터 믹스에는 10 배 결 찰 완충 액의 2 µ L이 포함 되어 있습니다 [500 mM의 트리 스-HCl, pH 7.5; 100 Mm mgcl; 1.5 µ L 뉴 클레 아 제 무-물; RNase 억제제의 0.2 µ L; 0.2 µ L 0.1 M ATP; DMSO 0.3 µ L; 8 µ L의 50% PEG8000; 1.3 µ l의 RNA 리가 제 [30u/µ l].
  2. 결 찰 된 입력 RNA의 정리
    1. 각각의 시료에 대해 자기 비드의 핵 산 추출 20 µ L을 자기적으로 분리 하 고 상층 액을 제거 한다. 1 mL RLT 완충 액으로 한 번 비드를 씻으십시오.
    2. 61.6 µ L의 RLT 완충 액 및 각 시료에 대 한 전사 서 스 펜 션의 소생 비드. 추가 61.6 µ L 100%에 토. 피 펫을 사용 하 여 5 분 마다 15 분 동안 섞어 줍니다. 자기 분리 된 구슬 및 상층 액을 제거 합니다.
    3. 9.3.4 단계를 반복 합니다.
    4. 뉴 클레 아 제 없는 물 10 µ를 갖는 비드를 소생 하 고 5 분간 그대로 둡니다. 상기 비드를 자기적으로 분리 하 고 상층 액의 10 µ L을 새로운 튜브에 전달 한다.
      참고: 이것은 가능한 정지 지점 (입력 샘플은 다음 날까지-80 ° c에서 저장 될 수 있다).

11. 역 전사, DNA 어댑터 cDNA 3 ' 끝에 결 찰

  1. 0.5 µ L의 RT 프라이 머 (표 1) 내지 10µ의 입력 rna (단계 10.2.4에서) 및 10µ l의 클립 rna (스텝 8.8.4에서)를 각각 2 분 동안 65 ° c에서 예비가 열 된 PCR 블록으로 배양 하 여 1 분 이상 얼음 위에 놓습니다.
  2. Rt 마스터 믹스 10 µ L 추가 (2 µ L의 RT 버퍼 [500 mM 트리 스-HCl, pH 8.3; 750 mM KCl; 4 µ의 뉴클레 아 제 불포함 물;의 RNase 억제제의 0.3 µ l; 0.2 µ l의 0.1 m datp; 0.2 µ l of 0.1 µ의 0.1 lltp; 0.1 M dGTP; 0.2 µ L의 0.1 M dTTP; 0.9 µ L의 역방향 역전사)을 각 시료에 혼합 하 고, 55 ° c에서 미리가 열 된 PCR 블록에 45 분 동안 배양 한다.
  3. 3.5 µ L의 PCR 산물 정화 시 약을 사용 하 여 RT 반응 생성 물의 20 µ L을 섞어 줍니다. 37 ° c에서 15 분 동안 배양 합니다.
  4. 0.5 M EDTA의 1 µ L을 추가 하 고 파이 펫 팅으로 섞어 줍니다. PCR 블록에서 70 ° c에서 3 µ 리터의 NaOH를 첨가 하 고, 피 펫 팅 하 고 12 분 동안 배양 하 여 상기 템플릿 RNA를 가수분해 한다.
  5. 1m HCl의 3 µ L을 추가 하 고 피 펫-믹스를 통해 완충 액을 중화 시킵니다.
  6. CDNA의 정화
    1. 자기적으로 분리 된 10 µ L의 핵 산 추출 마그네틱 비드는 각 시료에 대해, 상층 액을 제거 한다. RLT 완충 액 500 µ L로 한 번 씻으십시오.
    2. RLT 완충 액의 93 µ L 및 샘플로의 이동 현 탁 액에서의 소생 비드. 111.6 µ L의 100%에 토를 추가 하 고 5 분간 배양 한 후 2 분 마다 파이 펫을 혼합 합니다. 마그네틱 스탠드를 사용 하 여 비드를 수집 하 고 상층 액을 버립니다. 80%의에 토를 1 mL의 구슬을 소생 하 고 새로운 튜브로 이동 합니다.
    3. 30 초 후, 마그네틱 스탠드를 사용 하 여 비드를 수집 하 고 상층 액을 버립니다. 에 토에 80%로 두 번 씻으십시오. 자석으로 분리 하 고 미세한 팁으로 잔류 액체를 버리십시오. 5 분 동안 공기 건조 (과도 한 건조를 피하십시오). 5 µ의 5 mM 트리 스-HCl에서 비드를 소생 하 고 5 분간 배양 하였다.
  7. 0.8 µ L의 DNA 어댑터 (표 1) 및 DMSO 1 µ을 비드에 넣고 75 ° c에서 2 분 동안 배양 한다. 1 분 이상 얼음 위에 놓습니다.
  8. 준비 12.8 µ l 결 찰 마스터 믹스 (2 µ l의 10 배 결 찰 완충 액 [500 mM 트리 스-HCl; 100); 1.1 µ의 뉴 클레 아 제-무료 물; 0.2 µ l의 0.1의 µ; 50 µ l의 RNA 리가 제 [30u/µ l]) (PEG8000 , 가볍게 섞어, 원심 분리기에서 짧게 회전 하 고, 각 샘플에 추가 하 고, 파이 펫 팁으로 샘플을 천천히 저 어 줍니다.
  9. 각 샘플에 RNA 리가 제 [30u/µ l]의 또 다른 1 µ l을 추가 하 고 섞어 주세요. 25 ° c에서 30 초 동안 1200 rpm으로 흔들어 배양 합니다. 밤새 25°c에서 배양 합니다. 1 시간에 한 번씩 5 ~ 6 회 가볍게 섞어 줍니다.
  10. 결 찰 cDNA의 클린업
    1. 자기적으로 분리 된 5 µ L의 핵 산을 각 시료에 대해 자성 비드를 추출 하 고 상층 액을 제거 한다.
    2. 500 µ L RLT 버퍼로 한 번 씻으십시오.
    3. RLT 완충 액에 60 µ L의 구슬 및 각 시료에 현 탁 액을 전달 합니다. 100%에 토에 60 µ L을 추가 하 고, 5 분 동안이를 배양 하 고 2 분 간격으로 파이 펫을 혼합 합니다. 자석으로 분리 하 여 상층 액을 버리십시오.
    4. 9.3.4 단계를 반복 합니다.
    5. 트리 스-HCl의 27µ L의 소생 비드를 5 분간 배양 하 여 25 µ 리터의 시료를 새로운 튜브로 이동 시킵니다. 새로운 튜브에 뉴 클레 아 제 없는 물 9 µ L와 함께 결 찰 cDNA의 1 µ L을 희석 한다. 13.1 단계까지-20°c에서 나머지 샘플을 저장 한다.

12. 실시간 정량 PCR에의 한 cDNA의 정량화 (qPCR)

  1. 9 µ L의 qPCR 마스터 믹스 (5 µ L)를 추가 하십시오; 3.6 µ L 뉴 클레 아 제 무 첨가 물; 프라이 머 믹스의 0.4 µ L은 96 웰 qPCR 플레이트에 [10µ M PCR-D50X 및 10µ M PCR-D70X]). 11.10.5 단계에서 µ의 희석 된 1:10의 1리터를 첨가 하 여 밀봉 하 고 섞어 줍니다.
  2. 써 모 사이 더에서 qPCR 프로그램 실행: 50 ° c에서 2 분; 95 ° c에서 2 분; 95 ° c에서 3 초 후 40 사이클 동안 68 ° c에서 30 초; 95 ° c에서 15 초 후 68 ° c에서 60 초 후 1 사이클 동안 95 ° c에서 15 초. Ct (주기 임계값) 값을 기록해 둡니다.

13. cDNA의 PCR 증폭

  1. 35 µ의 PCR 마스터 믹스의 분배 (25 µ L; 5 µ의 뉴 클레 아 제 불포함 물; 프라이 머 믹스 5µ L [20 µ M PCR-D50X 및 20µ M PCR-D70X]) 8 웰 스트립에. 클립 그룹의 경우 12.5 µ L의 클립 샘플 + 2.5 µ L을 추가 합니다. 입력 그룹의 경우 입력 10 µ L + 5 µ L을 잘 섞어 원심분리기에서 짧게 회전 시킵니다.
  2. PCR 프로그램 실행: 98 ° c에서 30 초; 98 ° c에서 15 초 후 68 ° c에서 30 초 후에 72 ° c에서 6 사이클 동안 40 s; 98 ° c에서 15 초 뒤에 60의 N 싸이 클에 대해 72 ° c에서 = (qPCR Ct 값-3); 60의 72 ° c; 4°c 홀드.
    참고: 첫 번째 클립 몇 개에 대해 1 ~ 2 개의 추가 PCR 주기를 수행 하는 것이 좋습니다.

14. 젤 정제

  1. 3% 고 분해능 아가 로스 젤에 샘플을 적재 합니다. 샘플 사이에 1 개의 빈을 잘 남겨두고 젤 양쪽에 사다리를 사용 합니다. 스 트리-붕 산 염-EDTA (TBE) 완충 액에서 75 분 동안 100 V에서 실행 하십시오.
  2. 청색 광 조명에서 각 시료에 대해 신선한 면도날을 사용 하 여 젤 슬라이스 175-350 bp를 잘라 냅니다. 15 mL의 원뿔형 튜브에 넣습니다.
    1. 젤 슬라이스를 계량 하 고 겔 추출 키트를 사용 하 여 젤을 용 출 합니다.
    2. 겔 용 해 완충 액의 6 배 부피를 추가 하 여 겔을 녹여 냅니다 (100 겔 = 600 µ 젤 용 해 완충 액). 실 온에서 젤을 녹 이세요. (젤 조각이 완전히 녹을 때까지 15 분 마다 섞어 흔들어 주세요). 1 젤 부피 100%의이 소 프로 판 올을 넣고 잘 섞어 줍니다.
    3. 750 µ L 샘플 (스텝 14.2.2에서)을 수집 튜브의 칼럼에 17900 x g 에서 1 분간 원심 분리 하 여 통과 시킵니다.
    4. 모든 샘플이 컬럼을 통과 할 때까지 14.2.3 단계를 반복 하 고 젤 용 해 완충 액을 500 µ L로 한 번 씻으십시오.
    5. 750 µ L의 세척 완충 액 (젤 추출 키트에서)을 칼럼에 추가 하 고 17900 x g 에서 1 분간 원심 분리기를 제거 합니다. 플로우 스루를 버리고 2 분 동안 17900 x g 에서 스핀 하십시오. 열을 새 1.5 mL 튜브에 놓습니다.
    6. 열의 플라스틱 보라색 테두리에서 남아 있는 세척 버퍼를 모두 제거 합니다. 공기 건조 2 분 동안 멤브레인의 중앙에 뉴 클레 아 제 없는 물 12.5 µ L을 추가 합니다. 칼럼을 실 온에서 2 분 동안 방치 하 고 1 분 동안 17900 x g 에서 회전 시킨다 (향상 된 수율을 위해, 용 출 단계를 반복 한다).

15. PCR 산물의 토 포 클론

  1. 상기 14.2.6 단계 로부터 PCR 산물 1 µ l을 생성 하는 토 포 클로닝 반응 믹스 1 µ L. 멸 균 수 3 µ L). 20-37 ° c에서 5 분간 부드럽게 섞은 후 배양 하십시오. 얼음 위에서 식혀 보세요.
  2. 얼음에 화학적으로 유능한 대장균 박테리아를 해 동. 추가 5 µ L에 토 포 클로닝 제품의 유능한 박테리아의 100 µ L29. 부드럽게 잘 섞어 주세요. 30 분간 얼음을 배양 합니다.
  3. 42 ° c에서 60의 열 충격. 그런 다음 얼음을 2 분간 식힙니다. 900 µ L을 추가 하 고, 37 ° c에서 1 시간 동안 배양 하 여 225 rpm으로 흔들어 준다. 1000 x g 에서 1 분간 스핀 한 다음 상층 액의 900 µ l을 제거 합니다. 나머지 솔루션을 소생 합니다.
  4. 형질 전환 된 세균을 앰 피 실린 (100 µ)를 함유 하는 1.5% LB 아가 플레이트 상에 플레이트 하 고, 37 ° c에서 밤새 배양 한다.
  5. 각 구성에 대해 적어도 20 1.5 mL 원심 분리기 튜브를 준비 하십시오. 100 µ g/mL 암 피 실린을 함유한 500 µ L의 LB 배지로 1 세트를 채웁니다. 멸 균 피 펫 팁을 사용 하 여 1 개의 세균 식민지를 무작위로 긁어 내 고 LB µ의 500에 따라 (파이 펫 팅으로) 혼합 하십시오. 37 ° c에서 5 시간 동안, 225 rpm으로 흔들어 배양 한다.
  6. M13 역 프라이 머를 이용 하 여 인서트 단편을 서 열 하 고, 생거 염기 서 열 분석 법으로30.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

상기 eclip 절차 및 결과는도 1,도 2,도 3에 도시 되어 있다. 마우스는 외과 용가 위를 이용 하 여 하복 부에 제조 하였으며 작은 절 개를 이산화탄소로 안락사 시켰다 (도 2a,B). 마우스 고환 제거, 디 툰 후 연 삭 후 UV 가교 (그림 2c-I). 고환 조직에서 두 개의 알려진 RNA 결합 헬 리 아...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

생물학적 및 병리학 적 맥락에서 rbps의 보편적 역할에 대 한 이해가 증가 함에 따라, 클립 방법은 rbps20,32,33의 분자 기능을 공개 하는 데 널리 활용 되 고 있습니다. 34,35. 여기에 설명 된 프로토콜은 마우스 고환에 대 한 eCLIP 방법의 적응 된 응용 프로그램을 나타냅니다.

고환에서 eCLIP을 수행 하는 한 가지 과제는 신선한 고환 세포의 생존 성과 무결성을 유지 하는 것 이며,이는 효과적인 가교 결합에도 중요 합니다. 느슨한 유 봉을 사용 하 여 온화한 기계적인 힘으로 고환을 깎는 것은 세포 용 해32,

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 원래 프로토콜에 도움이 되는 지침에 대 한 에릭 L 밴 Nostrand과 유전자 W 감사 합니다. K.Z.는 중국의 국가 키 R & D 프로그램 (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) 및 중국의 국가 자연 과학 재단 (31771653)에 의해 지원 되었다. L.Y.는 중국의 국립 자연과학 재단 (81471502, 31871503)과 강 소 지방의 혁신적이 고 기업가 프로그램에 의해 지원 되었다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Antibodies
Anti-mouse MOV10  항체Proteintech, China10370-1-AP
Anti-mouse MOV10L1 antibodyZheng et al.20109polyclonal antisera UP2175provided by P. Jeremy Wang lab, University of Pennsylvania
HRP Goat Anti-Rabbit IgG ABclonalAS014
Rabbit IgGBeyotime, 중국A7016
장비
원심 분리기Eppendorf, 함부르크, 독일5242R
디지털 sonifierBRANSON, 미국BBV12081048A450 와트; 50/60 Hz
DynaMag-2 자석Invitrogen, 미국12321D
미니 블롯 모듈Invitrogen,USAB1000
미니 젤 탱크Invitrogen,USAA25977
쉐이킹 인큐베이터Eppendorf, 함부르크, 독일Thermomixer 편안함 
티슈 그라인더, DouncePYREX, USA1234F35전용  "느슨한" 페슬은 이 프로토콜에서 사용됩니다
TProfessional standard 96 GradientBiometra, 독일일련 번호: 2604323
Tube Revolver 크리스탈, 미국일련 번호: 3406051
UV-light cross-linkerUVP, USACL-1000
Materials
TC-treated Culture DishCorning, USA430167100 mm 
튜브Corning, USA43079115 mL
마이크로튜브 튜브AXYGEN, USAMCT-150-C1.5 mL 
<강력한>시약 
산성 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올 Solarbio, 중국P101125:24:01
AffinityScript EnzymeAgilent, 미국600107
AntioxidantInvitrogen, 미국NP0005
DH5α 유능한 박테리아Thermo Scientific, 미국18265017이러한 경제적 인 세포는 >1 x 106< / sup> 형질전환 체를 수득합니다./µ g 50 µ 당 DNA를 통제하십시오; L 반응.
DMSOSigma-Aldrich, 미국D8418
DNA LadderInvitrogen, 미국10416014
dNTPSigma-Aldrich, 미국DNTP100-1KT
Dynabeads Protein A Invitrogen, 미국10002D
ECL 시약Vazyme, 중국E411-04
EDTAInvitrogen, 미국AM9260G
EDTA 무료 프로테아제 억제제 칵테일Roche, 미국04693132001신선한
Exo-SAP-ITAffymetrix, 미국78201PCR 제품 클린업 시약 
FastAP 효소Thermo Scientific, USAEF0652
LDS 샘플 버퍼Thermo Scientific, USANP0007
MetaPhor Agarose lonza, 스위스50180
MgCl2Invitrogen, 미국AM9530G
MiniElute 겔 추출QIAGEN, 독일28604컬럼 4 μm에서 저장; 버퍼 QG=겔 용해 버퍼; 버퍼 PE= 세척 버퍼(14단계용)
MyONE 실란 비드Thermo Scientific, 미국37002D핵산 추출 마그네틱 비드
NaClInvitrogen, 미국AM9759
 
NP-40Amresco, 미국M158-500ML
NuPAGE Bis-Tris 단백질 젤Invitrogen, 미국NP0336BOX4%– 12%,1.5mm, 15웰
NuPAGE MOPS SDS 버퍼 키트 Invitrogen, 미국NP0050
PBSGibco, 미국10010023
위상 잠금 젤 (PLG) 무거운 튜브   TIANGEN, 중국WM5-2302831
PowerUp SYBR Green Master MixApplied Biosystems, USAA25742
Proteinase KNEB, New England P8107S
Q5 PCR 마스터 믹스 NEB, 뉴잉글랜드 M0492L
RLT 버퍼QIAGEN, 독일79216RNA 정제 용해 버퍼 
RNA 클린 & 집중 장치-5 열 ZYMO RESEARCH, USAR1016RNA 정제 및 농도 컬럼
RNase I Invitrogen, 미국AM2295
RNase 억제제Promega, 미국N251B
RQ1 DNasePromega, 미국M610A
샘플 환원제Invitrogen, 미국NP0009
SDS 솔루션Invitrogen, 미국1555302710%
Sodium deoxycholateSigma-Aldrich, USA30970보호 가벼운
T4 PNK 효소NEB, 뉴잉글랜드 M0201L
T4 RNA 리가제 1 고농도NEB, 뉴잉글랜드 M0437M
TA/Blunt-Zero 클로닝 믹스Vazyme, 중국C601-01
TBEInvitrogen, USAAM9863
Tris-HCI BufferInvitrogen, 미국15567027
Triton X-100Sangon Biotech, 중국A600198 
Tween-20Sangon Biotech, 중국A600560
Urea Sigma-Aldrich, 미국U5378
X-ray FilmsCaresteam, 캐나다6535876
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References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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