RNA 중합효소와의 전사 인자 (TFs)의 상호 작용은 일반적으로 풀다운 검정을 사용하여 연구됩니다. 우리는 클라미다이얼 RNA 폴리머라제와 GrgA의 상호 작용을 특성화하기 위해 생체층 간섭측정기(BLI) 기술을 적용합니다. 풀다운 분석과 비교하여 BLI는 실시간 연결 및 해리를 감지하고 더 높은 감도를 제공하며 정량적입니다.
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이 논문에서
요약
초록
전사 인자 (TF)는 RNA 폴리머라제, 다른 TF 및 / 또는 템플릿 DNA와 상호 작용하여 유전자 발현을 조절하는 단백질입니다. GrgA는 의무적인 세포내 세균성 병원체 클라미디아에서 특별히 발견되는 새로운 전사 활성제이다. 친화성 구슬을 이용한 단백질 풀다운 분석제는 GrgA가 발달 단계에서 제품이 차별화적으로 요구되는 유전자에 대한 프로모터의 다른 세트를 인식하는 두 가지 σ 인자, 즉 σ66 및 σ28을결합한다는 것을 밝혀냈습니다. 우리는 BLI를 사용하여 상호 작용을 확인하고 더 특성화했습니다. BLI는 풀다운에 비해 몇 가지 장점을 보여줍니다: 1) 결합 파트너 간의 실시간 연관 및 해리를 드러내고, 2) 정량적 운동 파라미터를 생성하고, 3) 풀다운 분석이 종종 검출하지 못하는 바인딩을 검출할 수 있다. 이러한 특성은 클라미디아에서유전자 발현 조절에서 GrgA의 생리적 역할을 추론할 수 있게 해주었으며, 가능한 상세한 상호작용 메커니즘을 가능하게 한다. 우리는 이 상대적으로 저렴한 기술이 전사 및 기타 생물학적 과정을 연구하는 데 매우 유용할 수 있다고 생각합니다.
서론
DNA를 템플릿으로 사용하여 RNA 분자를 생성하는 전사는 유전자 발현의 첫 번째 단계입니다. 세균성 RNA 합성은 표적 프로모터1,2에RNA 중합효소(RNAP) 홀로효소의 결합에 따라 시작된다. RNAP 홀로효소(RNAPholo)는 프로모터 서열을 인식하기 위해 요구되는 다중 서브유닛 촉매 코어(RNAPcore) 및 σ 인자로 구성된다. 전사 활성제 및 억압자, 집합적으로 TFs라고 불리는, RNAPcore, σ 인자 및/또는 DNA의 결합 분대를 통해 유전자 발현을 조절합니다. 유기체에 따라, 그 게놈의 상당 부분은 생리적 필요 및 환경 단서3에 응하여전사를 조절하는 TFs에 전념될 수 있다.
클라미디아는 인간과 동물의 다양한 질병에 대한 책임이 있는 의무적인 세포내세균입니다 4, 5,6,7,8.
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프로토콜
1. 단백질의 준비
- BLI 버퍼 (25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 10 mM MM 2MM 2Cl)에 대해 BLI 검정 (그의 태그 된 리간드 및 매질 모두 포함)에 사용되는 각 단백질을 투석 하기 위해 투석 백 (적절한 컷 오프 크기)을 사용하십시오. , 0.1 mM DTT, pH 8.0, 4°C에서 4°C로 미리 냉각된 4시간 동안.
참고: BLI 분석법은 리간드와 반응하는 분석물의 어금니 농도가 공지되도록 생체센서 및 분석물 상에서 결합 부위를 포화시키는 농도로 리간드가 존재하도록 요구한다. 그의 발현 및 정제에 대한 방법론은 여기에서 다루지 않지만, 이전 간행물14,15에서찾을 수 있다. 이 시스템은 리간드가 고도로 정제된 형태로 요구되지는 않지만, 분석 기간 동안 임의의 버퍼 변화에 의한 백색광 간섭 패턴의 변화를 최소화하기 위해 BLI 버퍼에 비정제 된 리간드도 투석하는 것이 필수적이다. - 신선한 BLI 버퍼로 전환하고 또 다른 4 시간 동안 투석을 계속하십시오.
2. 바이오 센서 수화 및 분석 설정
- ....
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결과
BLI 검소사를 통해, 우리는 이전에 GrgA 15의 28 아미노산 중간 영역(잔류물 138-165)에 의존하여GrgA와 σ28의 결합을 확립하였다. 이에 따라, N-말기 그의 태그 전체 길이 GrgA (NH-GrgA)에 비해, GrgA 삭제 구조부족이 지역 (NH-GrgAΔ138-165) 감소 협회 비율과 증가 해리 율을 했다, 전체의 3 백만 배 손실로 이어지는 선호도(표1). 여기서, 우리는 이러한 중간 영역이 GrgA 단백질의 나머지 부재에서 σ28을 직접 결합한다는 것을 입증한다. 이러한 실험에서, N-말단히 태그(NH-GrgA138-165)로 태그된 중간 영역은 리간드로서 사용되었고, 이는 Ni-NTA 바이오센서의 끝에먼저 고정되었다(도 1A). 바이오센서에서 언바운드 NH-GrgA138-165를 세척한 후,σ28의첨가 후, 분석물 σ.......
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토론
단백질 단백질 상호 작용은 전사 및 기타 생물학적 과정의 조절에 매우 중요합니다. 그(것)들은 풀다운 assays를 통해 일반적으로 공부됩니다. 풀다운 분석은 상대적으로 수행하기 쉽지만 양이 적고 약하지만 생물학적으로 의미있는 상호 작용을 감지하지 못할 수 있습니다. 이에 비해, 리간드와 어말레이트 사이의 실시간 연관 및 해리를 검출함으로써 BLI는 협회 및 해리속도 상수뿐만 아니라 전반적인 친화성을 제공한다.
풀다운 어세이에 비해 BLI 어세이스는 더 높은 감도를 제공합니다. 예를 들어, GrgA-σ28 상호 작용은 BLI에 의해 분석물의 낮은 nM 농도로 검출되지만 풀다운 분석 (게시되지 않은 데이터)에 의해 검출되지 않습니다. 풀다운과 는 달리 BLI는 감도에 크게 영향을 미칠 수 있는 검출 항체에 의존하지 않습니다.
더 중요한 것은, BLI 분석은 단백질 사이 상호 작용에 기계론적인 통찰력을 제공할 수 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 작품은 건강의 국가 학회 (보조금 # AI122034 및 AI140167)와 뉴저지 건강 재단 (보조금 # PC 20-18)에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| BLItz 기계 | ForteBio | 45-5000 | |
| 투석 튜빙 셀룰로오스 멤브레인 | MilliporeSigma | D9652 | |
| Ni-NTA 바이오센서 트레이 | ForteBio | 18-5101 | 폴리-His-태그 단백질용 즉시 사용 가능한 Ni-NTA 바이오센서 |
| 드롭 홀더 | ForteBio | 45-5004 | |
| PCR 튜브(0.2mL) | Thomas Scientific | ||
| 마이크로 원심분리기 튜브(검은색) | Thermo Fisher Scientific | 03-391-166 | |
| Kimwipes | Thermo Fisher Scientific | 06-666A | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| EDTA | MilliporeSigma | E6758 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M8266 | |
| NaCl | MilliporeSigma | S9888 | |
| Tris-HCl | GoldBio | T095100 |
참고문헌
- Vvedenskaya, I. O., et al. Interactions between RNA polymerase and the core recognition element are a determinant of transcription start site selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 113 (21), E2899-E2905 (2016).
- Feklistov, A., Sharon, B. D., Darst, S. A., Gross, C. A.
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재인쇄 및 허가
