우리는 현탁액 또는 부착물에서 서정적으로 감염된 인간 세포 내의 다중 헤르페스 바이러스 RNA를 시각화하기 위해 situ 혼성화 (FISH)에서 형광을 활용하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 뉴클레오세포질을 생성하는 형광의 정량화를 포함하고 면역형광(IF)을 가진 숙주 및 바이러스 성 단백질의 동시 시각화를 위해 확장될 수 있다.
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방법 논문
KSHV 감염 세포에서 특정 유전자 제품의 시투 혼성화 (FISH) 및 면역 형광 (IF)의 정량형 형광
이 논문에서
요약
초록
기계론적 통찰력은 특정 RNA 및 단백질의 신중한 연구 및 정량화에서 옵니다. 특정 시간에 세포 를 통해 이 생체 분자의 상대적인 위치는 위치 혼성화 (FISH) 및 면역 형광 (IF)에 있는 형광으로 붙잡을 수 있습니다. lytic 헤르페스 바이러스 감염 도중, 바이러스는 우대적으로 바이러스성 유전자를 표현하기 위하여 호스트 세포를 납치하고, 생체 분자의 세포 형태 그리고 행동에 있는 변경을 일으키는 원인이 됩니다. Lytic 활동은 원자력 공장을 중심으로, 물고기와 IF로만 식별 할 수있는 바이러스 복제 구획이라고합니다. 여기에서 우리는 카포시의 육종 관련 헤르페스 바이러스 (KSHV)에 대한 RNA FISH 및 IF 기술의 적응 프로토콜을 설명합니다, 모두 부착 및 현탁액. 이 방법은 특정 안티 센스 올리고뉴클레오티드, 이중 RNA FISH, IF를 이용한 RNA FISH, 및 형광 강도의 정량적 계산의 개발을 위한 단계를 포함한다. 이 프로토콜은 여러 세포 유형, 감염되지 않은 세포, 잠복 세포, 용리 세포, 시간 과정 및 억제물로 처리된 세포에 성공적으로 적용되어 인간 숙주 및 단백질 모두에서 특정 RNA 및 단백질의 시공간 활동을 분석했습니다. KSHV.
서론
그들의 용리 (활성) 단계에서, 헤르페스 바이러스는 숙주 세포를 납치하여 세포 형태와 생물학적 분자의 국소화의 변화를 일으켜 비리온을 생성합니다. 작전의 기초는 이중 가닥 DNA 바이러스 게놈이 capsid1에게불린 단백질 껍질로 복제되고 포장되는 핵입니다. 시작하기 위하여, 바이러스는 그것의 자신의 단백질을 표현하고, 호스트 기계를 납치하고 비필수 호스트 유전자의 발현을 방지합니다, 프로세스는 호스트 차단 효력을 불릴. 이 활동의 대다수는 특정 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)가 없는 바이러스 성 복제 구획이라고 불리는, 호스트 및 바이러스 성 단백질,RNA 및 바이러스 DNA 2로 구성된 지역화된다. 셀은 복제 구획에 대한 공간과 자원을 제공하기 위해 정밀 검사되어 바이러스 성 캡시드의 조립을 합니다. 일단 capsid가 핵을 종료하면, 캡시드가 세포질에서 어떻게 비리온이라고도 하는 막 결합된 바이러스성 입자를 생성하기 위하여 포위되는지, 불분명합니다. 용해 단계 도중 호스트와 바이러스성 생체 분자 둘 다의 현지화 그리고 공간 교대의 이해는 복제 구획의 배열, 호스트 차단 효력, virion-egress 통로 및 그밖에 더 깊은 기계론적인 통찰력을 제공합니다 헤르페스 바이....
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프로토콜
1. 특정 헤르페스 바이러스 전사체를 검출하는 위치 (FISH) 안티 센스 올리고 뉴클레오티드에서 형광의 설계
- 관심 있는 RNA의 서열로부터 25~40개의 nt 세그먼트를 선택하고 안티센스로 변환한다. 성공적인 FISH 전략은 1개에서 10개 이상의 상이한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 시퀀스를 선택할 때 다음을 고려하십시오.
- 관심 있는 RNA가 독특한 반복 영역을 포함하는 경우, 이 특징을 활용하고 반복 서열을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 설계한다.
참고: Tycowski 및 동료 5는 rhesus rhadinovirus (RRV) 폴리아데닐화 핵 (PAN) RNA를 가진 이 전략의 보기를 제공합니다. - 관심 있는 RNA가 공지된 단백질 결합 부위 또는 줄기 루프 구조를 포함하는 경우, 이러한 부위를 피하는 올리고뉴클레오티드를 설계한다.
- 실험의 목표에 따라, 내향적 서열및 그것에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 설계할지 여부를 고려한다.
- 관심 있는 RNA가 독특한 반복 영역을 포함하는 경우, 이 특징을 활용하고 반복 서열을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 설계한다.
- 선택된 안티센스 서열에 대한 간단한 계산 분석을 수행하여 결합 특이성을 보장하고 안티센스 올리고뉴클레오티드의 응집을 줄입니다.
- 서열은 약 50% GC-풍....
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결과
이 원고에 자세히 설명된 FISH 및 IF 방법은 형광 강도의 선 자취에 의한 결과의 정량화와 함께 그림 1에 나와 있습니다. 여기에 제시된 결과는 반정적이며, 실험이 슬라이드 준비에 형광 비드를 포함하지 않았기 때문에 다른 형광 얼룩의 강도 사이의 비교보다는 지역화에 대한 통찰력을 제공합니다. 도 1은 또한 세포질 및 핵 영역 및 이들의 비율이 잠재 및 용해 KSHV 감염 세포에 대해 상이하다는 것을 보여준다. 따라서, 영역은 도2에 전시된 뉴클레오세포비에서 조절된다. 도 2는 핵 대조군, 바이러스 성 폴리아데닐화 핵(PAN) RNA, 및 세포질 조절, 숙주 GAPDH mRNA를 사용하여 핵세포질 비에 대해 본 원고에 상세히 설명된 계산을 검증한다.
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토론
본 보고서에 기재된 프로토콜은 상이한 세포 유형에 적응될 수 있으며, 단일클론 및 폴리클로날 1차 항체를 모두 사용하는 경우와 함께 이중 RNA FISH 및 RNA FISH에 대한 단계를 포함한다. 준비된 슬라이드는 전형적으로 공초점 현미경으로 이미지화되지만, 증가된 항체 농도 및 상이한 장착 매체의 변형 후 STED(자극방출 고갈) 현미경으로 영상을 수행할 수 있다. 개별 세포의 향상된 분석을 위해, 이 프로토콜로 준비된 견본은 또한 Borah 및 동료16에의해 도시된 바와 같이 적당한 변경을 가진 세포 선별기 또는 유동 세포계에 의해 분류, 화상 및 분석될 수 있습니다. 그러나 이 프로토콜은 살아있는 세포 화상 진찰을 위해 채택될 수 없습니다.
정량화 방법은 관찰 편향을 제거하고 잠재적인 뉴클레오세포 시질 변화를 검증하는 역할을 한다. 뉴클레오세포 질 비율은 또한 생체 분자가 특정 세포 외 구획에 국소화하기 위하여 고르게 분산되는 에.......
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공개 사항
저자는 공개할 이해상충이 없습니다.
감사의 글
조나단 로덴펠스, 카지미에츠 티코스키, 요한나 B. 위더스에게 데이터 분석에 대한 조언을 해주셔서 감사합니다. 우리는 또한 반대로 SSB 항체를 위한 G. Hayward 감사합니다. 이 작품은 국립 보건원 (TKV)과 NIH 교부금 (CA16038)에서 T32GM007223 및 T32AI05403 (JAS에)에 의해 지원되었습니다. JAS는 하워드 휴즈 의학 연구소의 조사자입니다. 그림 1-3 및 표 1은 다음 출판물에서 크리에이티브 커먼즈 저작자 표시 라이센스에 따라 미국 미생물학 협회의 허가를 받아 복제되었습니다: Vallery, T. K., 위더스, J. B., 안도, J. A., 스테이츠, J. A. 카포시의 육종 관련 핵 포시에 헤르페스 바이러스 mRNA 축적은 바이러스 DNA 복제 및 바이러스 비코딩 폴리아데닐화 핵 RNA에 의해 영향을 받습니다. 바이러스학의 전표. 92 (13), doi:10.1128/JVI.00220-18, (2018).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| AlexaFluor594-5-dUTP | Life Technologies | C1100 | |
| anti-DIG FITC | Jackson Lab Immunologicals | 200-092-156 | |
| Anti-Rabbit Secondary AlexaFluor594 Monoclonal Antibody | Invitrogen | A-11037 | Goat |
| Anti-SSB 항체 | N/A | N/A | Ref. Chiou et al. 2002 |
| BLASTn | NIH NCBI | N/A | Free Sequence Alignment Software |
| Dextran Sulfate | Sigma Aldrich | D8906 | Molecular Biology Grade |
| DIG-올리고뉴클레오티드 테일링 키트 | Sigma Roche | #03353583910 | 2세대 |
| 여덟 개의 챔버 슬라이드 | Nunc Lab Tek II | #154453 | 블루 씰은 표면 장력을 촉진하지만 투명 젤에 의한 분리도 가능합니다. |
| 포름아미드 | 시그마 알드리치 | F9037 | 분자 생물학 등급 |
| GAPDH 프로브 | 스텔라리스 | SMF-2019-1 | 프로토콜, Quasar 670 |
| ImageJ 와 | NIH, Bethesda, MD | N/A | 무료 이미지 분석 소프트웨어, [http:rsb.info.nih.gov/ij/] |
| OligoAnalyzer | IDT N | /A | 무료 올리고뉴클레오티드 분석기 |
| pcDNA3 | Invitrogen | A-150228 | |
| pmaxGFP | Amaxa | VDF-1012 | |
| Poly L-Lysine | Sigma Aldrich | P8920 | |
| 말단 전이효소 | Sigma Roche | #003333574001 | |
| Vanadyl Ribonucleoside 복합체 | NEB | S1402S | |
| 벡타쉴 | 벡터 연구소, Inc. | H-1000 | DAPI는 빛을 산란시키고 대비를 줄입니다. |
참고문헌
- Amen, M. A., Griffiths, A. Packaging of Non-Coding RNAs into Herpesvirus Virions: Comparisons to Coding RNAs. Frontiers in Genetics. 2, 81(2011).
- Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. Journal of Virology. 88
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재인쇄 및 허가
