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방법 논문

암세포의 3D 스페로이드 배양에서 세포 생존력과 사망 평가

28.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/59714

⸱

2019년 6월 16일

 ,  , 
1Section for Cell Biology and Physiology, Department of Biology, Faculty of Science, University of Copenhagen

이 논문에서

요약

여기에서, 우리는 2D 문화 보다는 생체 내 종양의 물리 화학 구배를 모방하는 3D 암 세포 스페로이드에 있는 생존과 죽음을 평가하기 위한 몇몇 간단한 방법을 제시합니다. 따라서 스페로이드 모델은 생체 내 조건으로의 번역을 개선하여 암 약물 효능의 평가를 허용합니다.

초록

암세포의 3차원 스페로이드는 암 약물 스크린과 암 세포 생물학에 대한 기계적 통찰력을 얻기 위한 중요한 도구입니다. 이 준비의 힘은 상대적으로 높은 처리량 검열을 허용하기 위하여 충분히 빠르고, 싸고, 다재다능하면서 종양의 생체 내 조건의 많은 양상을 모방하는 그것의 기능에 있습니다. 스페로이드 배양 조건은 종양에 있는 물리 화학 구배를 되풀이할 수 있습니다, 세포외 산도 증가 포함, 증가한 젖산, 및 포도당 과 산소 가용성 감소, 그것의 코어에 구형 주변에서. 또한, 생체 내 종양의 기계적 특성 및 세포-세포 상호 작용은 부분적으로 이 모델에 의해 모방된다. 특정 특성 및 결과적으로 최적의 성장 조건, 3D 스페로이드의, 암 세포의 다른 유형 사이 크게 다릅니다. 게다가, 3D 스페로이드에 있는 세포 생존성 그리고 죽음의 평가는 2D 문화를 위해 채택된 것과 부분적으로 다른 방법을 요구합니다. 여기에서 우리는 암세포의 3D 스페로이드를 준비하기 위한 몇몇 프로토콜을 기술하고, 항암제의 효험을 평가하는 맥락에서 세포 생존력 및 죽음을 평가하기 위하여 그 같은 문화를 이용하기 위한.

서론

암 생물학에서 다세포 스페로이드 모델의 사용은 수십년 된 1,2,그러나 최근 몇 년 동안 상당한 모멘텀을 얻고있다. 큰 부분에서, 이것은 암세포의 표현형이 그들의 미세 환경 및 특정 성장 조건에 얼마나 강하게 의존하는지의 증가한 의식을 반영합니다. 고형 종양의 미세 환경은 상응하는 정상 조직에서의 미세 환경과 근본적으로 다릅니다. 여기에는 pH, 산소 장력과 같은 물리 화학 적 조건뿐만 아니라 간질 압력, 영양분, 노산물 및 분비 된 신호 화합물 (성장 인자, 사이토 카인)과 같은 수용성 인자의 농도 구배가 포함됩니다. 더욱이, 종양3,4의세포외 기질(ECM), 세포-세포 상호작용 및 세포간 신호화, 및 특정 3차원(3D) 아키텍처의 다른 양상들의 조직을포함한다. 5,6. 암세포가 존재하는 특정 미세 환경 조건은 유전자 발현 프로필 및 기능적 특성에 심오하게 영향을 미치며, 2D로 자란 세포의 표현형에 비해 3D 스페로이드의 표현형이 훨씬 더 밀접하게 모방된다는 것은 분명합니다. 생체 내 종양의7,8,9,10,11. 2D 모델은 저산소증, 산성 pH 및 높은 젖산 농도를 사용하여 종양 미세 환경의 알려진 측면을 모방하더라도 종양 내에서 발생하는 물리 화학 적 매개 변수와 3D 종양의 구배를 포착하지 못합니다. 아키텍처. 다른 한편으로는, 동물 모형은 비용이 많이 들고, 느리고, 윤리적으로 문제가 있고, 일반적으로, 또한 인간 적인 종양 조건을 되풀이하는 그들의 기능에 있는 결점이 있습니다. 따라서, 3D 스페로이드는 대부분의 고형암9,11, 12,13의광범위한 특성에 대한 연구에서 중간 복잡성 모델로적용되었습니다. 14,15,16,17.

3D 스페로이드의 널리 사용되는 사용은 항암 치료 효능 9,18,19,20의스크리닝 검문 검사에 있다. 처리 반응은 종양 미세 환경에 특히 민감하며, 불법 행위의 영향, 제한된 확산, 높은 간질 압력 및 약물 전달에 대한 산성 환경 pH, 저산소증 및 기타 의 영향을 모두 반영합니다. 세포 사멸 반응에 대한미세 환경의 양상 9,17. 3D 스페로이드 내의 환경은 본질적으로 이러한 속성 7,8,9,10,11을모두 개발하기 때문에 3D 세포 배양을 채택할 수 있습니다. 결과의 결과를 생체 내 조건으로 실질적으로 향상시키면서도 순 성장의 효율적이고 저렴한 고처리량 스크리닝을 허용합니다. 그러나, 암세포의 약물 반응에 대한 연구의 대부분은 여전히 2D 조건 하에서 수행된다. 이것은 몇몇 분석실험이 3D 세포 배양을 위해 상대적으로 쉽게 구현될 수 있는 동안, 생존성 분석실험, 서쪽 blotting 및 면역형광 분석과 같은 많은 것이 3D에서 보다는 2D에서 훨씬 더 편리하게 행해질 수 있다는 것을 반영합니다.

본 연구의 목적은 암세포 생존력및 생존에 대한 항암제 치료의 효과를 분석하기 위한 용이한 분석및 정밀한 프로토콜을 3D 종양 모방 설정에서 제공하는 것이다. 구체적으로, 우리는 스페로이드 형성을 위한 3개의 다른 방법을 제공하고 비교하고, 성장, 생존력 및 약물 반응의 정성적 및 정량적 분석을 위한 방법에 선행합니다.

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프로토콜

1. 스페로이드 생성

  1. 스페로이드 형성을 위한 세포 현탁액 준비
    참고:     다른 세포주들은 매우 다른 접착 특성을 가지며, 각각의 경우에 가장 적합한 스페로이드 형성 프로토콜을 확립해야 합니다. 우리는 MCF-7과 BxPC-3 세포가 자발적인 스페로이드 형성에 적합하다는 것을 것을을 발견했습니다, MDA-MB-231, SKBr-3, Panc-1 및 MiaPaCa는 성공적으로 스페로이드를 형성하기 위하여 재구성된 지하실 막의 추가를 요구합니다. MDA-MB-231 및 BxPC-3 세포만이 매달려 있는 드롭 프로토콜에 사용되었지만 다른 세포주도 확실히 적용 가능하다.
    1. 70-80% 합류까지 단층으로 세포를 성장.
    2. 인산완충식염수로 세포를 세척하고(1x PBS, 25cm2의 경우 20mL, 75cm 2플라스크의 경우 10mL), 세포 해리 효소(25cm 2의 경우 0.5 mL, 75cm 2플라스크의 경우 1mL)를 추가하고 37°C에서 2-5분 동안 세포를 배양합니다. 5%CO2 및 95% 습도.
    3. 현미경으로 세포 분리를 확인하고 75 cm 2 플라스크에 대해 25 cm2 또는 10 mL에서 총 부피 5 mL에 성장 배지 (세포주에 따라 6-10 % 혈청)를 추가하여 세포 해리 효소를 중화시다.
    4. Bürker 챔버를 사용하여 세포를 계산하고 세포 준비당 챔버내 8 제곱을 계산하여 스페로이드 크기의 높은 재현성을 얻습니다.
      참고: 스페로이드 형성을 위한 다른 방법을 설명하는 3개의 프로토콜각각은 아래에 제시된다. 프로토콜 1.2 및 1.3은 제시된 모든 후속 분석 프로토콜에 사용할 수 있지만 프로토콜 1.4는 포함 및 용해 제제에 가장 적합합니다. 세포주에 따라, 스페로이드 형성은 사용되는 방법에 관계없이 2-4 일이 걸립니다.
  2. 자발적인 스페로이드 형성
    1. 단계 1.1.1-1.1.4를 수행합니다.
    2. 세포 현탁액을 15 mL 튜브에서 희석하여 0.5-2 x 104 세포/mL(각 세포주마다 최적의 세포 밀도를 결정할 필요가 있음)(도1A(ii))).
    3. 나머지 우물에서 증발을 줄이기 위해 1x PBS 또는 성장 매체로 우물의 외부 고리를 채웁니다. 셀 서스펜션을 멸균 저장소로 옮기고, 멀티채널 파이펫을 사용하여 200 μL/well을 초저 부착 96웰 라운드 바닥 판으로 분배합니다(그림1A(iii)).
    4. 37 °C에서 인큐베이터에서 접시를 5 %CO 2, 95 % 습도로 배양합니다.
    5. 매 2-3 일마다 스페로이드의 가벼운 현미경 이미지를 얻습니다.
      참고: 이 백서의 이미지는 11.5배 배율로 촬영되며, 이러한 프로토콜을 사용하여 제조된 대부분의 스페로이드에 적합합니다.
    6. 매 2-3 일 (이미지 획득 후) 매체 의 100 μL을 대체 (소비 매체의 100 μL을 제거하고 신선한 매체의 100 μL로 교체하십시오.
      참고: 매체를 교체 할 때 스페로이드를 제거하지 않으려면, 천천히 매체를 제거하고 그것을 폐기하기 전에 눈에 보이는 전형에 대한 팁에 흡인 매체를 검사하면서 플레이트를 조금 기울이는 것이 좋습니다.
  3. 재구성 된 지하 멤브레인 매개 스페로이드 형성.
    참고:     유당 탈수소효소 상승 바이러스(LDEV)-무성장 인자 재구성 지하 막(rBM)을 사용하였다. rBM은 온도에 민감하며 15 °C에 도달하면 응고되기 때문에 항상 얼음에 보관해야합니다. 도금 전에 4°C 또는 2-4시간에서 밤새 얼음에 rBM을 해동합니다.
    1. 얼음에 rBM을 해동 (재료표참조).
    2. 사용하기 전에 접시와 저수지(개별적으로 포장된 경우)를 얼음 위에 보관하십시오.
    3. 단계 1.1.1-1.1.4를 수행합니다.
    4. 나머지 우물에서 증발을 줄이기 위해 1x PBS 또는 성장 매체로 우물의 외부 고리를 채웁니다. 세포 현탁액을 15 mL 튜브에서 희석하여 0.5-2 x 104 세포/mL(각 세포주마다 최적의 세포 밀도를 결정할 필요가 있음)(도1A(ii))).
    5. 희석된 세포 현탁액을 함유하는 15 mL 튜브를 얼음 상에 놓습니다(예를 들어, 유리 비커)(도1A(iia))).
    6. 차가운 접시와 저수지를 후드로 옮김. 플라스틱 용기를 헹구고 얼음으로 채우고 후드로 옮겨 전체 절차 동안 플레이트와 저수지를 얼음위에 놓습니다.
    7. 균일 한 젤을 보장하기 위해 rBM을 부드럽게 다시 일시 중단하십시오.
    8. 냉각된 세포 현탁액에 1-2% rBM(각 세포주마다 최적 농도가 결정되어야 한다)을 추가합니다(그림1A(iib))).
    9. 플레이트에 현탁액을 분배하기 전에 rBM 및 셀 현탁액의 적절한 혼합을 보장하기 위해 15 mL 튜브를 반전시.
    10. rBM 함유 셀 현탁액을 멸균 저장소로 옮기고 다중 채널 파이펫을 사용하여 냉각된 초저 부속식 96웰 플레이트에 200 μL/well을 분배합니다(도1A(iii)).
      참고: 여러 세포 현탁액(예를 들어, 하나 이상의 세포주)으로 작업하는 경우, 조기 겔링을 방지하기 위해 rBM 첨가 직후에 각 세포 현탁액을 분배하는 것이 필수적입니다.
    11. '소프트 괜찮은'/제동 없음을 사용하여 750 x g에서 15 분 동안 플레이트를 원심 분리 (가능한 경우 4 °C에서 원심 분리기로 rBM 유체를 더 오래 유지하지만 성공적인 스페로이드 형성을위한 요구 사항은 아님), rBM 시 세포가 함께 클러스터되도록합니다. 경화, 하나의 단일 스페로이드의 형성을 용이하게.
    12. 인큐베이터 (37 °C, 5 % CO2,95 % 습도)에서 플레이트를 배양합니다.
    13. 매 2-3 일 스페로이드 성장의 평가를 위한 가벼운 현미경 심상을 취득합니다.
    14. 매 2-3 일마다 100 μL의 매체를 대체하십시오 (100 μL을 제거하고 신선한 매체의 100 μL로 대체하십시오).
  4. 매달려 드롭 스페로이드.
    1. 1.1.1-1.1.4 단계를 수행합니다.
    2. 적절한 희석을 얻기 위해 세포를 희석한다. 실용적인 희석은 50,000 셀 /mL입니다.
    3. 10cm2 세포 배양 접시의 뚜껑을 제거하고 위쪽으로 향할 수 있도록 놓습니다. 접시에 1x PBS의 6mL를 추가합니다(그림1B(i))).
    4. 세포 현탁액을 멸균 저장소에 붓고 다중 채널 파이펫 (그림1B (ii))을사용하여 세포 배양 접시의 뚜껑에 40 μL의 셀 현탁액을 30 방울까지 조심스럽게 놓고 2,000 개의 세포 / 드롭의 농도를 초래합니다. 다음 단계에서 뚜껑을 뒤집을 때 표면 장력을 잃을 가능성이 높기 때문에 방울을 뚜껑 가장자리에 너무 가깝게 두지 마십시오.
    5. 뚜껑을 빠르지만 제어된 움직임으로 반전시키고 1x PBS 함유 세포 배양 접시 위에 놓습니다(도1B(iii)).
    6. 접시를 37°C에서 5%CO2 및 95% 습도의 인큐베이터에 놓고 방울을 방해하지 않고 4-6일 동안 자랍니다.
    7. 단백질 용해 또는 포함에 사용되는 경우, 뚜껑을 제거하고 기울여 풀 스페로이드, 가열 매체의 1 mL로 방울을 씻어하기 위해. 스페로이드를 함유한 생성된 배지를 1.5 mL 튜브로 옮기고 튜브 바닥에 정착시키십시오. 단백질 용해 및 임베딩에 대해 각각 4.4 및 6.2.2에 기재된 대로 진행한다.

2. 스페로이드의 약물 치료

참고: 관심 있는 약물의 효과를 스크리프기 위해 스페로이드에 장기 약물 치료를 적용할 수 있다. 약물 치료를 시작하기 전에, 실험 적 치료를 위한 적절한 용량을 찾기 위해 약물의 투여 반응 실험을 수행하는 것이 바람직하다. 투여량은 약물의 결정된 IC50/Ki를 기반으로 해야 하며 이 값의 약 0.2x-10x로부터 범위에 이된다.

  1. 1.2 또는 1.3에 기재된 바와 같이 원하는 조건당 6-12개의 스페로이드를 설정하고 인큐베이터(37°C, 5% CO2, 95% 습도)에 2일 동안 놓습니다.
  2. 2 일째에는 스페로이드의 가벼운 현미경 이미지를 가져 가라.
  3. 첫 번째 치료 용량을 준비하십시오 (이미지를 획득 한 후).
    참고: 제1 처리 농도는 100 μL 배지를 함유하는 웰에 첨가하여 용액이 1:2 희석될 것이기 때문에 원하는 최종 농도의 2배여야 한다. 제안 된 약물 치료 간격 (약물 반감기에 따라 달라 집니다): 일 2, 4 그리고 7.
  4. 다중 채널 파이펫을 사용하여 100 μL의 배지를 부드럽게 제거하고 배지를 함유 한 100 μL의 약물로 교체하십시오.
  5. 96웰 플레이트를 5%CO2 및 95% 습도로 37°C에서 인큐베이터에 다시 놓고, 선택한 치료 일에 2.3 및 2.4를 반복하지만, 이제 는 정확한 최종 용량을 얻기 위해 복용량을 두 배로 늘리지 않고.
  6. 프로토콜/치료 일정의 마지막 날에, 다음 분석중 하나 또는 여러 가지를 수행할 수 있다.

3. 스페로이드세포 생존분석

  1. 1.2 또는 1.3에 기재된 바와 같이 원하는 조건당 4-6개의 스페로이드를 설정하고 5% CO2 및 95% 습도로 37°C에서 인큐베이터에 놓습니다.
    참고: 이 때, 세포 생존율 분석법은 상술한 바와 같은 광 현미경검사법에 의해 2-3일마다 스페로이드 성장을 모니터링한 후 7일 또는 9일에 수행하였다(점 1.2.5 및 1.3.13).
  2. 생존율 분석 시약을 해동(재료 표참조)하고 사용하기 전에 RT와 평형화합니다.
  3. 균일 한 용액을 얻기 위해 반전하여 부드럽게 혼합하십시오.
  4. 분석을 수행하기 전에, 스페로이드(100 μL)로부터 배양 배지의 50%를 제거한다.
  5. 웰에 존재하는 배지의 양에 1:3 비율로 각각의 잘 에 세포 생존 성 시약을 추가 (그림2A (i)96 웰 플레이트의 경우, 배지의 100 μL에 시약의 50 μL을 추가합니다.
  6. 세포 용해를 유도하기 위해 5분 동안 내용물들을 힘차게 섞는다(도2A(ii)).
  7. RT에서 25분 동안 배양하여 발광 신호를 안정화하였다(도2A(iii)).
  8. 발광 신호를 기록합니다(그림2A(iv)).

4. 3D 스페로이드 배양에서 서양 블로팅을 위한 단백질 용해준비

참고: 스페로이드를 수집할 때 P200 파이펫을 사용하고 팁 끝을 잘라 더 큰 개구부를 허용하고 따라서 구조를 방해하지 않고 스페로이드를 쉽게 캡처하는 것이 좋습니다.

  1. 각 조건에 대해 1.5 mL 튜브에서 최소 12, 이상적으로 18-24 스페로이드 (스페로이드 크기에 따라 다름)를 풀링하십시오 (다음 단계는 덜 뾰족한 바닥으로 인해 더 어려워지기 때문에 2 mL 튜브를 피하십시오).
    참고: 배지의 양이 모든 스페로이드를 수집하기 전에 1.5 mL를 초과하는 경우, 수집 된 스페로이드가 바닥에 정착 할 수 있도록 (매우 빠르게 발생, 원심 분리필요) 수집을 계속하기 전에 튜브의 절반 볼륨을 폐기 남은 스페로이드.
  2. 얼음에 튜브를 놓고 스페로이드가 1.5 mL 튜브의 바닥에 정착 할 수 있도록.
  3. 멸균 세포 실험실에서 일반 실험실로 이동하십시오.
  4. 얼음차가운 1x PBS 1mL에 스페로이드를 두 번 씻으세요. 각 세척 단계 사이에 1x PBS를 제거하기 전에 스페로이드가 정착시키십시오.
  5. 스페로이드를 방해하거나 제거하지 않고 가능한 한 1x PBS를 흡인합니다.
  6. 스페로이드 당 인산염 및 프로테아제 억제제(예: 10개의 스페로이드 = 50 μL LB)를 가진 가열된 용해 완충제(LB)를 5 μL추가합니다.
  7. 와류의 반복 간격과 스페로이드가 용해 될 때까지 스핀 다운됩니다. 30초 동안 소용돌이 를 한 다음 원심 분리 (탁상 원심 분리기를 사용하는 빠른 스핀이 충분함)를 약 10 초 동안 약 5-10 분 동안 스페로이드의 크기와 소형화에 따라 수행하십시오.
    참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 표준 2D 단백질 용해 프로토콜에서와 같이 초음파 처리, 균질화 및 단백질 측정을 진행할 때까지 용해를 -20 °C에서 유지하고 표준 프로토콜을 사용하여 서쪽 블로팅을 합니다.

5. 스페로이드의 프로피듐 요오드화물 (PI) 염색

  1. 1.2 또는 1.3에 기재된 바와 같이 원하는 조건당 3-6개의 스페로이드를 설정하고 5% CO2 및 95% 습도로 37°C에서 인큐베이터에 놓습니다.
  2. 멸균 세포 배양 실험실에서 1x PBS를 37°C로 가열합니다.
  3. 1x PBS로 재고 용액을 희석하여 4 μM의 PI 솔루션을 만듭니다: 1x PBS에서 PI 1:350의 1 mg/mL 수성 재고를 희석합니다.
    참고: 이러한 농도는 스페로이드를 함유하는 각각의 웰에 대해 2 μM. 100 μL의 최종 농도를 부여하는 웰에 용액을 첨가할 때 더욱 반으로 줄어들 것이다.
    주의 사항: 프로피듐 요오드화물 (PI)는 연기 후드와 장갑을 착용에서 처리해야합니다. PI는 빛에 민감합니다. 취급 시 빛으로부터 보호하십시오.
  4. 스페로이드를 제거하지 않고 96웰 플레이트에서 각각의 웰으로부터 배지의 100 μL을 제거한다.
  5. 모든 웰에 가열된 1x PBS 100 μL을 첨가하고 웰에서 액체의 100 μL을 제거하여 나머지 배지를 씻어낸다. 이 세척 단계를 3번 반복합니다.
  6. 각 우물에 PI 용액의 100 μL을 추가하고 알루미늄 호일에 플레이트를 덮고 5 % CO2 및 95 % 습도로 37 °C의 인큐베이터에 10-15 분 동안 배치하십시오.
  7. 이미징 시 배경 신호를 감소시키기 위해 PI 용액을 세척하기 위해 4.5에 설명된 3개의 세척 단계를 반복합니다.
  8. 에피플루오레전스 현미경을 사용하여 스페로이드를 이미지화합니다. 스페로이드 코어에서 세포의 생존 가능성을 평가하려면 z-stacks를 사용하여 스페로이드의 다양한 깊이를 가진 이미지를 얻습니다.
    참고: 스페로이드 크기에 따라 각 슬라이스 사이에 약 18-35 μm의 스텝 크기를 제공하는 것이 좋습니다. Z-스택은 모든 z-stack을 하나의 최종 그림으로 결합할 수 있는 z-projection 함수를 사용하여 ImageJ에서 처리될 수 있으며, 스페로이드 전체에 걸쳐 염색에 대한 개요를 제공합니다(이를 위해 ImageJ 사용에 대한 추가 지침은 https://imagej.net/Z-functions 참조).

6. 3D 스페로이드 포함

  1. 스페로이드가 내장된 아가로즈 겔을 준비합니다 (프로토콜을 처음 수행하는 데만 필요).
    1. ddH2O의 50 mL에 바토아가르 1 g을 섞습니다.
    2. 바토아가 용해되고 균일 한 젤이 형성 될 때까지 전자 레인지에서 천천히 가열하십시오. 젤이 끓지 않도록 하십시오.
    3. 60 °C에서 수조에서 바토아가 따뜻하게 유지합니다.
    4. 실험 사이에 4 °C로 유지하십시오.
  2. 스페로이드 의 포함.
    1. 1일째, 각 조건에 대해 1.5mL 튜브에 최소 12개의 스페로이드를 풀링합니다.
    2. 얼음으로 차가운 1x PBS 1 mL로 한 번 씻으소서.
    3. 스페로이드를 고치려면 4% 파라포름알데히드 1mL를 추가합니다.
      참고: 파라 포름 알데히드의 처리는 연기 후드에서 수행해야합니다.
    4. RT에서 24 시간 동안 배양하십시오.
    5. 2일째에는 아가로즈 젤을 전자레인지에 물로 채워진 비커에 넣어 조심스럽게 가열합니다. 젤이 끓지 않도록 하십시오! 벤치탑 가열 플레이트에서 사용 후 60°C에서 따뜻하게 유지하십시오.
    6. 얼음으로 차가운 1x PBS 1 mL로 스페로이드를 두 번 씻으세요.
    7. 1x PBS의 대부분을 흡인합니다(이 시점에서 약 100 μL을 남기는 것은 스페로이드를 처리하는 데 실용적입니다).
    8. 더 큰 구멍이 있는 뾰족한 팁을 얻기 위해 경사에서 파이펫 팁을 절단하여 20 μL 파이펫을 준비합니다(그림 참조).
      참고: 다음 부분은 최적의 스페로이드 전달을 보장하고 젤 드롭의 응고를 피하기 위해 신속하게 수행해야합니다. 가열 블록을 사용할 수 없는 경우 먼저 스페로이드를 잡은 다음 아가로즈 드롭(즉, 포인트 6.2.9 및 6.2.10의 순서 전환)을 만드는 것이 좋습니다.
    9. 현미경 슬라이드에 아가로즈 젤 드롭을 확인합니다. 아가로스가 굳어지지지지 않도록 슬라이드를 따뜻한 가열 블록에 놓습니다.
    10. 수정된 파이펫 팁(6.2.8 참조)을 사용하여 15-20 μL의 부피에서 가능한 한 많은 스페로이드를 잡으세요.
    11. 현미경 슬라이드를 건드리지 않고 15-20 μL 스페로이드를 함유한 1x PBS를 아가로즈 젤 드롭의 중앙에 조심스럽게 주입합니다.
      참고: 이것은 약간 어려운 점입니다. 피펫 팁이 젤 드롭에 스페로이드를 주입 할 때 현미경 슬라이드에 닿으면 스페로이드가 손실됩니다. 아가로즈 드롭을 만들고 착색 된 액체를 드롭에 주입하여 스페로이드를 주입하는 전체 과정을 연습하는 것이 좋습니다. 이렇게하면 착색 된 액체가 슬라이드에 새어 나오므로 드롭을 통해 잠재적 인 침투를 시각화 할 수 있습니다.
    12. 아가로즈 겔을 RT 또는 4°C에서 5-10분 동안 배양하여 경화시켜 놓습니다. 젤 드롭이 다소 굳어지면 (그러나 여전히 부드럽습니다), 현미경 슬라이드에서 젤 드롭을 메스가있는 플라스틱 조직 카세트로 조심스럽게 밀어 넣습니다.
    13. 플라스틱 티슈 카세트를 70% 에탄올로 덮습니다.
      참고: 이 시점에서 스페로이드를 직접 사용하거나 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.
    14. 아가로오스가 내장된 스페로이드를 파라핀에 넣고, 2-3 μm 두께의 층 슬라이드에 넣고 헤마톡신과 에오신으로 얼룩을 묻거나 면역 조직학적 염색을 받습니다.

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결과

도 1A 및 도 1B에도시된 스페로이드 형성 프로토콜에 기초한 스페로이드 성장 분석은 3D 종양에서 항암 약물 치료의 효과를 분석하기 위한 출발점으로 사용되었습니다. 설정을 모방합니다. 스페로이드가 형성되는 용이성은 세포주 특이적이며, 일부 세포주는 일관된 스페로이드22를형성하기 위해 rBM을 보충해야 합니다. 추가된 rBM의 농도는 스페로이드의 형태에 심오하게 영향을 미칠 수 있습니다. 도 1C 및 도 1D에도시된 바와 같이, rBM의 농도가 0~4% 사이를 변화하면 세포 유형 의존적 방식으로 스페로이드의 소형화 및 형태가 변화한다.

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토론

3D 암 세포 스페로이드의 사용은 항암제 스크리닝뿐만 아니라 종양을 모방한 조건하에서 암세포 사멸 및 생존가능성에 대한 기계적 통찰력을 얻기 위한 귀중하고 다양한 도구임이 입증되었습니다. 미세 환경. 이것은 화학요법 약의 접근성, 세포 장악 및 세포내 효력이 pH, 산소 긴장, tortuosity 및 물리적 인 및 종양에 있는 physico 화학 조건에 의해 심오하게 영향을 미치기 때문에 특히 중요합니다 화학 세포 세포상호 작용 9,17. 예를 들어, 많은 고형 종양25,26,27,28,29에서6-6.5의 낮은 값에 도달 할 수있는 세포 외 pH의 산도는 ...

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공개 사항

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

감사의 글

우리는 우수한 기술 지원을 위한 캐서린 프랭클린 마크와 아네트 바텔스와 그림 1D에서 실험을 수행에 대한 Asbjørn Nøhr-닐슨에 감사드립니다. 이 작품은 에이나르 윌럼슨 재단, 노보 노디스크 재단, 주훔 재단(모두 SFP)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2-(4-아미디노페닐)-1H-인돌-6-카르복사미딘 (DAPI)인비트로겐# C10595 핵 염색용
5-Fluorouracil (5-FU)Sigma-Aldrich#F6627화학요법 치료의 구성 요소
5-(N-에틸-이소프로필) 아밀로라이드(EIPA)Life Technologies#E3111
PARP 및 cPARP세포 신호#9542웨스턴 블로팅에 사용
Ki-67세포 신호#9449IHC
에 사용p53세포 신호에 대한 항체 #2524 IHC에 사용
β-actin Sigma에 대한 항체 A5441웨스턴 블로팅에 사용
BactoagarBD Bioscience#214010아가로스 겔 준비에 사용
벤치마크 단백질 사다리Invitrogen#10747-012SDS-PAGE
Bio-Rad DC 단백질 분석 키트Bio-Rad Laboratories#500-0113, #500-0114, #500-0115   용해물에서 단백질 측정에 사용
Bü rker 챔버Marienfeld610311세포 계수용 
BX63 에피플루오레센스 현미경Olympus형광 이미징에 사용되는
CellTiter-Glo 3D 세포 생존력 분석Promega#G9681세포 생존력 분석
CisplatinSigma-Aldrich에 사용됩니다#P4394 화학요법 치료의 구성 요소
코닝 스페로이드 마이크로플레이트, 96 웰, 투명한 둥근 바닥이 있는 검은색,  초저 부착, 뚜껑 포함, 멸균Corning#4520발광 측정을 종점으로 하는 스페로이드 성장에 사용됩니다
Corning 96 웰, 투명한 둥근 바닥,  초저 부착성 마이크로 플레이트, 뚜껑 포함, 멸균Corning#7007발광 측정 없이 스페로이드 성장에 충분 종점으로 측정
기준 TGX 프리캐스트 겔Bio-Rad5671025SDS-PAGE에 사용
DoxorubicinAbcam#120629화학 요법 치료의 구성 요소
FLUOStar Optima Microplate 리더BMG Labtech발광 기록에 사용 
포름알데히드 VWR 화학 #9713.1000 세포 고정에 사용
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane MatrixGibco#A14132024°C 유지 & deg; C는 응고를 방지합니다. 프로토콜에서 rBM이라고 합니다.
열 비활성화 FBSSigma#F9665성장 매체용 세럼
ImageJNIHScientific 이미지 분석
Medim Uni-safe 케이스Medim Histotechnologie10-0114임베디드 스페로이드 저장용으로 사용
미니 프로테아제 억제제 칵테일 정제Roche Diagnostics GmBH # 11836153001용해 버퍼 준비에 사용됩니다
MZ16 현미경Leica광학 현미경 이미지에 사용됩니다
NuPAGE LDS 4x 샘플 버퍼 Invitrogen#NP0007웨스턴 블로팅에 사용
Pierce ECL 웨스턴 블로팅 기질Thermo scientific#32106웨스턴 블로팅에 사용
Ponceau SSigma-Aldrich#P7170-1L단백질 밴드 염색에 사용
Prism 6.0GraphpadScientific 그래프 및 통계 소프트웨어
Propidium iodide(물 속 1mg/ml 용액)인비트로젠 P3566감광성 
멸균 저장소, 다채널SPL lifesciences21002스페로이드 형성을 위한 세포 파종에 사용
Superfrost Ultra-Plus 접착 슬라이드 멘젤-Gl ä ser#J3800AMNZ끼워넣는 데 사용되는 현미경 유리 슬라이드
#T5648화학 요법 처리로 사용되는
트랜스 블롯 터보 0.2 &마이크로; m 니트로셀룰로오스 막Bio-Rad#170-4159웨스턴 블로팅
Tris/Glycine/SDS 러닝 버퍼에 사용 바이오 라드 #161 0732SDS-PAGE
트립신-EDTA 용액Sigma에 사용#T4174 세포 해리 효소
에 대한 NHE1 항체 억제제에 대한 항체. . 는 . Tamoxifen Sigma-Aldrich를

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