출혈 성 뇌졸중의 병리학 적 결과를 연구 하기 위해 제 브라 피시 애벌레 사용

뇌 내 출혈 (ICH)은 자발적인 대뇌 혈관 파열과 관련 되었던 치기의 가장 가혹한 하위 유형 및 뇌 손상, 신체 장애 및 수시로 죽음¹에 지도 하는 실질로 출혈입니다. 무형 유산²와 관련 된 높은 사망률 및 발병 률에도 불구 하 고, 언더 피닝 병 인 및 출혈 후 병리학의 이해는 여전히 결여 되어 있다. 따라서, 무형 유산을 예방 하거나 환자 결과를 개선 하기 위한 특별 한 치료법이 없습니다. 질병 생물학에 대 한 우리의 이해의 대부분은 ICH의 전 임상 설치류 모델에서 왔다³, 그러나 연구-이 모델에서 날짜는 클리닉에 어떤 성공적인 치료를 번역 하지 못했습니다^4,5. 이 실패는 부분적으로, 포유류에서 모형을 생성 하는 침략 적인 수술을 위한 인간적 인 질병 및 요구 사항의 자발적인 본질을 쉽게 탈환 하는 무 능력을 포함 하 여, 이들 전 임상 모델의 몇몇 한계에 기인 할 수 있다⁶. 또한, 설치류는 온전한 조직에서 무형 유산에 대 한 세포 반응의 급속 한 발병을 관찰 하는 것과 관련 하 여 실질적인 문제를 제기 한다. 설치류 모델에서 번역의 부족을 감안할 때, 자연 무형의 대체 모델을 개발 하는 것은 우리가 이러한 실제적인 문제를 극복 하 고 새로운 약물 표적을 식별 하는 데 도움이 되는 경우에 필수적 이다.

혈관 발달의 분자 기전은 제 브라 피시 (danio 재기록)⁷을 포함 하 여 척추 동물 사이에서 잘 보존 됩니다. 이와 같이,이 모형 유기 체의 채택은 뇌혈관 질환⁸을 공부 하기를 위한 지금까지 더 유용한 기계화 전략이 되 고 있습니다. 뇌졸중 관련 조건^{9, 10},¹²와 관련 된 표현 형을 탈환 하는 다양 한 zebrafish 모델이 생성 되었습니다. 질병 병 인을 조사 하기 위해 zebrafish 애벌레의 사용은 포유류 모델⁸보다 실용적이 고 과학적인 이점을 제공 합니다. 여기에는 설치류와 관련 된 침 습 적 제약 없이 생체 내 이미징이 가능한 높은 재생 속도, 급속 한 개발 및 애벌레 투명성이 포함 됩니다. 이러한 장점을 다양 한 유전자 변형 리포터 라인과 결합 하 여 제 브라 피시 연구 공동체 내에서 사용할 수 있는 것은 질병 생물학을 연구 하기 위한 강력한 생체 내 접근법으로 서, 아직 병리학 적 연구에 활용 되지 이는 무형 유산의 결과 이다.

뇌의 혈액에 대 한 부상 반응은 복 상¹³; 1 차적인 모욕은 선천적인 면역 활성화에 의해 유도 되는 손상의 이차 물결을 시작 하는 신경 죽음과 세포 괴 사를 일으키는 원인이 됩니다. 뇌 손상, 특히 신경 염증 성분의 두 번째 단계는 미래의 약물 치료¹³에 대 한 현실적인 대상으로 간주 됩니다. 자발적 및 대뇌 특이 적 출혈는 제 브라 피시 애벌레에 앞서^14,15,¹⁶,¹⁷,¹⁸에 기술 되었다. 이러한 두 가지 모델은 HMGCR 통로 및 콜레스테롤 생 합성¹⁴를 저해 하는 24 시간 후 시비 (hpf)에서 아 토르 바 스타 틴 (ATV)을 사용 하 고, arhgef7 유전자에서의 저 혈당 돌연변이를 발현 하는 버블 헤드 (bbh) 돌연변이, β 픽스, 이어서 단단한 혈관 내 접합부에 대 한 액 틴 리 모델링을 억제 한다 (¹⁸). 이 모형은 순환의 개시에서 자발적인 대뇌 특정 혈관 파열을 전시 합니다 (~ 33 hpf). 최근, 우리는 뇌 손상 반응의 주요 측면이 인간과 zebrafish 애벌레 (²⁰) 사이에 보존 되는 것을 공개 하기 위해 이러한 모델을 특징으로 한다. 이 연구는 zebrafish 애벌레에 있는 자발적인 두뇌 출혈 및 뇌 손상을 정량화 하는 방법, 그리고 인간 상태와 관련 있는 운동 및 신경 염증 표현 형을 획득 하 고 시각화 하는 데 필요한 방법론을 보여줍니다. 이러한 데이터 및 기술은 임상 전 무형 유산 연구를 위한 가치 있는 보완적인 시스템으로 서이 모델 종의 사용을 지원 한다.

제 브라 피쉬는 앞서 설명한²¹과 같이 표준 조건 하에서 맨체스터 대학교 생물학 서비스 장치에서 모금 및 유지 되었다. 성인 제 브라 어 축산은 맨체스터 대학교 동물 복지 및 윤리 검토 위원회의 승인을 받았습니다. 모든 실험은 영국 본사 규정 (PPL: P132EB6D7)에 따라 수행 하였다.

참고: 본 연구에서 사용 된 형질 전환 라인은 대 식 세포 특이 적 계보 mpeg1를 포함 한다 :mcherry (앞서 설명 된 바와 같이 건축 된²²), 호 중구 특이 적 mpo:GFP²³,적혈구 별 gata1: dsred²⁴ 및 유비 크:야생 형, 감아 (mitfa^w2/w2 ) 및 돌연변이 (bbh^m292) 배경에서 세포 사 멸을 위한 리포터 (하우스²⁵에서 다시 유래). 그림 1 은 실험 일정을 보여 줍니다.

그림 1 : 뇌 손상, 운동 및 신경 염증 결과를 특성화 하는 실험적인 타임 라인의 그래픽. 무형 유산, 뇌 내 출혈; bbh, 버블 헤드. 그림은 크리에이티브 커먼즈 라이센스 하에서 허가와 함께 Crilly 외²⁰ 에서 재현 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

1. 일 0: 계란의 생산과 수집

1. 1 남성과 1-2 여성 성인 제 브라 피시에서 생산 된 사육 상자에서 자연 산란에서 수정 된 배아를 수집 합니다.
   참고: 아 토르 바 스타 틴 프로토콜의 경우 모든 와일드 타입/형질 전환 동물을 사용할 수 있지만 출혈 비율은 균 주 사이에 약간 다릅니다.
2. 표준 E3 배아에 28 ° c에서 100 배아를 배양 하 고 표준 지침²⁶에 따라 페 트리 디쉬 및 스테이지 당 배지.
3. ~ 6 시간 후에 포스트 시비 (hpf)는 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 접시에서 죽은 것과 수정 되지 않은 배아를 제거 합니다.

2. 일 1:24 hpf 아 토르 바 스타 틴 처리

1. 날카로운 초박형 해 부 집게 (²⁷)를 이용한 아 토르 바 스타 틴 처리를 위한 Dechorionate 배아. 실험에 필요한 숫자는 그에 따라 조정할 수 있습니다.
2. 2 개의 깨끗 한 배양 접시에 30 mL의 E3 배아 배지를 추가 합니다. 100 배아에 한 접시를 사용 하십시오.
   참고: 플레이트가 세포 배양을 위해 설계 된 경우,이 초기 단계에서 dechor이온화 된 zebrafish는 종종 바닥에 달라 붙어 있습니다. 이를 방지 하려면 사용 하기 전에 깨끗 한 물에 접시를 철저히 헹 궈 주십시오.
3. 치료 판에서 60 µ L의 배아 수를 제거 하 고 0.5 mM 아 토르 바 스타 틴 (ATV) 60 µ L을 추가 하십시오. 0.5 mM의 스톡 농도에서, 상기 희석은 1 µ의 최종 농도가 되 고이는 유 충 비 hemorrhaged 및 ~ 80%의 유 충 hemorrhaged (ICH +)의 20%를 초래할 것 이다. 처리 되지 않은 컨트롤에 다른 플레이트 사용
   참고: 아 토르 바 스타 틴은 증류수에 가용 화 (3mg을 10ml로) 0.5 mM의 원 액을 만든다. 가용 화는 다소 시간이 소요 되므로, 어두운 곳에서 실 온에서 밤새 배양 하 여 교 반을 한다. 완전 한 가용 화는 최대 1 주일까지 걸릴 수 있습니다. DMSO를 사용 하지 마십시오. 용액은-20°c에서 살 리 되 고 저장 된다. 동결 해제 하지 마십시오.
4. 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여, 치료 판에 가능한 한 적은 물로 100 배아를 이송 한다.
5. 28 ° c에서 플레이트를 배양 합니다.
   참고: ICH는 33과 48 hpf 사이에서 발생 합니다. 아 토르 바 스타 틴은 24 시간 이상 인큐베이션 함에 따라 제거 될 필요가 없으므로 추가적인 개발 문제가 발생 하지 않는다.

3. 둘째 날: 무형 유산과 무형 문화 유산과 인구를 분리 하는 50 hpf

1. Ich + 물고기를 무형 문화 유산으로 구분 하 고 새로운 요리로 쉽게 옮겨 보세요.
   1. ATV 모델을 1 µ M의 농도로 사용 하는 경우, 애벌레의 75-100%가이 시점에서 출혈 (ICH +)을 나타낼 것 이다.
      참고: 애벌레가 원하는 주파수에서 출혈 않으면, 아 토르 바 스타 틴 또는 더 높은 농도의 신선한 배치를 사용 하는 경우 유 충의 반응은 균 주 사이에서 다릅니다. 애벌레가 48 hpf에의 한 출혈을 나타내지 않았다면 그 (것) 들을 ICH를 고려 하십시오.
   2. Bbh 모델을 사용 하는 경우, 모든 동형 접합 체 돌연변이는 48 hpf에의 한 출혈을 나타낼 것 이다. 이종 접합 체를 사용 하는 경우, ICH-헤 테로 접합 및 야생 형 형제는 실험을 위한 대조 군 동물로 서 사용 될 수 있다.
2. 필요한 경우, 마 취는 E3 미디어에 0.02% MS222를 추가 하 여 애벌레를 유 충 합니다. 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 머리에 혈액이 존재 하는 애벌레를 신선한 E3 매체로 분류 하십시오. 그림 2를 참조 하십시오.
   주의: 머리 속의 혈액은 전방, 중 또는 후 뇌 또는 조합으로 나타날 수 있으며 출혈 량은 동물 마다 다를 수 있습니다. Bbh 돌연변이 체에서는, ICH는 수시로 큰 머리에 의해 인식 되는 가혹한 부 종, 눈 사이 더 넓은 공간 및 더 많은 확산 출혈과 연관 됩니다. 그러나 모든 무형 유산 + bbh 유 충은 부 종을 나타낸다.

그림 2 : 무형 유산 + 뇌 출혈 표현 형. 형질 전환 gata1에 유지 되는 애벌레 무형의 표현 형의 예: dsred 리포터 감아 배경 (상단 패널) 및 형광 (상부 패널)에서 ~ 48 h 후 시비를 관찰 하였다. 무형 유산 유 충 (왼쪽 패널)에서는 어떠한 출혈 관찰 되지 않았다. 뇌와 뇌 (화살)에 있는 적혈구의 뚜렷한 축적은 무형 유산 + 애벌레 (우측 패널)에서 관찰 되었다. 축척 막대는 250 µm를 나타냅니다. 그림은 크리이 엣 알²⁰ 에서 크리에이티브 커먼즈 라이센스 하에 허가를 받은 상태에서 재현 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

4. 셋째 날: 72 hpf에서의 세포 사 멸 및 백혈구 분석

1. 형광 현미경을 이용 하 여 애벌레를 스크린 하 여 형광체 단백질의 발현을 보장 한다.
   참고: 본 연구에서, 형질 전환 유비크: Sec부록-mvenus 유 충은 뇌 세포 사 멸 및 이중 형질 전환 mpo를 보고 하는데 사용 되었다: GFP; mpeg1: 엠 체리 또는 유비. mpeg1: 엠 체리는 백혈구 분석에 사용 됩니다.
2. 0.02% MS222을 포함 하는 E3 미디어로 라이트 시트 장착 챔버를 채웁니다.
3. 마 취는 0.02% MS222를 사용 하 여 애벌레를 유 충 합니다. 단일 액 적으로 건조 된 배양 접시 표면에 설치 (n=1-6) 하기 위한 유 충을 이송 한다. 가능한 한 많은 액체를 제거 하십시오.
   참고: 1.5% 낮은 용융 아가 로스는 전자 렌지에 메 틸 렌 블루를 사용 하지 않고 10ml의 E3 배지에서 용 해 된 낮은 용융 아가 로스 0.15 g을 사용 하 여 제조 되며, 사용할 때까지 45 ° c에서 보관 합니다.
4. 1.5% 저 용융 아가 로스 (45 ° c 열 블록에 액체로 유지)를 애벌레에 추가 하 고 800 µm 장착 모 세관을 사용 하 여 애벌레를 먼저 머리 위로 그립니다. 위치가 정확 하지 않다면 애벌레는 아가 로스 로부터 추방 되어 다시 장착 될 수 있다. 라이트 시트 챔버에 삽입 하기 전에 모 세관을 식혀 둡니다.
   참고: 또는이 절차에는 공초점 현미경을 사용할 수 있습니다. 이를 위해 유 충은 유리 바닥 접시 위에 수평으로 아가 로스에 장착 되어야 합니다.
5. 아이 렌즈 (~ 300 µm) 사이에 z-스택 이미지를 획득 하 고 최대 강도 프로젝션 이미지를 처리 합니다.
   1. 총 형광 세포 수 및 총 강도 형광²⁰에 대해 수집 된 이미지에서 뇌 부위를 분석 합니다.
6. 18-24 h 이상의 다중 프로젝션 컴포지트의 타임 랩 스 비디오를 생성 하 여 백혈구 이동성 및 죽어가는 세포와의 상호 작용을 추적 합니다.
   참고: 장기 라이브 이미징이 수행 되는 경우, 하나의 애벌레만이 모 세관에 장착 됩니다.
7. 화상 진 찰이 완료 되 면 안락사 하는 4% MS222의 치명적인 과다 복용으로 장착 모 세관에서 애벌레를 추방 한다.

5. 셋째 날: 72 hpf에서 운동 성 분석을 위한 애벌레 선택

1. 마 취는 0.02% MS222를 가진 페 트리 접시에 있는 애벌레를 유 충 합니다.
2. 운동 성 분석을 위해 n = 24 애벌레를 무작위로 선택 하 고 신선한 E3 매체로 옮겨 동물이 마 취 로부터 회복 하도록 합니다.
   주:이 점에서 마 취 제는 잡기 쉬운 슬로우 수영 선수의 선택 바이어스를 제거 합니다.

6.3-5 일: 72, 96 및 120 hpf에서 운동 하는 것

1. 72 hpf에서 선택 된 유 충이 메 틸 렌 블루 없이 E3 매체로 선정 되었습니다.
   주: 3 dpf에서의 서 리는 유 충이 마 취 (> 1 시간)에서 회복 하기에 충분 한 시간을 허용 합니다.
2. 24 웰 플레이트의 웰 1 mL에 1 개의 애벌레를 피 펫을 이용 하 여 플레이트 한다.
   참고: 애벌레의 손상을 방지 하기 위해 피 펫 팁의 끝을 자릅니다. 플레이트 크기는 실험 설계에 따라 변경 될 수 있다.
3. 카메라 챔버에 플레이트를 적재 하 고 화이트 라이트 놀라게 루틴을 사용 하 여 10 분 동안 모션을 분석 하 여 자발적인 수영을 증가 시킵니다.
   참고: 수영 동작은 카메라 챔버 및 추적 소프트웨어 ( 재료 표참조)를 사용 하 여 추적 되었습니다.
4. 96 및 120 hpf에서 동일한 애벌레를 사용 하 여 실험을 반복 합니다. 분석 판의 개별 하우징에서 유 충을 페 트리 디쉬로 옮기고, 분석 사이에 28°c에서 배양 한다.
5. 분석 완료 시, 4% MS222의 치명적인 과다 복용으로 애벌레를 안락사 시킵니다.

형질 전환 유비 큐를 이용한 뇌 세포 사 멸의 평가: 세 넥 터-mvenus는 모든 무형 유산 유 충에 존재 하는 ATV와 bbh 모델에서 무형 유산 + 애벌레에서 죽어가는 세포의 확실 한 클러스터를 초래 한다 (그림 3). 클러스터는 96 hpf 전에 후퇴 합니다. 이미지 분석을 통해, 출혈은 뇌의 형광 신호의 총 강도에서 현저한 2 배 증가와 연관 되어, 표시 된 세포 사 멸을 나타냅니다.

신경 염증 반응은 ICH + 애벌레에서 두뇌에 있는 mpeg1 양성 대 식 세포의 수를 현저 하 게 증가 시켜 서 확인 됩니다. 총 mpo 포지티브 호 중구 세포의 수 또한 증가 하지만 통계적 유의 성은 도달 하지 않았다 (도 4). Mpeg1 양성 대 식 세포의 형태학은 또한 세포가 활동적인 둥근, 아메바 모양 모양을 채택 하기 때문에 무형 유산 + 애벌레에서 변화 하는 것을 볼 수 있습니다. 이러한 활성화 된 둥근 세포는 또한 시간이 지남에 따라 모니터링 되어 유비의 증가 된 식 세포 반응을 보여주기 위해 있습니다 :무형 유산 + 애벌레에서 죽어가는 셀을 표현 하는 sec부록 청구-Mvenus (그림 5). 야자수 과정을 나타내는 양성 대 식 세포 mpeg1 는 비활성으로 분류 되었다.

뇌 출혈은 bbh 및 ATV 모델 모두에서 ICH 형제 컨트롤과 비교 하 여 72 및 96 hpf의 운동 성 유의 한 감소와 관련이 있습니다 (그림 6). 120 hpf의 운동 성이 근처의 기준선 수준으로 회복 됩니다. 달걀 클러치와 균 주 사이의 기준선 운동 성에는 종종 차이가 있으므로 매번 ICH를 제어 해야 합니다.

그림 3 : 제 브라 피시 애벌레의 뇌 내 출혈 (ICH)이 정량적 인 뇌 손상을 초래 합니다. 72HPF의 무형 유산 형제 (왼쪽 패널)와 비교 하 여 무형 유산 + 애벌레 (우측 패널)의 뇌 손상 표현 형의 대표 이미지. 명시 야 이미지 (하단 패널, 스케일 바 = 250 µm)는 무형 유산 + 애벌레의 뇌 출혈 (화살)의 존재를 보여줍니다. 형광 현미경은 유비 크에 세포 사를 가시화 하기 위해 수행 되었다 :sec부록-mvenus 리포터 라인 (상단 패널, 스케일 바 = 100 µm). 죽어가는 세포의 군집은 peri-헤 마로 알 영역에서 관찰 되었다. 이미지는 뇌 전용 영역으로 잘리고 보조 파일 1에서 매크로를 사용 하 여 지름 30 픽셀 보다 큰 원형 입자의 총 녹색 형광 강도 (흰색 선)를 분석 했습니다. (B) ATV 모델을 통해 얻은 비 처리 된 무형 유산 및 무형 유 충의 뇌에서의 형광 신호의 정량화는 72 hpf에서 3 개의 독립적 복제). ICH +를 치료 하지 않은 것과 비교 했을 때 유의 0.03 한 차이를 관찰 하였다 (* * p = 0.004). (C) 상기 버블 헤드 (bbh) 모델을 통해 얻어진 엔 다 인 및 무형 유산의 두뇌에서의 부록에 결합을 위한 판독으로 서 형광 신호의 정량화는 72 hpf에서 2 개의 독립 복제). 그래프는 평균에서 SD를 보여줍니다. MVenus 형광의 현저한 차이는 무형 유산 +와 무형 유산에 부합 하는 형제 (* * 0.002) 사이에서 관찰 되었다. 그림은 크리에이티브 커먼즈 라이센스 하에서 허가와 함께 Crilly 외20 에서 재현 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4 : 뇌 내 출혈 (ICH)은 제 브라 피시 애벌레 두뇌에서 타고 난 세포 면역 반응을 시작 합니다. 백혈구의 수는 이전에 mpo에 대해 설명 된 뇌 영역 내에서 정량화: GFP; mpeg1: dsRed 이중 형질 전환 애벌레 (2 개의 독립 복제)에서 72 hpf는 대 식 세포 (* p = 0.01)에서 현저한 증가를 밝혀 주지만 호 중구 (p = 0.5), 무형 유산에 대 한 대응 그림은 크리에이티브 커먼즈 라이센스 하에서 허가와 함께 Crilly 외20 에서 재현 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

그림 5 : 활성화 된 대 식 세포는 뇌 병 변에 대 한 포식 반응을 보여준다. (A) 대표 타임 랩 스 스틸 (야자수)은 부록 긍정 세포 (아이 vi)로 이동 하는 대 식 세포를 나타낸 것 이다. 스틸은 20 배 대물 렌즈를 사용 하 여 전체 뇌를 촬영 한 일련의 이미지에서 얻습니다. 축척 막대는 50 µm을 나타냅니다. 대 식 세포는 부록 양성 세포 (vi, vii)를 포식 하기 전에 아메바 형태 (v)를 획득 하였다. 포식 후에 대 식 세포는 야자수 형태학을 재개 하 고 합병 하 고 부록 긍정 세포는 더 이상 볼 수 없습니다 (viii). 야자수 대 식 세포 (#), 아 넥 Inv 양성 세포 (화살표), 아메바 대 식 세포 (*)가 지시 되어 있다. (B) mpeg1의 양성 세포 및 무형 유산 및 야자수 형태학을 나타내는 ich + 라 발 뇌의 대표 이미지. 축척 막대는 50 µm을 나타냅니다. (C) 무형 유산과 비교 하 여 야자수 뇌에서 대 식 세포의 증가 된 비중 및 감소 된 비율이 관찰 되었다. 그림은 크리에이티브 커먼즈 라이센스 하에서 허가와 함께 Crilly 외20 에서 재현 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

그림 6 : 무형 유산 유발 뇌 손상은 제 브라 피시 애벌레에서 정량 운동 적자를 초래 한다. (A) 무형 유산 및 72, 96 및 120 HPF에서 ich + bbh 유 충의 대표적인 수영 트랙 예 (B) 무형 유산 + 유 충은 72 및 96 hpf 모두에서 10 분 기록 기간 동안 이동에 소요 되는 누적 시간을 현저히 감소 시켰다. 120 hpf 시점에서의 유의 성은 손실 되어 뇌 손상 으로부터 회복을 잠재적으로 암시 합니다 (그룹 당 n = 24 애벌레; 3 개의 독립 된 0.003 0.00006 복제를 0.08 수행 합니다. (C) 120 hpf에서 무 치료 및 ATV 처리 된 ICH 및 ich + 애벌레에서 이동 하는 데 소요 되는 누적 시간의 정량화. 무형 유산 + 유 충은 10 분 기록 기간 동안 모바일에 소요 되는 누적 시간의 현저한 감소를 나타냈다. 3 개의 기술 복제 (그룹 당 n = 24 애벌레)를 사용 하 여 0.0003 0.00004 평균에서 SD를 계산 하였다. 그림은 크리에이티브 커먼즈 라이센스 하에서 허가와 함께 Crilly 외20 에서 재현 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

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