여기에서 우리는 크리켓 계란을 주입하는 프로토콜을 제시, 크리켓의 많은 실험에서 기초 방법 역할을하는 기술, 포함하되 이에 국한되지 않음, RNA 간섭 및 게놈 조작.
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이 논문에서
요약
초록
개발 유기체에서 유전자 기능을 변경하는 것은 다양한 종류의 실험의 중심입니다. 엄청나게 강력한 유전 공구가 전통적인 모형 시스템에서 개발되는 동안, 대부분의 그밖 유기체에 있는 유전자 또는 메신저 RNA (mRNA)를 조작하는 것은 어렵습니다. 동시에, 진화및 비교 접근법은 많은 다른 종에 있는 유전자 기능의 탐사에 의존합니다, 현재 유전으로 견인할 수 있는 외부 표현을 조작하기 위한 기술의 발달 그리고 적응을 필요로 합니다 종. 이 프로토콜은 배아 또는 애벌레 발달에 주어진 조작의 효력을 분석하기 위하여 크리켓 계란으로 시약을 주입하는 방법을 기술합니다. 벨바늘로 계란을 수집하고 주입하는 방법에 대한 지침이 설명되어 있습니다. 이 비교적 간단한 기술은 유연하고 잠재적으로 다른 곤충에 적응할 수 있습니다. 하나는 수집하고 하나의 실험에 계란 수십 주입 할 수 있습니다, 버퍼 전용 주사에 대한 생존율은 연습으로 개선하고 80 %로 높을 수 있습니다. 이 기술은 약리학 에이전트의 주입을 포함하여 실험적인 접근의 몇몇 모형을 지원할 것입니다, 관심있는 유전자를 표현하기 위하여 시험관 외에서 덮인 mRNA, RNA 간섭을 달성하기 위하여 이중 좌초된 RNA (dsRNA), 군집된 정규의 사용 CRISPR 관련 단백질 9(Cas9) 시약과 함께 협착한 짧은 팔린드로믹 반복(CRISPR) 및 과도 또는 안정적인 형질전환 라인을 생성하기 위한 트랜스포저 블론트.
서론
유기체에서 게놈을 수정하거나 유전자 발현에 영향을 미치는 능력은 기능적 인과관계를 테스트하는 많은 유형의 실험설계의 기초가 된다. 또한 전통적인 유전 실험실 동물 모델 시스템(예: Mus musculus,Danio) 외부의 유기체에서 게놈 및 비게놈 변형 기술을 사용할 수 있는 비교 및 진화학적 관련 작업에도 중요합니다. rerio, 드로필라 멜라노가스터,그리고 케노하브디티스 예쁜꼬마선충). 생물다양성1을 이해하려는 욕구이든, 크로의 원리를 고수하는 것이든, 모든 생물학적 질문에 대해 그 해결책2,3,게놈을 수정할 수 있는 능력에 가장 적합한 유기체가 있다는 것입니다. 현대 실험 설계에 필수적인 유전자 발현에 영향을 미칩니다.
크리켓 그릴루스 바이마쿨라투스는 신흥 모델 시스템입니다. 신경과 실험 4에서 지난 세기동안 사용, 지난 2 년 은 특히이 유기체의 진화와 개발에 초점을 맞춘 크리켓에 대한 증가 된 실험적 관심을 목격했다5. ....
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프로토콜
1. 하드웨어 설정 및 재료 준비
참고: 솔루션, 시약 및 장비 세부 사항에 대한 준비는 표 1 및 재료 표를 참조하십시오.
- 계란을 보고 주사 바늘을 안내 하기 위해 해부 현미경을 설정 합니다. (그림1A는 형광이 장착된 해부 현미경을 나타낸다.) 형광 능력은 유리하지만 필요하지 않습니다.
- 주사 바늘을 제자리에 기동하기 위해 3축 마이크로조작기를 배치합니다(그림 1A).
- 소량의 재료를 주입하기 위해 튜브와 바늘 홀더가있는 마이크로인젝터를 설정합니다 (그림 1A). 선택적으로 그림에 표시되지 않는 풋 페달을 사용합니다.
- 3D 프린터 또는 레이저 조각기로원하는 패턴의 역인쇄를 통해 계란용 우물을 만들 수 있는 스탬프를 디자인하고 생성합니다(그림 1C).
참고: 표시된 3D 인쇄 샘플 스탬프는 4.5 cm x 5cm이며 128, 3cm x 1....
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결과
크리켓은 촉촉한 재료에 알을 쉽게 낳고, 습한 모래 나 먼지와 같은 적절한 재료를 제공하면 많은 수의 알을 낳도록 유도합니다. 이것은 크리켓이 깨끗한 모래에 놓인 8-10 h. 계란을 먼저 알 을 박탈하는 경우에 특히 효과적이다 쉽게 분리, 수집 (그림1B)주입을위한 사용자 정의 설계 계란 우물에 배치 (그림1C). 해부 현미경, 마이크로인젝터 및 마이크로매니퓰레이터(그림1A)는 다양한 물질로 개별 계란을 주입하는데 사용될 수 있다(도1D). 계란은 전방 후방 축을 따라 약 20-30 %에서 후방 끝 근처에 주입됩니다(그림1E). 이러한 차이는 종종 미묘하기 때문에 더 무딘 후방 말단으로부터 더 뾰족한 전방.......
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토론
이 기술의 두 가지 주요 과제는 최적의 바늘 크기와 생존력의 관련 문제입니다. 작은 바늘은 생존을 향상하지만, 좁은 루멘을 가진 바늘은 직장에서 모세 혈관의 더 큰 정도를 가지고, 이는 노른자가 막힘을 일으키는 바늘로 이동 할 가능성이 더 높습니다. 가장 좋은 경우에, 막힘은 단순히 다른 계란을 주입하거나 위에서 설명한 대로 바늘을 치워서 지울 수 있습니다. 노른자가 바늘에서 밀려나올 때까지 마이크로인젝터의 균형 압력을 높이려고 시도할 수도 있습니다. 이 기술의 또 다른 주요 과제는 생존력입니다. 우리의 손에, 실험적인 해결책으로 주입된 계란을 위한 생존율은 전형적으로 40그리고 80% 사이에서 입니다. 생존율은 이 기술을 배우기 시작하는 사람들을 위해 10%만큼 낮을 수 있지만 연습으로 향상될 것입니다. 위에서 설명한 바와 같이 부정적인 대조는 다양한 물질의 도입이 생존율을 낮출 수 있다는 점을 감안할때, 연구자들이 연습으로 생존율의 변화를 정확하게 평가하는 것이 중요하다(.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 프로젝트에 보고 된 연구는 기관 개발 상에 의해 지원되었다 (IDeA) 보조금 번호 P20GM10342에 따라 국립 보건원의 국립 연구소에서 HH3에, NSF 수상 번호 IOS-1257217에 CGE.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 형광 해부 현미경 | Leica | M165 FC | 체 현미경 |
| 용 외부 광원 | Leica | EL 6000 | |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | -액세서리에는 주사 바늘 홀더, 입력 호스(호스 커넥터 포함), AC 전원 코드, 풋 스위치, 실리콘 고무 개스킷- |
| mCherry 필터 큐브 | 가 포함될 수 있습니다.라이카 | M205FA/M165FC | mCherry 또는 이와 유사한 빨간색 염료용 필터 큐브는 |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301R | 마그네틱 스탠드와 함께 사용 (Narishige, Type GJ-8)마그네틱 |
| 스탠드 | Narishige | MMO-202ND | |
| 피펫 홀더 (바늘 홀더) | Narishige | HD-21 | |
| 마이크로 인젝터 | |||
| 에그 웰 스탬프 | 폴리 락틱 애씨드 열가소성 | ||
| 마이크로파 | 다양한 | ||
| 인큐베이터 또는 온도 조절실 | 다양한 | 온도 23.5-26 ° C가 필요합니다. | |
| 귀뚜라미 사료, | 다양한 | 고양이 사료 또는 생선 플레이크가 적절한 식품입니다. | |
| 귀뚜라미 물 | vairous | 물은 유리병에 담아 솜뭉치를 통해 귀뚜라미에게 줄 수 있습니다 | |
| 귀뚜라미 대피소 | 대피소 재료에는 구겨진 종이 타월 또는 달걀 상자가 포함될 수 있습니다 | ||
| 유리 모세관 | World Precision Instruments, Inc. | 품목 번호 1B100F-4 | Kwik-Fil™ 붕규산 유리 모세관, 길이 100mm, 내경 0.58mm, OD 1.0mm, 필라멘트 |
| 포함 마이크로피펫 풀러 | Flaming/Brown | 모델 P-97 | Sutter Instrument Co.에서 배포. |
| 베벨러/마이크로 그라인더 | Narishige | 모델 EG-45/EG-400 | EG-400 현미경 헤드 |
| 포함 페트리 접시 | CellTreat | 제품 코드 229693 | 90mm |
| Play Sand | Sandtastik Products Ltd. | B003U6QLVS | 화이트 플레이 샌드 |
| 아가로스 | 아메리칸 바이오 분석 | AB000972 | 아가로스 GPG/LE 초순수 |
| 계란 여과기: 엑스트라 파인 트윌 메쉬 스테인레스 스틸 원뿔 여과기 | 미국 주방 용품 | 모델 SS-C123 | 기공 크기는 0.5 - 1.0 mm 사이여야 합니다 |
| Ref 15070-063 | Pen Strep | 니실린 스트렙토마이신 | Gibco |
| Sipel Electronic SA | P3C-STD | Black 정전기 분산, 118 mm | |
| 주사기 필터, 25 mm 직경, 0.45 &마이크로; m | Nalgene | 725-2545 | 1 mL 주사기와 함께 사용 |
| , Tuberculin Slip Tip | Becton Dickinson | 309602 | 사기 필터와 함께 사용 주입 버퍼를 필터링하고, Luer-Lok 팁 주사기도 작동합니다. |
| 공기 탱크 (선택 사항) | Midwest Products | Air Works® | 휴대용 공기 탱크 |
| 로다민 염료 | Thermofisher | D-1817 | 덱스트란, 테트라메틸로다민 10,000MW,20 |
| mL 로딩 팁 | Eppendorf | 주문 번호 5242 956.003 | epT.I.P.S. 20 μ L 마이크로로더 |
| 복합 현미경 | Zeiss | Axioskope 2 plus | |
| 20x objective | Ziess | Plan-Apochromat 20x/0.75 M27 | |
| 카메라 | Leica | DMC 5400 | |
| Leica Application Suite 소프트웨어 | Leica | LAS | 버전 4.6.2 사용 |
참고문헌
- Abzhanov, A., et al. Are we there yet? Tracking the development of new model systems. Trends in Genetics. 24 (7), 353-360 (2008).
- Krebs, H. A. The Aug....
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