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방법 논문

허혈 재관류 손상의 설정에서 전이성 간 종양의 뮤린 모델

12.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/59748

⸱

2019년 8월 30일

 , 
1Department of Surgery, University of Pittsburgh

이 논문에서

요약

우리는 임상적으로 관련된 대장암 간 전이(CRLM) 종양 모델과 종양 성장 및 전이에서 간 허혈 재관류(I/R)의 영향을 상세히 기술한다. 이 모델은 간 전이성 성장의 수술 유발 승진의 근본적인 기계장치를 더 잘 이해하는 것을 도울 수 있습니다.

초록

간 허혈및 재관류 (I/R) 상해, 일반적인 임상 도전은, 다중 조직 및 기관 손상을 유도하기 위하여 보인 불가피한 병리생리학 프로세스남아 있습니다. 최근의 발전과 치료 접근법에도 불구하고, 전반적인 사망률은 근본적인 실치 이상을 가진 환자에서 특히 만족스럽지 않은 남아 있습니다. 공격적인 암 성장 및 전이의 맥락에서, 외과 I/R은 종양 재발을 통제하는 프로모터로 의심됩니다. 이 문서는 간 I/R 및 대장 간 전이의 임상적으로 관련 있는 뮤린 모델을 설명하는 것을 목표로 합니다. 이렇게, 우리는 더 나은 간 전이 촉진에 간 I/R의 효과 이해 하기 위해 그들의 일상적인 연구 연습에 대 한이 모델을 확립 하 고 완벽에 다른 조사자를 지원 하는 것을 목표로.

서론

간은 전이성 질병의 발달을 위한 일반적인 사이트의 한개 1. 사망률은 거의 변함없이 간에서 종양 성장과 관련된 합병증에 기인한다. 간에서 전이성 고형 종양을 가진 환자에서, 수술은 질병 통제및 가능한 치료 접근을 위한 결정적인 내정간섭남아 있습니다. 그러나, 환자의 대다수는 궁극적으로재발하는질병으로, 간2,3에서우세하게 제출합니다. 간 수술 중 수술 중 수술 중 출혈은 흔하며 혈관 클램핑 방법을 포함하여 출혈 을 조절하기 위한 수혈 및 다른 기술적 접근법이 필요합니다. 그러나, 이러한 조치는 간 조직에 간 허혈/재관류 (I/R)를 일으키는 원인이 됩니다. 간 세포 기능에 I/R의 불리 한 효과 잘 문서화 되었습니다. 간 I/R 모욕은 선동적인 통로를 통해서 혈류의회복 도중 선동적인 폭포를 점화합니다 4. 간 I/R 상해는 간 부전으로 기여할 뿐만 아니라, 현재의 증거는 I/R 손상이 종양 세포 부착을 자극하고, 기존 미세 전이성 질환의 전이 형성 및 성장의 발생을 촉진한다는 것을 보여줍니다5. 우리는 이전에 외과 적 스트레스가 1 차적인 종양의 성장에 도움뿐만 아니라, 순환 내의 암세포를 포착해서 전이를촉진하는 면역 세포의 활성화를 유도한다는 것을 보고했습니다 6.

여기서 우리는 간 전이를 확립하는 기술을 자세하게 기술한다. 이 모델에서, 우리는 또한 간 허혈 재관류 상해를 유도하는 방법을 제시하며 이는 간절제술 동안 임상적으로 존재하는 외과적 스트레스에 대리역할을 한다. 암 주사와 간 I/R의 결합된 방법은 1 차적인 종양 절제를 겪은 환자에 있는 CRLM의 발달을 성공적으로 해석할 수 있습니다.

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프로토콜

모든 동물 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 국립 보건원(NIH) 지침을 준수합니다. 모든 수술에 사용되는 기구는 철저하게 살균되었다.

1. 초기 준비

  1. 마우스 비장으로 암세포를 주입하기 전에, 절차 도중 이용되는 모든 기구를 autoclave 및 살균하십시오.
  2. 가열 패드, 수술 용 장갑, 거즈, 가위 쌍, 작은 클램프, 용기 확장기, 수술 집게 및 바늘 홀더를 살균 및 / 또는 오토 클레이브.
  3. 수술 후 진통제 (0.1 mg / kg의 부프레노르핀)를 비장 절제술 후 투여하고 2 일 동안 매 12 시간마다 투여 할 준비를하십시오.

2. 세포 배양

  1. 마이코플라즈마 ELISA 키트를 사용하여 암세포가 마이코플라즈마 오염으로부터 자유로이 제거되었는지 확인합니다.
  2. murine 대장암 세포(MC38)의 배양을 위해 4°C에서 DMEM(DMEM) 배양 배지의 500 mL 용액을 준비한다. 배양 매체는 10% 열 불활성화 태아 소 혈청 (FBS), 페니실린의 100 U/mL, 스트렙토 마이신의 100 μg/mL, HEPES 15 mM 및 L-글루타민 200 mM으로 보충되어야 합니다.
  3. 배양 암 세포는 DNAse-및 RNA제 프리 플라스크(75 cm2)에서. 5% CO2를 함유하는 세포/조직 가습 인큐베이터에서세포 배양을 배양한다. 온도를 37°C로 유지합니다.
  4. 증식 세포가 90-100 % 동률에 도달하면 오래된 매체를 흡인하고 1 x 인산 완충 식염수 (PBS)로 세포를 씻은 다음 1 x 트립신 (0.25 %)으로 치료하십시오. 플라스크에서 세포를 분리합니다.
  5. 700 x g에서 5 분 동안 15 mL 원엽 튜브와 원심 분리기에 세포를 수집합니다.
  6. 미디어를 흡인하고 반복된 원심분리에 의해 1x PBS로 2회 세척합니다.
  7. 트리판 블루 얼룩(0.4%)으로 세포를 염색하여 세포 생존가능성을 확인하였다.
  8. 1x PBS에서 1 x 106 세포/ 100 μL의 농도로 세포를 다시 일시 중단합니다. 배펫 셀은 덩어리를 피하기 위해 철저히. 주사 전에 얼음에 암세포를 유지.

3. 종양 세포 주입

  1. 케타민 (150 mg/kg)과 자일라진 (12 mg/kg)을 복강 내 로 투여하여 8-12 주 된 남성 (C57BL6) 마우스를 1 mL 25 G (0.5 mm x 16mm) 바늘을 사용하여 마취하십시오.
  2. 수술 후 감염을 피하기 위해 클리퍼를 사용하여 마우스의 복부 피부를 면도하십시오.
  3. 자기 고정기 철회 시스템에 마우스를 놓습니다. 마우스가 발가락이나 꼬리를 꼬집어 마취의 효과를 완전히 받고 있는지 확인하십시오.
  4. 시술 중에 건조함을 피하기 위해 식염수 방울을 눈에 넣으세요.
  5. 스크럽 포비도-요오드 용액 (7.5%) 수술 절개를하기 전에 피부를 소독하기 위해 면도 복벽에.
  6. 처음에 이빨집게 피부를 들어 올리고 수술용 가위를 통해 중간 선 절개를 합니다. 이어서, 복부 근육과 복막을 들어 올려 약 3 cm 길이의 중간 선 절개를 만듭니다 (복부 내용체를 노출하는 중복부에서 xiphoid 과정. 광범위한 출혈을 피하기 위해 xiphoid 과정을 넘어 절개를 확장하지 않도록주의하십시오.
  7. 절개의 양면과 xiphoid 프로세스 아래에 지혈을 놓습니다. 꼬리를 아래쪽으로 당기고 테이핑하여 복부를 확장합니다. 6인치 멸균 면 팁 어플리케이터를 사용하여 췌장 지방 조직에서 비장을 분리하고 노출시보입니다.
  8. 비장으로 주입하기 전에, 어떤 세포 덩어리를 피하기 위해 암세포를 소용돌이.
  9. 주사를 위해 0.5 mL 28 G (0.36 mm x 13 mm) 인슐린 주사기를 사용하십시오. 기포를 피하십시오.
  10. 천천히 조심스럽게 비장의 끝에 세포의 100 μL을 주입합니다. 면 팁을 놓고 복부 부위로의 역류를 피하기 위해 부드러운 압력을 가합니다. 성공적인 주사는 주사 중 간 색의 변화를 확인함으로써 관찰 될 수있다.
  11. 멸균 거즈를 1x PBS로 적시고 해부된 부위에 놓습니다.
  12. 암세포가 시스템 내에서 순환할 수 있도록 마우스를 가열 패드에 15분 동안 옮김을 옮김시다.
  13. 수술 허혈 및 재관류 부상을 진행하려면 5.3-5.10 단계를 따르십시오.
    참고: 이 절차는 전이성 정체의 I/R 유도된 확립의 효과를 연구하는 것입니다.

4. 비장 절제술

  1. 비장 절제술을 수행하려면 휴대용 소작 장치를 사용하십시오. 조심스럽게 부드러운 집게로 비장을 들어 올리고 과도한 출혈을 피하기 위해 비장 혈관을 소작하십시오. 소작 된 섹션에서 혈관을 전이하여 비장을 제거하십시오.
  2. 시술 직후, 먼저 근육층과 피부를 봉합하여 이중층 패턴으로 절개를 닫습니다. 복벽과 피부 모두에 4-0 폴리프로필렌 봉합사를 사용하십시오.
  3. 다른 동물의 시술을 반복하기 전에 70 % 이소 프로판올을 살포하거나 비드 목욕에 삽입하여 모든 악기를 소독하십시오.
  4. 마우스를 원래 의장에 다시 놓고 고민과 수술 후 통증의 징후를 찾습니다.
  5. 수술 후 진통제 (Buprenorphine 0.1 mg/kg)를 수술 후 통증을 피하기 위해 2 일 동안 12 시간마다 주입하십시오.

5. 허혈 재관류 부상

  1. 첫 번째 개복술 후 5 일에서 케타민 (150 mg / kg)과 자일라진 (12 mg / kg)을 1 mL 25 G (0.5 mm x 16 mm) 바늘을 사용하여 복강 내 투여하여 마우스를 마취시냅니다. 3.3-3.4 단계를 따릅니다.
  2. 스크럽 포비도-요오드 용액 (7.5%) 마우스의 면도 복부에 피부를 소독하고 단계 3.6에서 전술한 바와 같이 중간 선 개복절제술을 수행한다.
  3. 촉촉한 면 팁 두 개를 사용하여 충치에서 소장을 부드럽게 움직여 문정맥을 포함한 관련 구조를 노출시십시오. 주변 조직에서 간을 해부하십시오.
  4. 다이어프램에 대해 중앙분리대와 왼쪽 측면 로브를 들어 올립니다. 좌측 측엽으로부터 사분엽을 분리하여 작동 현미경을 사용하여 스프링 가위로 간을 해부하여 측문 트라이어드 구조에 대한 명확한 가시성을 허용한다.
  5. 중앙엽과 오른쪽 측면 엽 사이에 작은 촉촉한 면봉을 놓아 클램핑을 위한 충분한 공간을 만듭니다. 용기 확장기 집게를 사용하여 10cm 실 (4.0 폴리 프로필렌 봉합사)을 조심스럽게 통과하여 포털 트라이어드를 들어 올립니다. 포탈 트라이어드(간 동맥, 문맥 및 담관)의 모든 구조를 좌측 및 중간 간 엽에 고정된 마이크로 세정제 클램프 어플리케이터를 사용하여 미세 혈관 클램프를 배치하여 폐색한다.
  6. 로브가 현저한 희미해지지 않으면 제거하고 다시 적용하여 클램프를 다시 조정합니다.
    참고 : 클램프를 다시 조정 한 후에도 간이 즉시 희게되지 않으면 I / R을 진행할지 여부를 신중하게 고려하십시오.
  7. 중앙분리대와 오른쪽 측면 로브 사이에 놓인 작은 면봉을 제거합니다. 소장을 복강으로 부드럽게 교체하십시오. 축축한 거즈(1x PBS로 적신)로 복벽을 덮고 증발 손실을 최소화하기 위해 플라스틱 랩으로 덮습니다.
  8. 가열 패드에 마우스를 놓고 60 분 동안 클램프를 적용합니다.
  9. 허혈성 간격 내내, 오른쪽 내측 및 좌측 내측 엽및 측측엽의 창백한 희게를 시각화하여 허혈 손상의 증거를 찾으십시오.
  10. 60분 후 클램프를 제거하여 재관류를 시작합니다.
    참고: 재관류의 증거는 중앙분리대 및 좌측 측엽의 즉각적인 색상 변화에 의해 관찰될 수 있다.
  11. 재관류 직후, 먼저 근육 층과 피부를 봉합하여 이중 층 봉합 패턴으로 절개를 닫습니다. 4-0 폴리 프로필렌 봉합사를 바늘 홀더의 도움으로 사용하여 복벽과 피부를 닫습니다.
  12. 다른 동물의 시술을 반복하기 전에 70 % 이소 프로판올을 살포하거나 가열 된 비드 욕조에 삽입하여 모든 악기를 소독하십시오.
  13. 마우스를 원래 의장에 다시 놓고 고민과 수술 후 통증의 징후를 찾습니다.
  14. 수술 후 진통제 (0.1 mg/kg의 부프레노르핀)를 수술 후 통증을 피하기 위해 2 일 동안 12 시간마다 주입하십시오.
  15. 간 I/R 샴 마우스의 경우, 개복술, 릴럼 해부 및 복부 봉합사를 수행하십시오.
    참고: 간 전이의 확립에 영향을 미치는 외과 적 스트레스의 역할은 두 가지 다른 실험 설계를 통해 조사 될 수있다. 상기 프로토콜(Model-1)은 미세 전이성 간 질환을 확립하고 간 I/R이 그들의 성장에 미치는 영향을 연구하는 데 사용된다(도1A). 대안적으로, 간 I/R 및 종양 주사는 새로운 전이성 정체의 확립에 있는 I/R 상해의 효력을공부하기 위하여 동시에 수행될 수 있다(Model-2). 이렇게하려면, 위에서 설명한 대로 비장에 암세포를 주입하고 15 분 동안 순환 할 수 있도록. 간 I / R 또는 60 분 동안 순환 기간 후 sham 수술을 수행. 60 분 후 측면 비장 절제술을 수행한 다음 개복절장을 닫습니다.

6. 수술생 평가

  1. 외과 적 절차 동안 마우스는 palpebral 및 각막 반사 테스트를 수행하여 단계 III 마취의 영향을 받고 있는지 확인합니다. 추가 마취 용량은 반사 의 징후에 주어져야합니다.
  2. 수술 후 진통제 (Buprenorphine 0.1mg / kg)를 수술 직후에 제공하고 수술 후 통증을 피하기 위해 2 일 동안 매 12 시간마다 제공합니다.
  3. 마우스를 마취에서 회복 시간 30-60 분 허용. 지속적으로 마우스를 모니터링하고 완전한 회복까지 방치하지 마십시오.
  4. 뒤로 구부리고, 눈을 감고, 느리게 움직이며, 신랑을 하지 못하는 것과 같은 조난 징후를 찾아본다. 마우스가 정상 활동으로 돌아올 때까지 그에 따라 치료하십시오.
  5. 체액, 열, 자일라진에 대한 Yohimbine 반전 에이전트를 포함한 supplimental 케어, 부드러운 종이 타월 침구 (흡인을 피하기 위해) 회복 기간을 개선하기 위해 수술 후 제공되어야한다.

7. 간 허혈 재관류 손상의 평가

  1. 클램프를 적용 한 직후, 중앙분리대와 좌측 측엽의 창백한 희게가 카우데이트 및 쿼드 레이트 로브에 비해 발생하는지 확인하십시오.
  2. 혈청 알라닌 트랜스아미나제(sALT), 혈청 아스파르타테 트랜스아미나제(sAST) 및 혈청 젖산 탈수소효소(sLDH) 수준을 측정하여 간 허혈 손상을 평가합니다. 혈액은 재관류개시 후 3-6시간 동안 혈청을 추출하기 위해 안면 정맥에서 추출될 수 있다. 허혈성 엽 내의 백분율 종양 지역을 분석하기 위하여 간 조직학을 능력을 발휘합니다.

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결과

모든 야생형(C57BL6) 마우스(n=20)는 전술한 프로토콜을 사용하여 간 전이 모델을 행하였다. 허혈 재관류 손상유무에 관계없이 모든 주입 마우스는 희생날짜까지 살아남았다. 암 주사 된 간도 1A는 부분 간 허혈성 (70 %)을 유도하는 포털 트라이어드 (간 동맥, 문맥 및 담관)의 클램핑을 도시합니다. 중앙분리대 와 좌측 로브를 향해 모욕을 가합니다. 간 전이의 수의 증가는 허혈 재관류 손상 후 2-3 주 이내에 관찰 될 수 있습니다. MC38 암세포를 주사한 마우스는 무작위로 가짜 및 I/R 그룹으로 나누었다. 도 1B에도시된 바와 같이, 마우스의 첫 번째 그룹은 암 주사 후 15분 후에 비장절제술을 시행하였다. 간 허혈 재관류 수술은 주사 5일 후에 수행되었다. 이 모형은 순환하는 암세포 (CCs)가 기관 내의 설치하는 것을 허용합니다. 도 2A는 외과적 스트레...

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토론

이 원고에 설명된 동물 모델은 두 가지 주요 접근법을 기반으로 합니다. 첫 번째는 암세포가 간엽에서 국소화하고 증식하는 능력을 인식하는 것입니다. 두 번째는 종양 성장 및 전이에 영향을 미치는 간 허혈 재관류 손상의 효과를 연구하는 것이다. 이 모형은 면역 적격 마우스에 있는 이차 전이의 부재에 있는 간 전이의 관련 연구 결과를 허용합니다. 이 모델은 세포 생존 외설 및 증식과 같은 전이성 효율의 문제를 해결하는 데 유용합니다.

첫 번째 모델에서, 암세포는 먼저 주입되고 미세 전이성 질환이 형성될 수 있습니다. 그 후, 간 I/R은 5일 후에 수행된다. 이 모델은 이미 확립 된 미세 전이성 질환에 대한 수술의 효과를 연구 할 때 중요합니다. 화상 진찰이 지난 10년간 현저하게 향상되었지만, 화상 진찰에 의해 검출되지 않을 수 있고 치료의 의도로 계획된 간 절제술 후에 뒤에 남겨지는 micrometastatic 질병의 존재의 가능성은 아직도 있습니다. 이 잔여 현미경 질환은 수술,...

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공개 사항

저자는이 작품과 관련된 이해 상충을 공개하지 않습니다.

감사의 글

저자는 언어 개정사라 마네마이어와 알렉산더 코메시에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Dulbecco's Modified Eagle MediumLonza12-614F
소 태아 혈청Lonza900-108
L-글루타민Gibco25030-081
PenicilinFisher Scientific15-140-122
StretomysinFisher Scientific15-140-122
HEPESFisher Scientific
트립신하이클론sh30042.02
세포 배양 플라스크 75cm5 셀 스타658170
15ml PP 원뿔형 튜브BioExcell41021037
Trypan Blue StainGiibco15250-061
거즈Fisherbrand
CautryBovieAA01
미세 혈관 클램프Finescience 도구18055-03
잠금 장치가 있는 Micro-Serrefine 클램프 애플리케이터미세 과학 도구FST-18056-14
스프링 가위정밀 과학 도구FST-15021-15
혈관 확장기미세 과학 도구FST-00276-13
자기 고정기 수축 시스템미세 science tooslFST-18200020
Micro-Adson 겸자Fine science tooslFST-11019-12
Micro-Adson 겸자Fine science tooslFST-11018-12
4-0 폴리프로필렌 봉합EthiconK881H
바늘 홀더Harvard Apparatus72-8826
Heating PadFisher scientific
클리퍼Oster559A
포비돈-요오드 용액MedlineMDS093945
주사기 1ml 25GBD 안전 글라이드305903
인슐린 주사기 0.5 mlBD 인슐린 주사기32946
면 팁 애플리케이터Fisher Scientific23-400-101
수술 현미경LeicaLR92240
Mycoplasma Elisa KitRoche11663925910
Ketamine Putney#056344
XylazineNADA#139-236
ALT 스트립Heska15809554
AST 스트립Heska15809542
LDH 스트립Heska15809607
SH3023701 1376152 사 1443915

참고문헌

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