성인 마우스 숫자 절단 및 재생 : 포유류 블라스터 마 형성 및 intramembranous Ossification을 조사하는 간단한 모델

요약

여기에서, 우리는 형광 성 면역 조직 화학 및 순차적인 생체 내 마이크로 컴퓨터 단층 촬영에 의해 분석된 포유류 배반증 의 형성 및 intramembranous 골화를 조사하기 위하여 성숙한 마우스 말두 지골 절단의 프로토콜을 제시합니다.

초록

여기에서, 우리는 성인 마우스 말단 말두 지골 (P3) 절단의 프로토콜을 제시, 상형 재생의 절차적으로 간단하고 재현 가능한 포유류 모델, 이는 배반 형성및 분석 된 비정형 골화를 포함 형광 면역 조직 화학 및 순차적 인 생체 내 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (μCT). 포유류 재생은 말단 지골(P3)의 말단 영역을 경각시키는 절단으로 제한된다; 더 근위 수준에서 절단 된 숫자는 재생및 섬유 성 치유와 흉터 형성을 받아야하지 않습니다. 재생 반응은 증식 블라스트ema의 형성에 의해 매개되고, 절단 된 골격 길이를 복원하기 위해 intramembranous 골화를 통한 뼈 재생이 뒤따릅니다. P3 절단은 포유동물에서 의상 재생을 조사하는 전임상 모델이며, 성공적인 재생 반응으로 섬유성 치유를 대체하는 치료 전략의 설계를 위한 강력한 도구이다. 우리의 프로토콜은 1) 형광 면역 성 화학을 사용하여 1) 조기 및 후기 블라베ema 세포 집단을 식별하고, 2) 재생의 맥락에서 연구 revascularization, 3) 복잡한 뼈에 대한 필요없이 intramembranous 골화를 조사 안정화 장치. 우리는 또한 절단 후 형태 학적 변화를 검사할 뿐만 아니라 재생 과정에서 동일한 숫자의 볼륨과 길이 변화를 정량화하기 위해 고해상도 이미지를 만들기 위해 생체 내 μCT에서 순차적 사용을 입증합니다. 우리는 이 프로토콜이 포유류에서 에피소드및 조직 재생 반응을 조사하기 위해 엄청난 유용성을 제공한다고 믿습니다.

서론

포유동물은 인간 및 마우스를 포함하며, 말단 지골(P3)의 말단 절단 후 그들의 자릿수의 팁을 재생할 수 있는 능력을 가지며,^2,3. 마우스에서, 재생 반응은 절단 수준 의존; 점점 근위 수 자릿수 절단P3 네일 매트릭스^4,5,6에 절단 시절단에서 완전한 재생 실패까지 점진적으로 감쇠 재생 반응을 표시 ^{, 7명 , 8.}P3 재생은 절단된 구조물을 재생하기 위해 형태 형성을 겪는 증식 세포의 집단으로서 정의되는 블라스마의 형성에 의해 매개된다^9. 절단에 의해 손실 된 구조를 재생하는 블라스테마의 형성, 프로세스 는 상형 재생이라고, 부상 후 기존의 조직 수리에서 다조직 수준의 P3 재생 반응을 구별^{6, ....}

프로토콜

모든 동물 사용 및 기술은 텍사스 A&M 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 표준 운영 절차를 준수했습니다.

1. 성인 마우스 뒷다리 말단 P3 절단

1. 산소에 이소플루란 가스를 사용하여 8~ 12주령 CD-1마우스(물자표)를 마취; 처음에는 챔버에서 3 %에서 마취되고 수술 기간 동안 2 %의 이소플루란이 코콘에 의해 공급됩니다. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 눈에 안과 연고를 적용하십시오.
   참고: 우리의 실험실에서 표준화된 성인 P3 절단 연구는 8 에서 12 주 된 마우스에 수행되고, 재생 반응은 모든 시험된 긴장에서 보존됩니다.
2. 10 x 해부 현미경으로 수술용 포비도 요오드와 70 % 에탄올로 뒷다리의 숫자를 살균하십시오. 마이크로 가위를 사용하여 수술 부위에서 머리카락을 다듬습니다. 국소 부피바카인 1 μL을 국소로 바르고 수술 부위를 마취시다.
3. 멸균 #10 메스를 사용하여 각 뒷다리의 자리 2 및 4에 말단 지골(P3)의 말단 끝을 절단한다(도1A). 절단은 수술 기구의 살균을 포함하여 무균 조건하에서 수행되어야합니다. 해부 현미경 아래에서 뒷발을 부드럽....

결과

6/7 DPA(그림 2A-D), 9DPA(그림 2E-H) 및 10DPA(그림2I-L)에서P3 자릿수를 재생성 마우스를 렌x2, OSX 및 PCNA에 대한 항체로 면역으로 염색하여 인화골을 시각화하였다. 재생, 및 VWF에 대한 항체로 면역을 염색하여 blastema 형성을 시각화합니다. 절단 전 및 재생 과정에 걸쳐 다양한 시점에서 스캔된 자릿수의 대표적인 μCT 렌더링(그림3A,B) 및 길이 측정을 식별하는 데 사용되는 랜드마크식별(그림3B)은 또한 도시됩니다.

토론

이 프로토콜은 성인 마우스 말단 P3 절단, 형광 면역 조직 화학 염색의 표준화 된 절차를 설명하여 블라스트마 형성 및 비변형 골화를 시각화하고 조사하고, 순차적으로 생체 내 μCT 스캐닝을 절단 후 골형태, 부피 및 길이 변경을 식별합니다. P3 절단은 blastema 대형을 유발하는 재생 성 상처 환경을 분석하는 독특하고 절차적으로 간단하고 재현 가능한 모델입니다. 또한, P3 자리 모델은 기존의 뼈 부상 모델에 비해 많은 장점을 제공하여 intramembranous 골화를 조사합니다.

이 프로토콜의 성공을 보장하려면 완전한 숫자 디칼화를 수행해야 합니다. 숫자가 완전히 탈석되지 않은 경우, 단면화 과정에서 무너지고 파쇄됩니다. 추가적으로, 열 회수 면역 조직 화학은 조직이 약간 분리되거나 슬라이드에서 완전히 빠질 수 있다는 점에서 문제가 될 수 있습니다. 이 문제를 완화하기 위해, 샘플은 조직 접착제로 보충 된 물 욕조를 사용하여 접착제 슬라이드에 장착해야뿐만 아니라 사용하.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
단백질 블록 세럼 무료	DAKO	X0909	즉시 사용 마우스
항 PCNA 항체	Abcam	ab29	1:2000 희석
쥐 항 CXCR4 항체	R & D Systems	MAB21651	1:500 희석
Rabbit anti-human vWF XIII 항체	DAKO	A0082	1:800 희석
Rabbit anti-osterix, SP7 항체	Abcam	ab22552	1:400 희석
Rabbit anti-Runx2 항체	Sigma-Aldrich Co.	HPA022040	1:250 희석
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A21235	1:500 dilution
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A11008	1:500 dilution
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)	Invitrogen	A11077	1:500 dilution
Prolong Gold antifade reagent	Invitrogen	P36930	Ready to use
Surgipath Decalicifier 1	Leica Biosystems	3800400	Ready to
use Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative	Anatech LTD	174	Ready to use
CD-1 Female Mouse	Envigo	ICR(CD-1)	8-12-weeks-old
vivaCT 40	SCANCO Medical