텔 레 Ost 뇌와 뇌 하 수 체에 있는 혈관의 라벨링은 DiI와 함께 심장 관류를 사용 하 여

요약

이 기사에서는 픽스 쳐에 희석 한 DiI의 심장 관류에 의해 텔 레 ost 물고기의 혈관을 라벨링 하기 위한 빠른 프로토콜을 설명 하고, 송사리를 모델로 하 고 뇌 및 뇌 하 수 체 조직에 초점을 맞추고 있습니다.

초록

혈관은 척추 동물의 모든 조직을 자극 하 여 필요한 영양분, 산소 및 호르몬 신호를 제공 함으로써 생존을 가능 하 게 합니다. 그것은 개발 하는 동안 작동을 시작 하는 첫 번째 장기 중 하나입니다. 혈관 형성의 메커니즘은 높은 과학적 및 임상 관심의 대상이 되고있다. 그러나 성인의 경우 다른 조직 내에서 자신의 국 소화로 인해 대부분의 살아있는 동물에서 혈관 구조를 시각화 하는 것은 어렵습니다. 그럼에도 불구 하 고, 혈관의 시각화는 내 인 성 및 신경 생물학과 같은 여러 연구에 중요 한 남아 있다. 몇몇 형질 전환 선은 제 브라 피쉬에서 개발 되었지만, 혈관이 형광 단백질의 발현을 통해 직접적으로 가시화 되는 반면, 다른 텔 레 ost 종에는 그러한 도구가 존재 하지 않습니다. 모델으로 서 송사리를 사용 하 여, 현재 프로토콜은 신속 하 고 직접적인 기술을 제공 하 여 뇌와 뇌 하 수 체에 혈관을 레이블 고정을 포함 하 여 심장 통해 사용 하 여. 이 프로토콜은 뇌와 뇌 하 수 체 세포가 전체 조직 또는 두꺼운 조직 조각에서 혈액 맥 관 구조와 상호 작용 하는 방법에 대 한 우리의 이해의 향상을 허용.

서론

그들은 모든 기관에 필요한 영양소, 산소와 호르몬 신호를 제공으로 혈관은 척추 동물 body의 필수적인 부분을 재생 합니다. 또한, 암 개발¹에 그들의 관여의 발견 이후, 그들은 임상 연구에 많은 관심을 받았다. 다 수의 간행물은 혈관 성장 및 형태 형성을 허용 하는 기전을 조사 하였으나, 그들의 생성을 위해 중요 한 다 수의 유전자가확인 되었지만, 많은 것은 상호 작용에 관하여 이해 될 수 있다 세포 또는 조직과 순환 혈액 사이.

뇌와 뇌 하 수 체에서 혈액 혈관의 시각화는 중요 하다. 두뇌에 있는 신경은 산소와 포도 당³의 높은 공급을 요구 하 고, 뇌에서 신호를 수신 하 고 다른 그들의 각각 호르몬을 보낼 혈 류를 사용 하 여 8 개의 중요 한 호르몬 생산 세포 유형을 포함 하는 뇌 하 수 체 주변 기관^4,5. 포유동물에 있는 동안, 시상 하 부의 기지에 있는 포털 시스템은 중앙값 미 넨 스 이라고 명명 하 고, 두뇌와 뇌 하 수 체⁶을 연결 합니다, 그런 명확한 ....

프로토콜

모든 동물 취급은 노르웨이 생명 과학 대학교에서 연구 동물의 보살 핌과 복지에 대 한 권고에 따라 수행 되었으며, 권한 있는 구도 자의 감독 하에 실시 되었습니다.

1. 장비 및 솔루션의 준비

1. 1.5 mL 플라스틱 튜브에 96%에 토를 사용 하 여 dii 5 mg을 용 해 하는 DiI 스톡 용액 준비 30 초에 대 한 소용돌이 및 알루미늄 호 일을 사용 하 여 덮여 유지 합니다.
   참고: 상기 DiI 원 액은 수 개월간-20°c에서 어두운 곳에서 보존 가능 하 게 된다.
2. 피시 홀더 (그림 1a)를 5 센티미터 길이로 절단 하 고 3cm 너비와 2cm 두께로 잘라서 9cm 직경의 플라스틱 접시에 접착 시킵니다. 폴리스 티 렌에 메스 블레이드가 있는 3cm 보트 모양의 구멍을 만드십시오.
3. 바늘의 말단에 30-50 cm 길이의 플라스틱 캐 뉼 러를 추가 하 여 관류 시스템 (그림 2)을 준비 합니다.
4. 50 mL 플라스틱 튜브에 30ml 인산 완충 식 염 액 (PBS)을 10ml 16% PFA로 희석 하 여 4....

결과

이 프로토콜은 송사리 뇌와 뇌 하 수 체에서 혈관에 레이블을 지정 하는 단계 절차를 보여 주며 동시에 조직을 수정 합니다. DiI를 포함 하는 고착 성 용액을 심장에 심장 주입 하 여 라벨링 한 후, 형광 실체 현미경을 사용 하는 슬라이스 (그림 4) 또는 전체 조직에 대 한 혈관을 관찰할 수 있습니다 (그림 5). 두꺼운 조직 슬라이스 또는 전체 조직에, 혈액 맥 관 구조의 아키텍처는 3 차원에서 관찰 될 수 있다. 조직 슬라이스는 고정이 끝난 후 표준 면역 형광 프로토콜을 사용 하 여 특정 표적 단백질에 대해 라벨링 할 수 있으며, 형질 전환 라인에서는 관심 있는 세포가 형광 리포터 단백질을 발현 합니다 (그림 6). 이 혈관과 다른 특정 세포 유형 사이의 상호 작용에 대 한 조사를 할 수 있습니다. 여기에 예를 들어, 메 다 카의 형질 전환 라인을 사용 하 여 녹색.......

토론

이전에 DiI를 가진 심장 관류는 teleost 물고기¹³을 포함 하 여 몇몇 모형 종²⁴에 있는 혈관에 상표를 지정 하기 위하여 이용 되었습니다_.

DiI는 혈관 구조에서 관류에 의해 내 피 세포 막으로 직접 전달 되기 때문에, 고정 용액에서 DiI 농도를 증가 시 킴으로써 신호 대 잡음비를 증가 시킬 수 있다. 또한, 형광 단을 최소한의 표백으로 흥분 시 강렬한 얼룩을 제공 하 여 상대적으로 오래 지속 되는 방출^18,30을 허용 한다. 또한, 라벨링은 며칠 동안 유지 될 수 있으며, 불변 형광 (IF)³¹과 같이 온화한 치료가 필요한 다른 라벨링 기법과 함께 사용 됩니다.

그러나.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
16% 파라포름알데히드	전자 현미경 과학	RT 15711
5mL 주사기 PP/PE(바늘 제외	Sigma	Z116866-100EA	주사기
BD Precisionglide 주사기 바늘	Sigma	Z118044-100EA	바늘 18G(1.20*40)
붕규산 유리 10cm OD 1.2mm	셔터 기기	BF120-94-10	유리 피펫
DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)	Invitrogen	D-282
LDPE 튜브 O.D 1.7 mm 및 I.D 1.1 mm	Portex	800/110/340/100	캐뉼라
인산염 완충액 식염수(PBS) 용액	Sigma	D8537-6X500ML
피펫 풀러	Narishige	PC-10
플라스틱 페트리 접시	VWR	391-0442
슈퍼 글루 젤	록타이트	c4356
트리카인 (ms-222)	시그마	E10521-50G

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