단백질-단백질 상호작용(PPI)은 생물학적 효과 생성의 기본입니다. 많은 것이 질병과 밀접하게 연관되어 있으며 약물 작용에 중요한 표적을 제공하는 것으로 점점 더 인식되고 있습니다1. 이러한 단백질 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있는 수많은 기술이 있으며, 그 중 일부는 이 컬렉션 또는 다른 JoVE 기사에서 논의됩니다. 각 기술에는 고유한 장점과 한계가 있습니다2; 그러나 광범위한 친화력(피코몰에서 밀리몰)으로 다양한 세포 내 구획에서 발생하는 이러한 상호 작용의 엄청난 다양성으로 인해 모든 PPI에 대한 완벽한 기술은 없으며 본질적으로 일시적일 수 있습니다.
시험관 내 키나아제 분석은 키나아제가 인산염기를 ATP에서 기질로 전달하는 기능적 역할을 수행하는 방법을 분석하는 데 사용할 수 있는 PPI를 연구하기 위한 간접적인 접근 방식입니다. Cui et al.3 은 트립신 분해 및 질량 분석법과 함께 이 기술을 사용하여 인간 중심체 단백질 F(CENP-F)의 단편에서 사이클린 의존성 키나아제-1 특이적 인산화 부위를 식별합니다. 새로운 인산화 부위의 기능적 검증을 위해 저자는 인산모방 돌연변이를 포함하는 CENP-F와 핵 수송 수용체인 카리오페린 α를 결합한 결합 분석을 사용하여 교차 검증을 제공합니다.
공면역침전은 항체를 사용하여 특정 표적과 관련된 다른 단백질 분자를 포획하는 PPI를 연구하는 데 널리 사용되는 방법입니다. Zheng과 동료들4 는 이 기술을 적용하여 산소 조절 α 서브유닛과 ARNT3라고도 알려진 구성적으로 발현된 β 서브유닛으로 구성된 이종이량체로 기능하는 저산소증 유도 인자(HIF)를 연구합니다. 그들의 프로토콜에 대한 흥미로운 점은 세포가 저산소 조건에서 유도 및 수확되고 핵 분획의 내인성 단백질이 공동면역침전된다는 것입니다. 저자가 지적했듯이 이 방법의 한 가지 한계는 PPI가 직접적인지 간접적인지 확인할 수 없다는 것입니다.
Nolan et al.5 은 단백질 호모올리고머화를 검출하는 데 적용할 수 있는 형광 현미경 이미지 'Number and Brightness'(N&B)에서 분자 수와 밝기를 측정하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 시험관 내 및 생체 내 모두에서 사용할 수 있으며 이량체화 약물 첨가 전후의 mVenus 표지 FKBP12F36V의 올리고머 상태를 정확하게 정량화하는 데 적용되었습니다. 저자는 관련 기술과 관련된 기술의 장점에 대해 논의하고 표백 및 장기적인 강도 변동에 대한 보정의 중요성을 강조합니다. 디지털 검출기가 장착된 공초점 현미경은 정량화를 더 쉽게 만들지만 아날로그 검출기를 사용하면 N&B도 가능합니다.
다중 단백질 복합체의 친화성 정제는 그 성분의 식별과 함께 이러한 복합체 단백질의 기능을 이해하는 데 널리 사용되는 기술이었습니다. Luzarowski et al.6의 프로토콜에서 이 기술은 형질전환 애기장대 식물 세포에서 PPI와 단백질-대사산물 상호작용(PMI)을 동시에 특성화함으로써 한 단계 더 발전되었습니다. 태그가 지정된 뉴클레오시드 이인산 키나아제는 TAP(tandem-affinity purification) 태그 절차에 의해 친화성 정제되며, 포획된 단백질과 소분자는 이후에 질량 분석법으로 식별됩니다. 이 프로토콜의 고유성은 소수성 및 친수성 리간드를 모두 식별할 수 있다는 것입니다. PPI와 PMI를 모두 연구할 수 있고 세포 심기에 친화성 정제를 적용할 수 있는 3-in-1 추출 프로토콜입니다.
근접 결찰 분석은 세포와 조직의 내인성 단백질 간의 상호 작용을 검출하는 데 사용된다는 장점이 있습니다. Karchugina와 Chernoff7 은 이 기술을 사용하여 인간 슈반 세포(HSC) 및 인간 배아 신장 세포(HEK-293)에서 키나아제 MST1 및 MST2의 이종이량체의 존재를 보여줍니다. 그들의 기사에는 기술을 성공적으로 수행하는 방법에 대한 몇 가지 유용한 지침이 있습니다. 상호 작용하는 각 단백질에 대해 서로 다른 종에서 생성된 적절한 1차 항체가 필요하며, 항체의 특이성과 민감도가 핵심이므로 항체 농도를 미세하게 조정해야 합니다. 저자는 유리 챔버 슬라이드가 여러 세포주 및 항체 조합을 분석하는 데 편리하다는 것을 발견했지만 현미경 검사 중 공초점 거리의 차이를 피하기 위해 웰 사이의 모든 실리콘 인서트를 제거하는 것이 필수적이라고 지적했습니다. 또한 결과를 검증하기 위해 다양한 양성 및 음성 대조군이 사용됩니다.
핵자기공명(NMR) 분광법은 단백질 상호작용 및 단백질-리간드 상호작용에 대한 원자 수준의 분해능과 정량적 정보를 제공하는 데 사용할 수 있는 민감한 분석법입니다. Winkelaar와 동료들8은 이 기술을 사용하여 강렬한 기계적 응력을 경험하는 조직에서 일반적으로 발견되는 세포 간 접착에 관여하는 세포 구조인 데스모좀에서 발견되는 두 가지 단백질(비멘틴 및 엔보플라킨)의 상호 작용을 연구합니다. 저자는 15N-표지 비멘틴 도메인을 사용하고 이핵 단일 양자 상관 관계(HSQC)를 사용하여 2D 스펙트럼을 획득합니다. 엔보플라킨의 도메인이 있는 경우, 단백질 상호작용과 일치하여 광범위한 선 확장과 피크 소실이 관찰됩니다. 저자는 정량적 정보를 제공하기 위해 돌연변이 유발 및 마이크로스케일 열영동(MST)을 사용하여 상호 작용의 기초를 추가로 조사합니다.
소각 X선 산란(SAXS)은 용액 내 거대분자의 크기와 형태에 대한 정보를 제공하고 저해상도로 큰 다중 도메인 또는 단백질 복합체의 분자 외피를 생성하는 데 사용할 수 있는 기술입니다. Mrozowich et al.9의 프로토콜에서 이 기술은 복합체로 nidogen-1 및 laminin γ-1의 저해상도 구조를 생성하는 데 사용됩니다. 이 기술은 NMR 분광법에 비해 너무 크고 X선 결정학을 위해 결정화하기 어려운 여러 구형 도메인이 있는 대형 단백질의 PPI를 연구하는 연구자에게 흥미로울 수 있습니다.
인간 상호 작용10에는 약 650,000개의 상호 작용이 있는 것으로 추정되며, 이는 앞으로 한동안 현장 연구자들을 바쁘게 만들기에 충분합니다. 현미경, 질량 분석법 및 기계 학습의 발전으로 가능해진 최근의 발전은 미래에 이 분야에 대한 훌륭한 통찰력을 제공할 수 있는 공간 단백질체학입니다11. 이 PPI 방법 모음은 연구자들이 잠재적인 함정을 피하면서 이 중요한 문제를 해결하는 데 도움이 될 것입니다.