Method Article

새로운 키나제 단백질의 강력한 생화학 적 접근법을 사용하여 분자 수준에서특성화

DOI:

10.3791/59820

⸱

June 30th, 2019

 ,  ,  , 
1Centre de Biophysique Moléculaire, CNRS, UPR 4301, University of Orléans and INSERM

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 강력한 생화확적인 접근을 사용하여 새로운 키나아제 단백질을 특징으로 했습니다: 다른 세포주 및 조직에 있는 전용적인 항체를 가진 서쪽 얼룩 분석, coimmunocipation 실험에 의하여 상호 작용, 서쪽에 의해 검출된 키나아제 활동 인광 특이적 항체를 사용하여 블롯[32 P] ATP 라벨링에 의해.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

광범위한 전체 게놈 시퀀싱은 많은 잠재적 단백질을 제공하는 많은 오픈 판독 프레임(ORFs)을 확인했습니다. 이 단백질은 세포를 위한 중요한 역할을 할 수 있고 새로운 세포 프로세스를 해명할 수 있습니다. 단백질 중, 키나아제는 세포 신호 통로에 속하고 세포 성장, 분열, 분화, 운동성 및 죽음과 같은 세포의 운명에 중요한 많은 프로세스를 켜거나 끄는 능력을 가진 주요 배우입니다.

본 연구에서는 새로운 잠재적 키나아제 단백질LIMK2-1에 초점을 맞추게 되었습니다. 우리는 특정 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 그것의 존재를 입증했습니다. 우리는 coimmunocipation 실험을 사용하여 상류 조절 단백질과의 상호 작용을 평가했습니다. 동면역침전은 두 표적 단백질 간의 상호작용을 검출할 수 있는 매우 강력한 기술이다. 그것은 또한 미끼 단백질의 새로운 파트너를 검출하기 위하여 이용될 수 있습니다. 미끼 단백질은 그것의 서열에 설계된 꼬리표를 통해서 또는 항체를 통해서 구체적으로 그것을 표적으로 하기 위하여 정제될 수 있습니다. 이들 단백질 복합체는 SDS-PAGE(나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔)에 의해 분리되고 질량 분석법을 사용하여 확인될 수 있다. 면역침전성 LIMK2-1은 또한γ[32P] ATP 라벨링에 의해 시험관내에서의 키나아제 활성을 시험하기 위해 사용되었다. 이러한 잘 확립된 분석기는 많은 상이한 기판을 사용할 수 있고, 미끼의 돌연변이 된 버전은 특정 잔기의 역할을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 이 기술은 매우 민감하고 정량적이기 때문에 약리학적 제제의 효과도 평가될 수 있다. 그럼에도 불구하고 방사능 처리에는 특별한 주의가 필요합니다. 키나아제 활성은 또한 변형된 아미노산의 인포 군을 표적화하는 특이적 항체로 평가될 수 있다. 이러한 종류의 항체는 모든 인광 변형 잔기에서 시판되지 않는다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

수십 년 동안, 수많은 신호 경로 해명 되었습니다 및 세포 분열 등 중요 한 세포 프로세스에 그들의 참여, 분화, 운동성, 프로그램된 세포 죽음, 면역 및 신경 생물학, 표시 되었습니다. 키나아제는 종종 그들의 활성화 또는 불활성화를 미세하게 조절하고 외부 자극1,2,3에반응하는 일시적인 다목적 복합체의 일부이기 때문에 이러한 신호 경로에서 중요한 역할을 한다. 키나아제의 돌연변이 및 dysregulation는 수시로 인간에 있는 질병으로 이끌어 내고, 그러므로 과거40 년 4.

이러한 맥락에서, 그들의 업스트림 레귤레이터 또는 다운스트림 기판과의 키나제 상호 작용을 감지하고 새로운 파트너를 식별할 수 있어야 합니다. 친화성 정제 및 면역 침전은 단백질 복합체의 분리를위한 매우 강력한 기술5. 상기 미끼 단백질 또는 키나아제는 펩티드를 표적화하는 항체와 공유하여 상업적인 비드의 사용을 허용하는 특이적 펩티드 서열로 태그화될 수 있다. 이 물질은 실험 6,7,8에서높은 재현성을 허용한다. 내인성 단백질은 또한 미끼 단백질을 직접 표적화하는 항체를 사용하여 면역침전될 수 있다. 항체는 단백질 A 또는 단백질 G 아가로즈 비드에 가교또는 단순히 용해액을 추가하기 전에 이들 비드로 배양될 수 있다. 용해 완충제는 상호 작용을 잃지 않고 단백질 용해를 허용하고 단백질 분해를 피하기 위해 최적화되어야합니다. 이 접근의 중요한 결점은 상호 작용이 세포 lysis에 검출된다는 것입니다; 따라서, 과도 또는 약한 상호 작용, 세포 외 컨텍스트를 필요로 하는 그들과 함께 놓칠 수 있습니다. 다른 기술은 근접 결선 분석 (PLA) 9, 생체 간연결 보조 친화 정화 (XAP)10,생물 발광 공명 에너지 전송 (BRET) 또는 Förster 공명 에너지와 같은 세포에서 직접 작동하도록 사용될 수있다 전송 (FRET)11,12. 또한, 면역 침전은 표면 플라스몬 공명, 등온 적정 열량 열량 계열 계열 또는 마이크로 스케일 열열염과 같은 물리적 기술이 필요한 결합의 열역학 상수를 결정하는 데 적합하지 않습니다. 13,14.

키나아제 활성은 여러 기술을 사용하여 평가될 수 있다. 본 명세서에서, 우리는 인광 특이적 항체 및시험관 내 γ[32 P] ATP(아데노신 트리포스페이트) 라벨링에 초점을 맞췄다. 인광 특이적 항체는 단백질 내의 특정 잔기의 인산염 변형을 표적으로 한다. 그(것)들은 세포 용해 후에 서쪽 Blot 또는 ELISA (효소 연결된 면역흡착 분석) 면역물분석, 및 유세포 측정 또는 면역 형광을 사용하여 온전한 세포에 사용될 수 있습니다. 그들의 단점은 표적 단백질의 돌연변이 버전을 사용하여 평가될 수 있는 특이성의 그들의 부족을 포함할 수 있고, 그들의 그들의 모든 단백질에 대해 상업적으로 이용가능하지 않다. 시험관내γ[32P] ATP 라벨링은 매우 견고하고, 잘 확립되고, 매우 민감한 방법15이다. 면역침전성 또는 재조합 단백질이 사용될 수 있고, 상이한 기질이 시험될 수 있다. 약물의 효과 또한이 방법은 정량으로 평가 될 수 있습니다. 주요 단점은 접근 방식과 관련된 방사능에 주의해서 처리해야 한다는 것입니다. 형광 또는 발광 펩타이드 기질의 측정과 인산화 시 변경된 형광/발광 특성을 활용하는 대체 방법도 가능합니다. 이러한 방법은 또한 표적 키나아제의 잠재적 억제제일 수 있는 분자의 스크리닝에서 요구되는 높은 처리량을 허용한다. 실제로, 키나제는 제약 회사가 추구하는 가장 큰 약물 표적 군수 중 하나를 나타냅니다16.

본 연구에서, 우리는 LIMK2-1 단백질에 초점을 맞췄다(LIMK2-1은 Lin11, Isle1, Mec3 키나아제 이소폼 2-1을 의미합니다). LIMK2 키나아제 단백질은 1995년17년에처음 기술되었다. LIMK2의 세 가지 이소폼은 LIMK2a, LIMK2b 및 LIMK2-1의 대체 접합에 의해 생성됩니다. 현재, LIMK2-1은 단일 연구18에서mRNA 수준에서만 기재되어 있다. 본 명세서에서, 우리는 강력한 생화학적 접근법을 사용하여 분자 수준에서 이러한 잠재적인 새로운 키나아제 단백질을 특성화한다. 첫째, 우리는 LIMK2-1이 실제로 합성된다는 것을 보여줍니다. 그것의 2개의 대응과 유사하게, LIMK2a 및 LIMK2b는, 상류 키나아제 ROCK (로-관련 단백질 키나아제)와 상호 작용한다. LIMK2-1은 미엘린 염단백질(MBP)에 키나아제 활성을 가지고 있지만, LIM 키나아제의 정식 기질인 코필린에는 적용되지 않는다는 것을 보여준다.

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Protocol

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1. 형질 혈하기위한 세포 준비

주의: 세포 배양의 모든 단계는 전용 실험실에서 수행되어야 하며, 세포는 Class 2 미생물 캐비닛 내에서 조작됩니다.

  1. DMEM 의 10 mL (덜베코의 수정 된 독수리 매체)에서 Ø 10cm 플레이트에서 10 % 태아 종아리 혈청을 보충 한 종자 HEK-293 (인간 배아 신장) 세포. 3~5일 동안 5%CO2미만에서, 37°C에서, 세포가 ~90% 합류에 도달할 때까지 배양한다.
  2. 콜라겐 R로 Ø 10cm 플레이트를 처리하여 플라스틱 플레이트에 세포 접착력을 높입니다.
    1. 10cm 플레이트에 인산염염수산완충액(PBS)으로 희석한 콜라겐 R 용액 5mL를 첨가합니다. 액체를 플레이트 의 전체 표면에 중첩시.
    2. 생물 안전 성 캐비닛 내에서 적어도 1 시간 동안 실온에서 배양하십시오.
    3. 콜라겐 용액을 제거하고 폐기하십시오. PBS 5 mL을 추가하고 접시 표면 전체에 펴서 제거하고 폐기하십시오. 이 세척을 한 번 반복하십시오.
    4. 10% 태아 송아지 세럼으로 보충된 DMEM 8 mL을 첨가합니다. 준비된 플레이트를 생체 안전 성 캐비닛 내에 보관하십시오.
  3. HEK-293 플레이트를 생체 안전 성 캐비닛 내에서 1.1 단계에서 가져 가라. 접시에서 매질을 제거하고 전용 표백제 휴지통에 버리십시오. 보충 된 DMEM 의 2 mL을 추가하고 거품을 피하지 않도록주의, 1 mL 마이크로 파이펫의 흐름을 사용하여 그들을 분리하는 세포를 플러시.
  4. 15 mL 튜브에 세포를 수집하고 보충 된 DMEM의 4 mL을 추가합니다. 10 mL 파이펫으로 균질화하고 위아래로 3 번 피펫을 피펫으로 처리하십시오.
  5. 이 세포 용액의 2 mL를 복용하고 1.2.4 단계에서 보충 된 DMEM을 함유 한 콜라겐 처리 플레이트에 추가하십시오.
  6. 5%CO2 및 37°C에서 인큐베이터에서 24시간 동안 성장한다. 세포는 형질전환 시 50-80 % 유동해야합니다.

2. 과도 변환

  1. 접시에서 매질을 제거하고 전용 표백제 휴지통에 버리고 신선한 보충제 DMEM 10 mL을 추가하십시오. 형질전환 혼합물을 준비하면서 37°C에서 인큐베이터에 플레이트를 다시 넣습니다.
  2. 15 mL 튜브에 10 mM Tris-HCl pH 7.5/1 mM EDTA(트리스(hydroxymethyl)아미노메탄, EDTA를 위한 에틸렌디니트리로이트라아세트산 용액 450 μL과 2.5 MCaCl2 용액50 μL을 첨가합니다. 반전으로 혼합합니다.
  3. 전용 플라스미드로 형질전환된 박테리아의 액체 배양에 미디 제제로부터 제조된 플라스미드 DNA(Deoxyribonucleic acid)의 10 μg를 첨가한다. 반전으로 혼합합니다.
  4. 소용돌이에 매끄러운 교반하에, BES 완충 식염수 2x 농축액의 500 μL을 추가합니다 (조성물: BES, 10.7 g/L, NaCl, 16.0 g/L,Na2HPO4,0.27 g/L; BES는 N,N-Bis(2-하이드록세틸)-2-아미노에탄설포닉산, N,N-비스(2-하이드록스예틸)타우린)을 서서히 떨어뜨립니다.
  5. 생체 안전 성 캐비닛 내의 실온에서 최소 15 분 (최대 45 분)동안 배양하십시오. 소용돌이하지 말고 섞지 마십시오! DNA와 칼슘 인산염 사이의 복잡한 형성을 방해하지 않도록 튜브를 매우 신중하게 이동합니다.
  6. 2.1단계에서 안전 캐비닛으로 플레이트를 가져 가라. DNA 복합체를 매우 신중하게 추가하고 한 방울씩 떨어 뜨려 서 판 표면 전체의 세포에 떨어 뜨립니다.
  7. 37°C에서 인큐베이터에서 24~72시간 동안 배양하였다. 일반적으로 최대 단백질 발현은 48시간 이내에 도달합니다.

3. 리시스

참고: 단백질 분해를 방지하기 위해 얼음과 차가운 완충제를 사용하여 섭취하십시오.

  1. 용해 버퍼 준비: 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% 트리톤 X-100, 50 mM NaF, 10 mMM 파이로포스페이트, 1 mM Na3VO4,20 mM p-니트로페닐 인산염, 20 mM β-글리세로포스페이트, 10 μg/mL 아프로틴, 0.05g , 1 μg/mL leupeptin, 및 1 mM PMSF (페닐메틸설포닐 불소). 각 형질 감염된 플레이트에 대해 약 4 mL의 용해 완충제가 필요합니다.
  2. 인큐베이터에서 형질 감염된 세포로 플레이트를 제거하십시오. 얼음에 넣어.
    참고 :이 단계에서는 "일반"벤치에서 작업 할 수 있습니다.
  3. 미디어를 제거하고 전용 표백제 휴지통에 버리십시오.
  4. 차가운 PBS의 3 mL로 두 번 세척 : 형질 감염된 세포를 분리하지 않도록 플레이트 드롭의 측면에 3 mL의 PBS를 추가하고, 판의 표면에 퍼뜨리고, PBS를 제거하고 폐기하십시오. 이 단계를 한 번 더 반복합니다. 끝에서, 다음 단계에 대한 용해 버퍼 희석을 방지하기 위해 플레이트를 기울여 PBS의 나머지 부분을 신중하게 제거하십시오.
  5. 형질 감염된 세척 된 세포에 500 μL의 냉매 완충제를 추가하십시오. 접시 의 표면에 모두 확산.
  6. 얼음에 10 분 동안 배양. 때때로 (적어도 두 번) 버퍼를 플레이트 표면 전체에 다시 퍼십시오.
  7. 세포를 스크랩하고 미세 원심 분리튜브에서 수집합니다.
  8. 4 °C에서 10,000 x g에서 10 분 동안 원심 분리기.
  9. 새로운 미세 원심 분리튜브에 상급체를 수집합니다. 이 분율은 리세이트(전체 세포 추출물)에 해당한다. 세포막 파편에 해당하는 펠릿을 폐기하십시오.
  10. 새로운 미세 원심 분리관 (약 50 μL)에이 분획의 aliquot를 수집합니다. 이 분획은 "TOTAL 분획" 또는 "세포 Lysate" 또는 "전체 세포 추출물"에 해당하여 형질감염된 단백질이 웨스턴 블롯에 의해 발현되는지 여부를 분석할 수 있습니다.
    참고: 이 시점에서 샘플은 웨스턴 블롯 해석에 직접 사용할 수 있습니다. Laemmli 버퍼는 시료에 첨가되어야 하며, 95°C에서 5분 동안 가열하고, 10,000 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 적절한 SDS-PAGE에 적재되어야 합니다. 샘플은 또한 -80°C에서 보관될 수 있다.

4. 면역 침전

  1. 적절한 항체와 결합된 아가로즈 비드를 부드럽게 재중단시킴: HA (인간 인플루엔자 헤마글루티닌), 플래그, 또는 GFP (녹색 형광 단백질) 매끄러운 반전.
  2. 마이크로파이펫에서 200 μL 팁의 끝을 잘라 구슬이 팁에 들어갈 수 있도록 합니다. 비드의 정확한 볼륨을 취할 수 있도록 팁을 포화 여러 번 아래로 비펫.
  3. 미세 원심 분리튜브에 40 μL의 구슬을 가져 가라.
  4. TENET (30 mM Tris-HCl pH 7.5, 120 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% 트리톤 X-100) 버퍼의 500 μL을 추가합니다. 반전으로 혼합합니다. 4 °C에서 1,000 x g에서 2 분 동안 원심 분리기. 조심스럽게 상급을 제거하고 폐기하십시오. TENET 의 500 μL을 추가합니다. 회전 식 휠에서 4 °C에서 적어도 1 시간 동안 배양하십시오.
    참고: TENET의 이 사전 인큐베이션 단계를 통해 비특이적 상호 작용을 줄이고 배경 신호를 줄일 수 있습니다.
  5. 500 μL의 lysis 버퍼로 구슬을 두 번 씻으하십시오.
    1. 4°C에서 1,000 x g에서 2분.
    2. 조심스럽게 상급 버퍼를 제거하고 폐기하십시오.
      참고: 세척 단계에서 구슬을 흡인하지 않도록 주의하십시오.
    3. 500 μL의 라시스 버퍼를 추가합니다. 튜브를 반전시켜 균질화합니다.
    4. 4.5.1- 4.5.3 단계를 반복합니다.
  6. 4°C에서 1,000 x g에서 2분 간 원심분리기. 상급 버퍼를 조심스럽게 제거하고 폐기하십시오.
  7. 회전 휠상에서 4°C에서 2~4시간 동안 3.9단계에서 용해된 비드를 인큐베이션한다.
  8. 면역 침전된 구슬을 씻습니다.
    참고: 이 시점에서, 면역침전된 비드는 용해 완충물로 5회 세척한 다음, Laemmli 완충물로 용출될 수 있다. 용리액은 웨스턴 블롯 분석에 사용되거나 -80°C에서 저장될 수 있다. 대안적으로, 비드는 라이징 버퍼로 2회 세척한 다음 키나아제 버퍼와 함께3회 세척하여 γ[32 P] ATP 라벨링을 수행할 수 있다.

5. Coimmunocipation 분석

  1. 4.7단계에서 면역침전된 비드를 포해 완충액으로 세척한다.
    1. 4 °C에서 냉장 원심 분리기에서 1,000 x g에서 2 분 동안 원심 분리기.
    2. 조심스럽게 상급체를 제거하고 폐기하십시오.
    3. 500 μL의 라시스 버퍼를 추가합니다. 튜브를 반전시켜 균질화합니다.
    4. 5.1.1-5.1.3단계를 네 번 반복합니다.
  2. 용출성
    1. 4 °C에서 냉장 원심 분리기에서 1,000 x g에서 2 분 동안 원심 분리기.
    2. 조심스럽게 상급체를 제거하고 폐기하십시오. 구슬의 열망을 피하기 위해 해밀턴 주사기로 상급물의 마지막 방울을 제거하고 상급을 버립니다.
    3. 4x Laemmli 완충액 40 μL(200 mM Tris/HCl pH 6.8, 4% SDS, 40% 글리세롤, 0.5 M β-메르카페탄올, 0.02% 브로모페놀 블루)을 첨가합니다. 튜브를 부드럽게 눌러 균질화합니다.
    4. 실온에서 5 분 동안 배양하십시오.
    5. 실온에서 10,000 x g에서 5 분 동안 원심 분리기.
    6. 해밀턴 주사기로 상반신을 제거하고 새로운 미세 원심 분리튜브에 수집하십시오. 이 분수는 -80 °C에서 저장될 수 있거나 웨스턴 블롯에 의해 직접 분석될 수 있는 "Eluate"에 해당합니다.

6. 키나제 분석

  1. 키나아제 완충제 준비: 50 mM HEPES-NaOH pH 7.5 (HEPES는 4-(2-하이드록세틸)-1-피페라진에탄설포닉산, 150mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 5 mM MnCl2,50 mM NaF, 1 mM Na3VO4,20 mM β-글리세로 포스페이트, 1 μg/mL leupeptin, 및 1 mM PMSF. 키나아제 완충제의 약 2 mL는 각 면역 침전 상태에 대해 요구된다.
  2. 4.7 단계에서 면역 침전 된 비드를 500 μL의 lysis 완충액으로 두 번 씻으하십시오.
    1. 4 °C에서 냉장 원심 분리기에서 1,000 x g에서 2 분 동안 원심 분리기.
    2. 조심스럽게 상급을 제거하고 폐기하십시오. 500 μL의 라시스 버퍼를 추가합니다. 반전으로 균질화.
    3. 6.2.1 및 6.2.2 단계를 반복합니다.
  3. 500 μL의 키나아제 완충제으로 면역침전된 비드를 세 번 세척한다.
    1. 4 °C에서 냉장 원심 분리기에서 1,000 x g에서 2 분 동안 원심 분리기.
    2. 조심스럽게 상급을 제거하고 폐기하십시오. 500 μL의 키나아제 버퍼를 추가합니다. 반전으로 균질화.
    3. 6.3.1 단계와 6.3.2 단계를 두 번 반복합니다.
  4. 4 °C에서 냉장 원심 분리기에서 1,000 x g에서 2 분 동안 원심 분리기.
  5. 조심스럽게 상급을 제거하고 폐기하십시오. 구슬의 열망을 피하기 위해 해밀턴 주사기로 상급물의 마지막 방울을 제거하고 상급을 버립니다.
  6. 면역침전된 비드에 40 μL의 키나아제 버퍼를 추가합니다. 튜브를 부드럽게 눌러 구슬을 다시 일시 중단합니다.
  7. 안전한 잠금 튜브에서γ[32P] ATP 라벨링(최종 부피는 22.5 μL, 키나아제 완충액으로 완성)을 위한 혼합물을 준비한다.
    1. 22.5 μL의 최종 부피에 도달하기 위해 키나아제 버퍼의 필요한 부피를 추가합니다.
    2. 마이크로파이펫의 20 μL 팁 끝을 잘라냅니다. 면역침전된 비드를 6.6단계에서 여러 번 위아래로 파이펫팅하여 재중단한다. 이 구슬의 10 μL을 안전 잠금 튜브에 수집합니다.
    3. 10 μM 스톡 솔루션에서 ATP를 추가하여 피날레 농도50 mM에 도달하십시오. 처리된 샘플의 수에 따라, 키나아제 버퍼내의 ATP의 스톡 용액의 희석은 부피가 정확한지 확인하기 위해 1~ 2 μL의 피펫을 허용하도록 제안된다.
    4. 기질 2.5 μg(본 연구 사례에서 코필린 또는 미엘린 기본 단백질, MBP)를 첨가합니다.
  8. 5 μCi의γ[32P] ATP(3,000 Ci/mmol)를 첨가하여 반응을 개시한다. 위아래로 천천히 파이펫팅하여 섞으세요.
    주의: 이 시점부터 는 신중한 예방 조치, 전용 보호 및 적절한 통제 (방사성 방패, 가이거 카운터, 특정 폐기물 수집, 개인 유방 및 방사능 조작 전용 안전 장소에서 작업을 수행해야합니다. 손가락 배지는 방사성 노출, 필터 팁을 감지합니다.
  9. 30 °C에서 20 분 동안 배양하십시오.
  10. 5 x Laemmli 완충액의 6 μL로 반응을 멈춥시다.
  11. 95°C에서 5분 동안 가열합니다.
  12. 실온에서 5 분 동안 10,000 x g의 원심 분리기.
  13. SDS-PAGE에 로드합니다. 마이그레이션을 진행합니다.
    참고: 자유 γ[32 P]ATP의 최전선이 이동 탱크의 오염을 피하기 위해 젤을 빠져나가지 않도록 주의하십시오.
  14. 실온에서 젤을 염색하십시오.
    1. 유리 판에서 젤을 제거합니다.
    2. 실온에서 물에 세 개의 욕조를 진행합니다.
    3. 실온에서 쿠마시 블루로 밤새 젤을 염색합니다.
    4. 실온에서 물로 여러 세척 욕조로 젤을 스테인.
  15. 젤을 플라스틱 랩으로 감쌉입니다.
  16. 형광체 화면에 하룻밤 이상 노출.
  17. 표지 된 밴드를 감지하기 위해 형광체 이미지에서 화면을 읽습니다.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LIMK2-1 단백질 합성
LIMK2-1은 데이터 뱅크에서 언급되지만, 지금까지 하나의 논문만이 mRNA18의존재를 보여주었다. LIMK2a 및 LIMK2b의 두 호몰로그와 비교하여, LIMK2-1은 단백질 포스파타제 1 억제 도메인(PP1i)으로 확인된 추가 C-말단 도메인을 가지고 있다. 우리는 이 도메인의 펩티드, 아미노산 671-684(도1A)를표적으로 하는 항체를 설계하였다.
인간 단백질 데이터베이스에 대한 BLAST 연구는 단 하나의 단백질, PHI-1(포스파타제 홀로효소 억제제 1)만이 이 12개의 아미노산 서열과 강한 서열 유사성을 가지고 있음을 보여주었다. 그러나 PHI-1은 75 kDa (즉, 두 가지를 방해해서는 안)로 예상되는 LIMK2-1에서 멀리 떨어진 SDS-PAGE 겔에서 23 kDa로 마이그레이션됩니다. ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 명세서에서, 우리는 분자 수준에서 새로운 단백질, LIMK2-1을 특성화하기 위해 강력한 생화학 적 도구를 사용하였으며, 그 서열및 그 상동체, LIMK2a 및 LIMK2b20에기초하여 키나아제인 것으로 여겨진다.

첫째, 우리는 특정 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 단백질 수준에서 LIMK2-1의 존재를 입증했습니다. 그 후 LIMK2a와 LIMK2b, LIMK2-1의 상동체를 조절하는 것으로 알려진 업스트림 키나아제 ROCK1과의 상호 작용을 평가했습니다. 마지막으로, 우리는 생체외 γ[32 P] ATP 라벨링을통해 LIMK2-1의 잠재적키나아제 활성을 평가하였고, 특정 인광 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의한 셀룰로에서.

리시스 버퍼 조성물
웨스턴 블롯에 의해 그(것)들을 분석하기 위하여 단백질을 공부할 때, lysis 완충조성에...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 라 리그 콘트레 르 암, l'협회 신경 섬유종 에 레클링하우젠, 라 레지온 센터 발 드 루아르에 의해 지원되었다. 유세포 측정 데이터에 대한 오렐리 코슨과 데보라 카사스, 그리고 원고의 철저한 교정을 위해 키론 히크먼-루이스에게 많은 감사를 드립니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
항체 안티 액틴시그마-알드리치A1978웨스턴 블롯
항체 안티-c-MycInvitrogenMA1-21316웨스턴 블롯
항체 안티 cofilin세포 신호 기술3312/5175웨스턴 블롯
항체 안티 GFP산타 크루즈sc-9996웨스턴 블롯
항체 안티-HARoche Western Blot
항체 anti-phospho-cofilin세포 신호 전달 기술3313에 대한 응용 과학 11687423001 Western Blot
항체 Anti-PP1iEurogentec은 이 연구를 위해 WesternBlot
Aprotinin,용해 완충액에 대한EuromedexA-162B
ATPInvitrogenPV3227에 대해 γ[ 32P] 라벨링
γ[ 32P] ATP퍼킨 엘머NEG502Afor γ[ 32P] 라벨링
BES 완충 식염수Sigma-Aldrich14280for transfection
β-glycerophosphateSigma-AldrichG9422for lysis and kinase buffer
β-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148for Laemmli
BSASigma-AldrichA3059for blocking buffer
Laemmli
CaCl2AldrichC3881용
원심분리기Sigma111-541
Collagen RPan BiotechP06-20166
PP1i 항체 특이성을
위한 SiRNA Ambion AM4611 제어Coomassie PageBlue 단백질 염색 용액Thermo-Fisher24620겔 염색용
EDTASigma-Aldrich3690용해 완충액
전기영동 장치BioradMini-Protean웨스턴 블롯용
EZview Red anti-HA 친화성 젤Sigma-AldrichE6779면역침전용
GeneSys 소프트웨어Ozyme웨스턴 블롯 인수
웨스턴 블롯 정량화를 위한GeneTolls 소프트웨어Ozyme
GFP-트랩 비드,면역침전을 위한Chromtek
완충액을 위한GlycineEuromedex26-128-6405
GST-cofilin,Upstate Cell signaling, 12-556γ[ 32P] 라벨링
Hamilton 주사기 100mLHamilton710사용하여 비드에서 상등액을 흡인하지 않고 조심스럽게 제거
HEPESSigma-AldrichH3375키나아제 완충액
ImageQuant TL 소프트웨어GE Healthcare방사능 수집 및 정량화
LIMK2 siRNAAmbions8191PP1i 항체 특이성
LeupeptinSigma-AldrichSP-04-2217lysis 및 kinase buffer
MBPUpstate Cell signaling13-173for γ[ 32P] 라벨링
키나아제 완충액용MgCl2</sub>Sigma-AldrichM8266
나아제 완충액용MnCl2</sub>Sigma-Aldrich244589 M8266
NaClEuromedex1112및 키나아제 완충
NaFSigma-AldrichS-1504및 키나아제 완충액
Okaidic 산성Euromedex0-2220용해 완충액
PMSFSigma-Aldrich78830용해 및 키나아제 완충액
p-nitrophenylphosphate완충액Euromedex1026
PVDF 멤브레인 Immobillon-PMerck-MilliporeIPVH00010 기공 크기 0,45 mm웨스턴 블롯
회전 휠Labinco비드 인큐베이션
안전 잠금 장치 Eppendorf0030120.086- 키나아제 분석
SDSSigma-Aldrich5030- Laemmli 및 이동 완충액 Sodium
orthovanadateLC LaboratoriesS8507용해 및 키나아제 완충액
Sodium pyrophosphateFluka71501용해 완충액
Super Signal West DuraProtein Biology34075웨스턴 블롯
Syngene PxiOzyme웨스턴 블롯
조직 추출물

 		바이오체인

 		P1234035 뇌
P12345152 Lung
P1234149 Liver
P1234188 Pancreas
P1234260 Western		Blot 분석을 위한 고환

 
전송 장치BioradMini-Trans-Blotfor Western Blot
TrisEuromedex26-128-3094 Bfor lysis buffer
Tween-20Sigma-AldrichP7949for blocking buffer
Typhoon FLA9500GE Healthcareto read autoradiography
Typhoon TrioAmersham Bioscienceread autoradiography
웨스턴 블롯을 위한Whatman 종이GE 헬스케어3030-672
, Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126 형질주입용 , , 전달 , , , 을 , , 키, 인분해효소 완충액용, 용해 액 , 용해 용해 to

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