여기에 제시된 펩티드 계의 작은 unilamellar 소포의 생성을 위한 프로토콜은 성장할 수 있다. 막 펩티드의 vesiculo 생산을 용이하게하기 위해, 이들 소포는 전사 번역 시스템 및 펩티드 인코딩 플라스미드를 구비한다.
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이 논문에서
요약
초록
생화확적인 반응의 구획화는 합성 세포의 중앙 양상입니다. 이러한 목적을 위해, 펩티드 기반 반응 구획은 리포좀 또는 지방산 계 소포에 대한 매력적인 대안으로 작용한다. 외부 또는 소포 내에서 펩티드는 쉽게 발현되고 막 전구체의 합성을 단순화 할 수 있습니다. 여기에 제공된 것은 유리 비드로부터탈수화-재수화를 활용하는 양친애 엘라스틴 유사 폴리펩티드(ELP)에 기초하여 ~200 nm의 직경을 가진 소포의 생성을 위한 프로토콜이다. 또한 역온도 사이클링을 통한 세균 ELP 발현 및 정제프로토콜뿐만 아니라 형광 염료를 통한 공유 기능화에 대한 프로토콜도 제시되어 있다. 더욱이, 본 보고서는 생화학반응에 대한 덜 복잡한 예로서 ELP 소포 내부의 RNA aptamer dBroccoli의 전사를 가능하게 하는 프로토콜을 기술한다. 마지막으로, 프로토콜이 제공되어 형광 단백질과 막 펩티드의 베시큘로 발현이 허용되는 반면, 후자의 합성은 소포 성장을 초래합니다.
서론
합성 생활 셀룰러 시스템의 창조는 일반적으로 두 개의 다른 방향에서 접근. 하향식 방법에서는, 박테리아의 게놈은 그것의 필수적인 분대로 감소되고, 궁극적으로 최소한의 세포로 이끌어 냅니다. 상향식 접근법에서 인공 세포는 일관된 세포와 같은 시스템으로 기능적으로 통합되어야 하는 분자 성분 또는 세포 하위 시스템에서 조립된 de novo입니다.
de novo 접근법에서, 필요한 생화학 적 성분의 구획화는 일반적으로 인지질 또는 지방산1,2,3,4로만든 멤브레인을 사용하여 달성된다. 이는 "현대적" 세포막이 주로 인지질로 구성되기 때문이며, 지방산은 프리바이오틱 멤브레인인클로저 5,6의그럴듯한 후보로 간주되기 때문이다. 새로운 멤브레인의 형성을 위해 또는 멤브레인 성장을 촉진하기 위해, 양과 성 빌딩 블록은 외부에서 제공되어야7 이상적으로 해당 근육 과정을 사용하여 membr....
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프로토콜
1. 엘라스틴과 같은 폴리펩티드의 발현
- 1일차: 펩타이드 발현을 위한 스타터 배양 및 소모품 준비
- LB 배지의 발현 배양 플라스크(4 x 2.5 L) 및 3L을 준비하고 오토클레이브 배양한다. LB 배지 1L의 경우, 25 g의 LB 파우더를 초순수 1L에 넣으세요.
- LB 배지 100 mL, 멸균 여과(0.22 μm 필터) 클로람페니콜 용액(EtOH의 25 mg/mL), 50 μL의 멸균 여과(0.22 μm 필터) 카베니실린 용액(50% EtOH 및 50% EtOH 및 50% 울트라 워터)으로 스타터 배양을 준비합니다.
- 폴리펩티드 서열 MGHGVP(GEGVP)를 인코딩하는 pET20b(+) 발현 벡터를 사용하여 대장균 균주 BL21(DE3)을 포함하는 미리만들어진 세균 성 스톡으로부터 작은 줄무늬를 추가((GFGVP) 4(GVGVP))3 (GFGVP)4GWP(EF로 축약)를 미리 온난100 mL 스타터 배양하고 37°C에서 16시간 동안 배양하고 250 rpm을 흔들림 인큐베이터에서 배양한다(E.coli 균주 및 벡터는 요청시 사용할 수 있다). ....
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결과
소포 생산
도 1은 상이한 부종 용액 및 유리 비드 방법으로 제조된 소포의 투과 전자 현미경(TEM) 영상을 나타낸다(또한 Vogele et al.11참조). 도 1A의샘플에 대해, 소포의 형성을 증명하고 그들의 크기를 결정하기 위해 부종 용액으로 만 PBS를 사용했다. TX-TL이 팽윤용액(도1B)으로사용되었을 때, 소포도 형성되었다. 동적 광 산란(DLS) 측정은 유리 비드 방법이 소포 형성에 영향을 미친다는 것을 보여주기 위해 수행되었다. 도 2는 PBS(파랑)에서 유리 비드 없이 제조된 EF 샘플의 측정된 강도 자기상관 곡선과 팽윤용액으로서 PBS를 이용한 유리 비드 법으로 제조된 EF 샘플을 도시한다( 적색). 크기는 적당한
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토론
필름 재수화는 작은 unilamellar 소포의 생성을위한 일반적인 절차입니다. 고장의 주요 원인은 절차에 사용되는 재료의 잘못된 취급입니다.
처음에, ELPs는 대장균 세포에 의해 생성됩니다. ELP 정제 후 의제는 중요한 단계에서 프로토콜이 얼마나 신중하게 수행되는지에 따라 크게 달라질 수 있습니다. 이들은 강수 후 반온도 사이클링(ITC) 단계와 ElP의 재서스펜션이다. 정화를 위해, 우리는 산화성으로 pH를 변경하고 친수성 블록에 있는 글루탐산 측사슬의 protonation에 이끌어 내는 인산의 추가를 통해 펩티드의 소수성 붕괴를 시작했습니다. 이 단계 후, 두 블록은 RT에서 소수성이다. 이온 강도를 일정하게 유지하기 위해 용액에 이미 소금이 있는 산을 사용하는 것이 바람직하지만 염산과 같은 다른 산도 사용할 수 있습니다. ELP 생산.......
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공개 사항
저자는 경쟁적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 DFG TRR 235 (생명의 출현, 프로젝트 P15), 유럽 연구 위원회 (보조금 협정 번호 694410 AEDNA), 그리고 TUM 국제 과학 공학 IGSSE 대학원 (프로젝트 번호 9.05)을 통해 재정적 지원을 감사하게 인정합니다. . 샘플 준비에 도움을 주신 E. 팔겐하우어에게 감사드립니다. 우리는 TX-TL 시스템과 유용한 토론에 대한 도움에 대한 A. 듀핀과 M. 슈바르츠 쉴링에게 감사드립니다. 우리는 유용한 토론에 대한 N. B. 네덜란드 감사합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2xYT | MP biomedicals | 3012-032 | |
| 3-PGA | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| 5PRIME Phase Lock GelTM 튜브 | VWR | 733-2478 | |
| 알킨 접합 Cy3 | 시그마-알드리치 | 777331 | |
| 알킨 접합 Cy5 | 시그마-알드리치 | 777358 | |
| ATP | 시그마-알드리치 | A8937 | |
| Benzamidin | Carl Roth | CN38.2 | |
| BL21 Rosetta 2 E. coli 균주 | Novagen | 71402 | |
| Bradford BSA 단백질 분석 키트 | Bio-rad | 500-0201 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| Carbenicillin | Carl Roth | 6344.2 | |
| Chloramphenicol | 시그마-알드리치 | C1919 | |
| 클로람페니콜 | 칼 로스 | 3886.3 | |
| 클로로포름 | 칼 로스 | 4432.1 | |
| CoA | 시그마-알드리치 | C4282 | |
| CTP | USB | 14121 | |
| CuSO4 | Carl Roth | P024.1 | |
| DFHBI | 루세르나 테크놀 | 로지스410 | |
| DMSO | Carl Roth | A994.1 | |
| DNase I | NEB | M0303S | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| 에탄올 | Carl Roth | 9065.2 | |
| Folinic acid | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| 유리 구슬, 산 세척 | Sigma-Aldrich | G1277 | |
| GTP | USB | 16800 | |
| HEPES | 시그마-알드리치 | H6147 | |
| IPTG (&베타;-이소프로필 티오갈락토시드) | 시그마-알드리치 | I6758 | |
| KCl | 칼 로스 | P017.1 | |
| K-글루타메이트 | 시그마-알드리치 | G1149 | |
| LB 육수 | 칼 로스 | X968.2 | |
| 라이소자임 | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| 메탄올 | Carl Roth | 82.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | KK36.3 | |
| Mg-글루타메이트 | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| 마이크로 바이오 스핀 크로마토그래피 컬럼 | Bio-Rad | 732-6204 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NHS-아지드 링커(y-아지도부티르산 옥시숙신이미드 에스테르) | Baseclick | BCL-033-5 | |
| PEG-8000 | Carl Roth | 263.2 | |
| pH 줄무늬 | Carl Roth | 549.2 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Carl Roth | 6367.2 | |
| 인산염 완충 식염수 | VWR | 76180-684 | |
| 인산 | 시그마-알드리치 | W290017 | |
| 폴리에틸렌이민 | 시그마-알드리치 | 408727 | |
| 인산칼륨 이염기성 용액 | 시그마-알드리치 | P8584 | |
| 인산칼륨 일염기성 용액 | 시그마-알드리치 | P8709 | |
| Qiagen Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| RNAPol 반응 완충액 | NEB | B9012 | |
| RNase 억제제 쥐 | NEB | M0314S | |
| RNaseZap 와이프 | ThermoFisher | AM9788 | |
| rNTP | NEB | N0466S | |
| Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol | Carlroth | A156.1 | |
| RTS 아미노산 샘플러 | 5 프라임 | 2401530 | |
| Slide-A-Lyzer 투석 카세트, 10k MWCO(키트) | Thermo-Scientific | 66382 | |
| 염화나트륨 | Carl Roth | 9265.1 | |
| 수산화나트륨 | Carl Roth | 8655.1 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| 멸균 여과 (0.22 µ m 필터) | Carl Roth | XH76.1 | |
| T7 중합 효소 | NEB | M0251S | |
| TBTA (트리스 (벤질 트리아 졸릴 메틸) 아민) | 시그마 알드리치 | 678937 | |
| TCEP (트리스 (2- 카르 복시 에틸) - 포스 핀 염산염) | 시그마 알드리치 | C4706 | |
| 트리스 염기 | 피셔 | BP1521 | |
| tRNA (대장균에서 추출) | 로슈 적용 사이언 | MRE600 | |
| UTP | USB | 23160 |
참고문헌
- Chen, I. A., Szostak, J. W. A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles. Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).
- Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional ....
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재인쇄 및 허가
