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방법 논문

인간 코드 혈액 유래 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포의 범골수성 분화

9.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/59836

⸱

2019년 8월 9일

 ,  , 
1Department of Basic Medical Sciences, College of Medicine-Phoenix, University of Arizona

이 논문에서

요약

여기서, 우리는 4개의 골수성 혈통에 제대혈 유래 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포의 면역표현특성 및 사이토카인 유도분화를 위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜의 적용은 CD34+ 세포의 골수성 분화에 대한 골수성 질환 돌연변이 또는 소분자의 영향에 대한 조사를 포함한다.

초록

인간 조혈줄기세포의 생체내 분화는 조혈을 연구하기 위한 널리 사용되는 모델이다. 여기서 기재된 프로토콜은 4개의 골수성 혈통 세포로 의 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포의 분화를 유도하는 사이토카인을 위한 것이다. CD34+ 세포는 인간 탯줄 혈액으로부터 단리되고 사이토카인이 존재할 때 MS-5 기질 세포와 병용배한다. 줄기 및 전구 세포의 면역표현특성, 및 분화된 골수성 혈통 세포가 기재되어 있다. 이 프로토콜을 사용하여, CD34+ 세포는 작은 분자로 배양되거나 골수성 분화에 미치는 영향을 조사하기 위해 골수성 질환 돌연변이를 발현하기 위해 렌티바이러스로 트랜스화될 수 있다.

서론

조혈 줄기 세포 (HSCs)의 정상적인 분화는 모든 혈액 세포 계의 생리적 수준의 유지에 중요합니다. 분화 도중, 성장 인자 및 사이토카인을 포함하여 세포외 단서에 조정된 반응에서, HSCs는 먼저 림프-골수성 전위가 있는다능한 전구 (MPP) 세포를 초래합니다 1,2,3 ,4 (그림 1). MPP는 일반적인 골수성 전구 (CMP) 및 일반적인 림프종 전구 (Clps)를 계보 제한되는 초래합니다. CLPs는 B, T 및 자연 킬러 세포로 구성된 림프계로 분화합니다. CmP는 2개의 더 제한된 전구 인구, 거핵구 적혈구 전구체 (MEPs) 및 과립 구체 질 전구체 (GPS)를 통해 골수성 계보를 생성합니다. MEP는 거핵구와 적혈구를 초래하는 반면, GPS는 과립구및 단핵구를 초래합니다. CmPs를 통해 발생하는 것 외에도, 거핵구는 또한 비 표준 경로5,6을통해 HSC 또는 초기 MPP에서 직접 발생하는 것으로 보고되었다.

조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)는 표면 마커 CD34 및 계보 특이적 마커의 결여(Lin-)를 특징으로 한다. HSC 및 골수성 전구 집단을 구별하기 위해 일반적으로 사용되는 다른 표면 마커는 CD38, CD45RA 및 CD123 2(도1)를포함한다. HSC와 MpP는 각각 린-/CD34+/ CD38- 및 린-/ CD34+/ CD38+입니다. 골수성 전구 인구는 CD45RA 및 CD123의 존재 또는 부재에 의해 구별됩니다. CMP는 린-/CD34+/CD45RA-/ CD123lo,GMP는 린-/CD34+/ CD38+/ CD45RA+/CD123로,그리고 MEP는 린-/CD34+ /CD38+/CD45RA-/CD123-.

CD34+ 줄기 및 전구 세포의 총 집단은 인간 탯줄 혈액(UCB), 골수 및 말초 혈액으로부터 얻을 수 있다. CD34+ 세포는 인간 UCB에서 총 단핵 세포 (MNCs)의 0.02 % ~ 1.46 %를 구성하는 반면, 그 비율은 골수에서 0.5 %와 5.3 % 사이에서 변화하며 말초 혈액7,8,9에서 0.01 %로 훨씬 낮습니다. . UCB 유래 CD34+ 세포의 증식 능력 및 분화 전위는 골수 또는 말초 혈액 세포1,10보다현저히 높으며, 이를 통해 구득을 위한 뚜렷한 이점을 제공한다. 분화 하는 동안 세포의 면역 표현 형 및 형태 학적 특성 분석을 수행과 함께 분자 분석을위한 충분한 물질.

제대혈 유래 CD34+ HSPC의 생체내 분화는 정상적인 조혈 및 조혈 질환 기전을 조사하기 위한 널리 적용되는 모델이다. 적절한 사이토카인으로 배양할 때, UCB CD34+ HSPC는 골수성 또는 림프성 혈통11,12,13,14,15를 따라 분화하도록 유도될 수 있다. , 16. 여기서, 우리는 인간 UCB로부터CD34+ HSPC의 격리 및 면역 표현형 특성화및 골수성 혈통 세포에 대한 이들의 분화를 위한 프로토콜을 기술한다. 이러한 배양 시스템은 골수에서 미세환경을 모방하기 위해 MS-5 기질 세포의 존재에 있는 HSPC의 사이토카인 유도 분화에 기초한다. 배양 조건은 CD34+ 세포의 초기 팽창을 일으키고, 이어서 4개의 골수성 계보 세포, 즉 과립구(CD66b), 단핵구(CD14), 거핵구(CD41) 및 적혈구 (CD235a). CD34+ 세포 분화 프로토콜의 응용은 조혈을 조절하는 분자 메커니즘에 대한 연구, 및 골수성 질환 관련 돌연변이 및 소분자가 자가 재생에 미치는 영향에 대한 연구를 포함하고 있으며, HSPC의 차별화.

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프로토콜

실험을 위한 인간 탯줄 혈액은 마리코파 통합 건강 시스템 (MIHS), 피닉스에 통보된 동의 후에 건강한 개별에 의해 기증되었습니다. 식별되지 는 단위는 MIHS와 애리조나 대학 사이의 재료 이전 계약을 통해 얻은.

1. 시약 및 버퍼

참고: 생물학적 안전 캐비닛에 멸균 조건하에서 모든 시약과 완충장치를 준비합니다.

  1. 멸균 PBS-BSA-EDTA (PBE) 완충액을 7.2 mL의 멸균 35% 소 혈청 알부민 (BSA; 사용 멸균 조직 배양 등급 35% BSA) 및 멸균 0.5 M 에틸렌 당탄 테트라 아세트산 (EDTA)의 5 mL를 487.8 mL에 첨가하여 제조 식염수 (DPBS). 필터 살균 및 탈가스 버퍼는 적어도 2 시간 동안 생물학적 안전 캐비닛에 진공에 부착 된 필터를 방치하여 더 작은 부피 (250 mL)에서 탈 가스 완충액을 4 °C에서 저장합니다.
  2. 행크스 균형 소금 용액 1회(HBSS 1x)를 준비합니다. 멸균 증류수 900mL에 10x HBSS 스톡 100mL을 희석하여 1X HBSS 의 1L을 만들고 pH를 7.2로 조정합니다. 사용하기 전에 1x HBSS를 살균하는 필터.
  3. 증류수 98 mL에 2 mL의 빙하 아세트산을 추가하여 2 % 아세트산 용액을 준비하십시오.
  4. 1x PBS에서 20 ng/mL 재조합 인간 피브로넥틴 단편 용액을 준비합니다. 48 웰 플레이트 당 10 mL을 만드십시오.
  5. 준비 2% BSA. 100 mL 1x PBS에 BSA 분획 V. 필터를 사용하기 전에 2 그램을 추가하십시오.
  6. DMEM 분말, 중탄산나트륨 3.7gm, 태아 소 혈청(FBS) 및 5 mL 페니실린-스트렙토마이신(PS)을 멸균 증류수 800mL에 첨가하여 DMECco의 변형 된 독수리 배지 (DMEM)를 완성하십시오. 부피를 1L까지 혼합하고 구성하고 사용하기 전에 필터멸균을 합니다.
  7. 90 mL의 FBS와 멸균 디메틸 설폭사이드 (DMSO)의 10 mL를 혼합하여 동결 매체를 준비합니다.
  8. 자극 매체를 준비합니다. 혈청 프리 배지에 L-글루타민을 2 mM에 추가하고 줄기 세포 인자 (SCF), 트롬보포이에틴 (TPO), FMs 와 같은 티로신 키나아제 3 리간드 (Flt3L) 및 인터류킨-3 (IL3)에 대한 20 ng / mL의 최종 농도에 시토카인을 추가하십시오.(Il3 참조) 사이토 카인 스톡 솔루션의 준비). 48 웰 플레이트 당 5 mL을 만드십시오.
  9. 골수성 분화 배지1회 준비. DMEM을 완료하려면 SCF, Flt3L 및 IL3의 경우 5 ng/mL, TPO의 경우 50ng/mL, 에리스로포이에틴(EPO)의 경우 4단위/mL의 최종 농도에 사이토카인을 추가합니다. 48 웰 플레이트 당 5 mL을 만드십시오.
  10. 골수성 분화 배지를 2배 준비합니다. DMEM을 완료하려면 SCF, Flt3L 및 IL3의 경우 최종 농도 10 ng/mL, TPO의 경우 100ng/mL, EPO의 경우 8단위/mL에 사이토카인을 추가합니다. 48 웰 플레이트 당 5 mL을 만드십시오.
  11. 유세포 분석 버퍼를 준비합니다. 1x PBS의 1 L에, BSA 분획 V의 10 g을 추가합니다.
  12. 1x PBS에서 1% 파라포름 알데히드를 준비합니다(자세한 내용은 재료 표 참조).
  13. 1x PBS의 49.5 mL에 10 mg/mL 폴리-L-리신의 500 μL을 추가하여 폴리-L-리신 용액을 준비합니다.

2. 배꼽 코드 혈액에서 단핵 세포의 격리

참고: 아래에 기술된 프로토콜의 경우, 90~100 mL의 코드 혈액 부피가 사용되었다. CD34+ 세포의 분리는 생물학적 안전 캐비닛의 멸균 조건하에서 수행되어야 합니다.

  1. UCB가 함유된 가방에 70% 에탄올을 뿌려 외부 표면을 살균한 후 생물학적 안전 캐비닛에 넣습니다. UCB를 멸균 된 250 mL 플라스틱 병에 옮기고 동일한 부피 (RT) 1x HBSS를 추가하여 1 : 1을 희석하십시오.
  2. 튜브당 MNC 분획 배지 15 mL(MFM; 재료 표참조)을 약 6개의 멸균 50 mL 원엽 튜브에 분배합니다. MFM으로 튜브를 기울이고 희석 된 UCB 30mL를 MFM 층에 부드럽게 부어 방해하지 않습니다.
  3. 느린 가속과 브레이크없이 RT에서 30 분 동안 400 x g의 튜브를 원심 분리합니다.
  4. 원심 분리 후, MNC 층 위의 플라즈마의 15-20 mL 사이에서 흡인한다. 피펫으로 MPC를 부드럽게 수집하고 새로운 50mL 원엽 튜브로 옮김을 제공합니다.
    참고: MNC는 혈장 및 MFM의 계면에서 백색 버피 층으로서, 및 원엽 관의 바닥에 적혈구(RBC) 퇴적물을 침전한다.
  5. 풀 MNC는 함께 2-3 튜브에서 수집. 차가운 PBE 버퍼로 각 튜브의 부피를 50 mL까지 구성합니다.
  6. 4 °C에서 10 분 동안 300 x g의 튜브를 원심 분리하고 브레이크를 낮게 합니다.
  7. 상급제 흡입하고 튜브를 부드럽게 눌러 세포 펠릿을 느슨하게합니다.
  8. 얼음 차가운 PBE 완충제의 5 mL에서 펠릿 세포를 다시 중단시다. 동일한 5 mL의 재부유 세포를 사용하여 다른 튜브에서 세포를 수집합니다. 하나의 50 mL 원뿔 튜브에 함께 3 ~ 4 개의 튜브에서 세포를 결합합니다.
  9. 남은 세포를 수집하려면 5 mL의 차가운 PBE 버퍼로 모든 튜브를 세척하고 50 mL 원추형 튜브에 추가하십시오.
  10. 세포 현탁액 10 μL을 490 μL 아세트산 용액으로 희석하여 MBC를 계산합니다.
    참고: 아세트산은 MBC의 쉬운 계산을 허용하기 위해 오염 된 RBC를 용해.
  11. 얼음 차가운 PBE 버퍼로 셀 서스펜션의 부피를 50 mL로 구성합니다. 4 °C에서 10 분 동안 300 x g에서 세포를 원심 분리하고 브레이크를 낮게 합니다.
    참고: MNC 서스펜션은 CD34+ 셀의 격리를 위해 즉시 처리되거나 이후 의 적용을 위해 동결될 수 있다.
  12. MBC를 동결하려면 상급체를 제거하고 RT에서 동결 매체에서 2 x 107 셀 / mL의 밀도로 다시 일시 중단하십시오.
  13. 세포를 밤새 -80°C에서 동결된 후 액체 질소로 옮김을 넣습니다.

3. 단핵 세포에서 CD34+ 세포의 분리

  1. 새로 고립된 MMC를 사용하는 경우 3.3단계로 직접 진행한다.
  2. 동결 된 MTO를 사용하는 경우, 37 °C 수조에서 냉동 세포를 신속하게 해동하고 50 mL 원엽 튜브로 옮김을 옮김. 얼음 차가운 PBE 버퍼 1 mL로 바이알에 남아있는 세포를 수집하고 50 mL 원추형 튜브로 옮김.
  3. MNC 현탁액의 부피를 50 mL까지 차가운 PBE 버퍼와 원심분리기를 600 x g에서 4°C에서 5분 동안 구성합니다.
  4. 상급체를 제거하고 튜브를 부드럽게 눌러 셀 펠릿을 느슨하게합니다. MTO를 300 μL의 얼음 차가운 PBE 버퍼에서 1 x 108 셀로 다시 일시 중단합니다.
  5. 자기 활성화 세포 선별(MACS) 인간 CD34 마이크로비드 키트에서 100 μL의 FcR 차단 시약을 1 x 108 MNC당 넣고 부드럽게 섞습니다.
    참고: 이는 CD34 마이크로비드에 대한 비특이적 결합을 차단한다.
  6. 1 x 108 셀 당 CD34 마이크로 비드 의 100 μL을 추가합니다. 부드럽게 섞고 냉장고에서 30분 동안 4°C에서 배양합니다. 얼음에 배양하지 마십시오.
  7. 세포가 인큐베이션되는 동안, MACS 분리기 자기장에 LS 컬럼 과 사전 분리 필터를 놓습니다. 사전 분리 필터에 2 mL과 1 mL를 직접 컬럼에 추가하여 얼음 차가운 PBE 버퍼로 컬럼을 평형화합니다. 컬럼이 15mL 원추형 튜브로 비우고 흐름을 취소합니다.
  8. MPC를 4°C에서 제거하고, 얼음-차가운 PBE 버퍼를 추가하여 부피를 15 mL로 구성하고, 4°C에서 10분 동안 300 x g의 세포를 원심분리하고, 브레이크를 낮게 유지합니다.
  9. 상월체를 흡인하고 얼음 차가운 PBE 완충제의 1 mL에서 세포를 다시 중단시딩한다.
  10. LS 컬럼에 배치된 사전 분리 필터에 셀 서스펜션을 추가합니다.
    참고: 사전 분리 필터는 열을 차단할 수 있는 큰 셀 집계를 제거합니다.
  11. 3 mL의 얼음 차가운 PBE 버퍼로 튜브를 헹구고 LS 컬럼에 놓인 사전 분리 필터에 추가하십시오. 그 후 사전 분리 필터를 폐기합니다.
  12. 3 mL의 얼음 차가운 PBE 버퍼를 추가하여 LS 열을 4 번 씻어 매번 열이 배출 될 수 있도록합니다.
    참고: CD34+ 셀은 열에 바인딩된 상태로 유지되며 레이블이 지정되지 않은 셀은 컬럼을 통해 흐르게 됩니다.
  13. 최종 세척 후 MACS 분리기 자기장에서 컬럼을 제거하고 자석에서 떨어진 새로운 15mL 원엽 튜브에 놓습니다.
  14. 컬럼에 5 mL 얼음 차가운 PBE 버퍼를 추가하고 플런저를 단단히 밀어 바인딩 된 CD34+ 셀을 추방하십시오.
  15. 선택적으로, 전술한 바와 같이 사전 분리 필터를 가진 다른 LS 컬럼에 제1 컬럼으로부터 분리된 CD34+ 셀을 통과한다(단계 3.10−3.13).
  16. 리시반 블루(10 μL의 셀및 10 μL의 트리판 블루)로 단리된 CD34+ 세포를 계산하여 총 살아있는 세포 수를 결정한다.
    참고: 이 단계에서, 단리된 CD34+ 세포는 나중에 사용하기 위해 동결되거나 유세포 분석(섹션 4)에 의한 HSPC의 분석을 위해 직접 처리될 수 있거나 또는 골수성 계보 세포(섹션 5)로의 분화를 위해 서있다.
  17. RT에서 5분 동안 600 x g의 셀 서스펜션을 원심분리하고 브레이크를 낮게 합니다.
  18. CD34+ 세포를 동결시키기 위해, 상피체를 흡인하고 상술한 바와 같이 동결 배지의 1 mL에서 최대 5 x 106 세포를 다시 현탁시키고 동결한다(단계 2.13). 그렇지 않으면 섹션 4 또는 5로 진행합니다.

4. 유세포측정에 의한 줄기 및 선조 집단의 결정

  1. 갓 단리된 CD34+ HSPC에서 줄기 및 전구 집단의 분획을 결정하기 위해, 원심분리기 600 x g에서 5분 동안 원심분리하고 50 μL의 유세포분석 버퍼에서 1 x 106 세포를 다시 중단한다.
  2. 1 x 106 CD34+ 셀에, 계보 마커 (CD3, CD7, CD10, CD10, CD11b, CD19 및 CD235a ) 에 항체를 추가하십시오 - 모든 FITC 라벨), CD34 (APC-Cy7), CD38 (PE), CD45RA (PE-Cy7), CD45RA (PE-Cy7), CD123 (7PC) 아미노액티노마이신 D (7-AAD; 살아있는/죽은 얼룩)를 구성하고 총 부피를 100 μL로 구성합니다.
    참고: 1 x 106 CD34+ 셀 미만이 분석을 위해 사용될 수 있다. 더 적은 세포를 염색하는 경우에, 추가된 항체의 총 부피 및 부피는 그에 따라 감소되어야 합니다. 유세포 분석의 경우, 얼룩이 없고 염색된 MNC를 각 형광소에 대해 양수 및 음수 게이트를 설정하기 위한 컨트롤로 사용해야 합니다.
  3. 배양 후, 1 mL의 유세포 분석 버퍼로 세포를 씻고 원심 분리기를 600 x g에서 5 분 동안 씻으십시오.
  4. 선택적으로, RT에서 어둠 속에서 10 분 동안 1 % 파라 포름 알데히드 용액의 0.5 mL에 염색 된 세포를 고정시다.
  5. 600 x g에서 5 분 동안 원심 분리기를 하고 상월체를 흡인합니다.
  6. 1 mL의 유세포 분석 버퍼로 고정/염색된 세포를 세척하고 원심분리기를 600 x g에서 4°C에서 5분 동안 세척합니다.
  7. 상월체를 흡인하고, 500 μL의 유세포분석 버퍼에서 세포를 다시 현탁시키고, 유동세포계계(물자 표)로 분석한다.

5. CD34+ 조혈 줄기 및 전조 세포의 골수성 분화

참고: CD34+ HSPC를 골수성 계보 세포와 분화하기 위해, 이들은 먼저 재조합 인간 섬유넥틴 단편 코팅 플레이트에서 자극한 다음 골수성 분화 배지에서 MS-5 기질 세포의 층에 시드한다. 분화는 4개의 골수성 혈통에 특이적인 세포 표면 마커의 발현에 기초하여 3주 동안 매주 모니터링될 수 있다. 자극 및 분화 동안, 모든 배양은 가습 챔버에서 37°C 및 5% CO2에서 수행된다. 모든 단계는 생물학적 안전 캐비닛에서 수행해야합니다.

  1. RT에서 2 시간 동안 1x PBS에 재조합 인간 섬유넥틴 용액200 μL / well을 추가하여 멸균되지 않은 48 웰 플레이트의 우물을 코팅하십시오.
  2. 2 시간 후, 조심스럽게 재조합 인간 섬유넥틴 용액을 제거하고 폐기하십시오.
  3. RT에서 30 분 동안 200 μL / 2 % BSA의 우물을 차단하십시오.
  4. BSA 용액을 흡인하고 멸균 1x PBS 의 500 μL로 우물을 두 번 세척하십시오.
    참고: 피브로넥틴 단편 코팅 플레이트는 최대 2주 동안 4°C에서 보관될 수 있다.
  5. CD34+ HSPC를 자극하려면, 1 x 105 세포/200 μL 또는 따뜻한 1x 자극 배지의 5 x 105 세포/mL의 밀도로 새로 단리된 세포(3.17단계로부터)를 다시 일시 중단합니다.
  6. 동결된 CD34+ 세포를 사용하는 경우, 세포를 빠르게 해동하고 따뜻한 완전한 DMEM을 함유하는 15 mL 원엽 관으로 옮김. 600 x g에서 5분 동안 원심분리기를 하고 5.5단계에서 설명한 바와 같이 세포를 다시 현탁시한다.
  7. 플레이트 200 μL의 CD34+ 섬유넥틴 단편당 세포 현탁액을 코팅된 48-웰 플레이트 및 48시간 동안 배양한다.
  8. 다음날, 종자 15,000 MS-5 기질 세포에서 200 μL의 완전한 DMEM의 웰당 48웰 조직 배양 처리 플레이트및 37°C에서 24시간 동안 배양하였다.
  9. 48 시간 의 자극 후, 부드러운 파이펫팅에 의해 CD34+ 세포를 수집합니다. 500 μL의 따뜻한 DMEM으로 우물을 씻고 셀 서스펜션으로 풀을 씻으하십시오.
  10. 트라이판 블루로 셀을 계산합니다. 600 x g에서 5분 동안 현탁액을 원심분리하고 1x 골수성 분화 배지의 5,000 세포/200 μL의 밀도에서 다시 현탁한다.
  11. 48웰 조직 배양 플레이트에서 MS-5 기질 세포로 시드하고, 세포를 방해하지 않고 배지를 부드럽게 흡인한다. 플레이트의 웰당 CD34+ 세포 현탁액의 200 μL(5,000 셀)을 층으로 하고 37°C에서 배양한다.
    참고: MS-5 세포의 배양은 완전한 DMEM에서 유지될 수 있다. CD34+ 세포가 시드되는 날, MS-5 세포는 균일 한 층 (80-90 % 합류)에 있어야합니다. MS-5 세포는 CD34+ 세포의 시딩 전에 적어도 24시간 전에 도금되는 것이 좋습니다.  MS-5 세포가 CD34+ 세포를 시종하기 전에 48시간 또는 72시간 도금되어야 하는 경우, 세포 밀도는 그에 따라 조정되어야 한다. 또한 48웰 플레이트의 주변 우물을 비워 두거나 가장자리 효과를 피하기 위해 200 μL의 멸균수로 채워두는 것이 좋습니다.
  12. 각 웰의 상부에서 배지의 100 μL을 부드럽게 제거하고 웰당 2x myeloid 분화 배지의 100 μL로 대체하여 3-4일마다 반중간 변화를 수행합니다.
  13. 21일째에, 유세포분석에 의한 골수성 계보 마커 발현 분석을 위해 세포를 수확한다. MS-5 층을 방해하지 않고 매체를 부드럽게 피펫하고 세포를 5 mL 튜브로 옮김하십시오.
    참고: 염색 및 유세포 분석의 경우, 1-2웰의 세포는 충분합니다. 분화는 또한 1일, 7일 및 14일에 모니터링될 수 있다. 여러 날에 면역 세포증을 수행하는 경우 분석에 필요한 우물의 수를 그에 따라 계산해야합니다.
  14. CD34(APC-Cy7), CD66b(PE-Cy7), CD14(PE), CD41(PerCP-Cy5.5) 및 CD235a(APC)에 대한 항체가 있는 5 x 105개의 세포를 총 부피 50μL의 총 부피에서 20분 동안 얼음 위에 인큐베이트합니다. 각 형광에 대한 긍정적 이고 부정적인 게이트, 및 분석에서 죽은 세포를 제거하기 위해 살아있는 / 죽은 얼룩으로 7-AAD.
  15. 전술한 바와 같이 염색된 세포를 세척하고 고치면(선택사항)한다(단계 4.3-4.6).
  16. 유세포분석 버퍼의 500 μL에서 세포를 다시 중단하고 유세포계에 의해 분석한다.

6. 세포 형태학의 평가

  1. 에탄올을 분사하고 삐걱 거리는 때까지 닦아 현미경 슬라이드를 청소합니다.
  2. 깨끗한 슬라이드를 RT에서 5분 동안 폴리-L-리신 용액에 담그고 RT에서 1시간 동안 건조시면 됩니다.
  3. 3.14단계에서 HSPC를 재중단시키고 10 μL의 유세포분석 버퍼에서 5.13단계로부터 분화된 세포를 재중단한다.
  4. 셀 서스펜션을 코팅된 슬라이드로 옮기고 공기 건조 상태로 둡니다.
    참고: 1일째부터 21일째까지의 슬라이드는 RT에 보관하고 동시에 염색할 수 있습니다.
  5. 슬라이드에 라이트-지엠사 얼룩 0.5 mL를 붓고 RT에서 3 분 동안 방치하십시오.
  6. 동일한 양의 이온수를 추가하고 RT에서 10분 더 방치하십시오.
  7. 슬라이드를 탈이온수로 씻습니다.
  8. 현미경으로 60x 또는 100x배의 배율로 염색된 세포를 시각화합니다.

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결과

상기 프로토콜의 적용은 ~100 mL의 제대혈 단위로부터 5.6(±0.5) x 108 MNC 및 1(±0.3) x 106 CD34+ 세포를 산출한다. 총 CD34+ 셀의 백분율은 80-90 % 사이의 범위입니다 (그림2A,B). Manz et al.5에 의해 기술된 계획에 의한 면역 표현형 분석은 CD34+ 세포가 일반적으로 린-/CD34+/CD38-및 린 -/CD34+인 ~20% HSC 및 ~72% MPP로 구성된다는 것을 보여줍니다. /CD38+, 각각 (그림1 및 그림 2A).<...

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토론

여기서 기재된 프로토콜은 UCB 유래 CD34+ HSPC의 생체 내 분화에 적합하여 4개의 골수성 혈통으로 한다. SCF, TPO, Flt3L 및 IL3로 구성된 사이토카인 혼합물을 사용하여 초기 배양은 CD34+ 세포를 자극한다. 그 후, SCF, IL3, Flt3L, EPO 및 TPO의 칵테일로 차별화가 달성됩니다. 이 혼합에서, SCF, IL3 및 Flt3L은 CD34+ HSC의 생존과 확산에 중요합니다. EPO와 TPO는 각각 적혈구 및 거핵구로 의 분화를 촉진하고 IL3는 초기 과립구 단핵구의 분화를 촉진합니다. 전구체 및 성숙한 세포13,17,18. 이 방법에 대한 한 가지 주의사항은 분화 된 세포의 백분율에서 관찰 된 변화입니다. 이것은 계보 세포를 초래하기 위하여 다른 공여자에게서 격리된 C...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

저자는 비식별 및 기증 코드 혈액 단위에 대한 마리코파 통합 건강 시스템의 웬디 배럿, 레이첼 카바예로, 가브리엘라 루이스, 흐름 세포 측정에 대한 도움을 Mrinalini 칼라, 게이 도둑과 크리스토퍼 씨트에 감사드립니다 전 생체 골수성 분화에 대한 조언. 이 작품은 건강의 국가 학회 (R21CA170786 및 R01GM127464)와 미국 암 학회 (기관 연구 보조금 74-001-34-IRG)에서 S.S.에 기금에 의해 지원되었습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.4% Trypan 블루 솔루션Thermo Fisher Scientific15250-061에서 작업 재고를 0.2%로 희석;
15575-038
10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)Invitrogen14185052멸균 증류수 및 pH를 사용하여 1x로 희석 7.2
2.5% 트립신, 페놀 레드 없음Thermo Fisher Scientific15090046멸균 1x PBS 30 µ로 작업 재고를 1x로 희석
; m 사전 분리 필터Miltenyi biotech130-041-407
35% 멸균 소 혈청 알부민Sigma-AldrichA7979
7-AADBiolegend420404 FACS 분석에서 죽은 세포를 제거하기 위해 살아있는/죽은 염색으로 사용
항인간 CD10-FITC 항체(클론 HI10a)Biolegend312207 1:20 희석 사용
Anti-human CD11b-FITC (activated) 항체 (Clone CBRM1/5)Biolegend301403Use 1:5 dilution
Anti-human CD123-APC 항체 (Clone 6H6)Biolegend306012Use 1:20 dilution
Anti-human CD14-PE 항체 (Clone M5E2)Biolegend301806Use 1:20 dilution
Anti-human CD19-FITC 항체 (Clone 4G7)BD Biosciences347543Use 1:5 dilution
Anti-human CD235a-APC 항체 (Clone GA-R2 (HIR2))BD Biosciences551336Use 1:20 dilution
Anti-human CD235a-FITC 항체 (Clone HIR2)Biolegend306609Use 1:50 dilution
Anti-human CD34-APC-Cy7 항체 (Clone 581)Biolegend343514Use 1:20 dilution
Anti-human CD38-PE 항체 (Clone HIT2)Biolegend3035061:20 희석액 사용
Anti-human CD3-FITC 항체 (Clone UCHT1)Biolegend300405Use 1:20 dilution
Anti-human CD41a-PerCP-Cy5.5 항체 (Clone HIP8)Biolegend303720Use 1:20 dilution
Anti-human CD45Ra-PE-Cy7 antibody (Clone HI100)Biolegend304126Use 1:20 dilution
Anti-human CD66b-PE-Cy7 항체 (Clone G10F5)Biolegend305116Use 1:20 희석
Anti-human CD7-FITC 항체 (Clone CD7-6B7)Biolegend3431031:20 희석
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fisher ScientificBP231-100Filter sterilize before use
Dulbecco' s L-글루타민을 함유한 DMEM(Modified Eagle Medium) 분말 Gibco121000461 패킷을 재구성하여 1 L의 DMEM 매체를 만듭니다
태아 소 혈청, 호주 소스, 열 비활성화Omega ScientificFB-22 Lot #609716
Human CD34 microbead kit Miltenyi biotech130-046-702
인간 트롬보포이에틴 (TPO), 연구 학년Miltenyi biotech130-094-011100 µ의 주식을 만드십시오; 1x PBS + 0.1% BSA의 g/mL. 골수성 분화 및 & 자극 매체
L-글루타민오메가 사이언티픽GS-602 mM 농도 자극 매체
LS 컬럼Miltenyi biotech130-042-401
MACS 멀티 스탠드Miltenyi biotech130-042-303
MidiMACS 자기 분리기Miltenyi biotech130-042-302
MNC 분별 매체 (Ficol-Paque PLUS)GE Healthcare Biosciences17-1440-03
MS-5 세포Gay Crooks, UCLA
파라포름알데히드시그마-알드리치P6148유리 비커에 1x PBS의 800mL를 화학 후드의 교반 플레이트에 가열합니다. 파라포름알데히드 분말 10g을 추가합니다. 파라포름알데히드를 완전히 용해시키려면 1N NaOH를 첨가하여 pH를 높입니다. 용액을 식히고 여과한 다음 1x PBS로 1L로 부피를 구성합니다. pH를 7.2로 조정합니다. 
페니실린 & 스트렙토마이신시그마-알드리치P4458-100ml
폴리-L 라이신시그마-알드리치P26361x PBS에서 10mg/mL 스톡 만들기
재조합 인간 에리트로포이에틴-알파(rHu EPO-&알파;)BioBasicRC213-151x PBS + 0.1% BSA에 2,000 units/mL의 재고를 만드십시오. 골수성 분화를 위해 4 units/mL 사용
재조합 인간 피브로넥틴 단편 (RetroNectin)Takara T100B는 20 µ를 사용합니다. g/mL는 CD34+ HSC를 자극하기 전에 웰을 코팅하기 위해 멸균 1x PBS에 희석됩니다.
재조합 인간 Flt-3 리간드 (rHu Flt-3L)BioBasicRC214-16100 µ의 주식을 만드십시오. 1x PBS + 0.1% BSA의 g/mL. 골수성 분화를 위해 5ng/mL를 사용합니다. 자극 매체에서 50 ng / mL
재조합 인간 인터루킨 -3 (rHu IL-3)BioBasicRC212-14100 µ의 주식을 만드십시오; 1x PBS + 0.1% BSA의 g/mL. 골수성 분화를 위해 5ng/mL를 사용합니다. 자극 매체에서 20 ng/mL
재조합 인간 줄기 세포 인자 (rHu SCF)BioBasicRC213-12100 µ의 재고를 만드십시오; 1x PBS + 0.1% BSA의 g/mL. 골수성 분화를 위해 5ng/mL를 사용합니다. 자극 매체에서 50 ng/mL
혈청 무료 매체 (X-Vivo-15)Lonza 04-418Q
소듐 바이카보네이피셔 사이언티픽BP328-500
Wright-Giemsa 염색, 수정된시그마-알드리치WG16-500제조사의 지시에 따라 사용
Equipment 
BD LSR II 유세포 분석기BD Biosciences
CentrifugeSorvall Legend RT
광학 현미경Olympus
멸균 1x PBS 0.5 M UltraPure 에틸렌 디아민 테트라 아세트산, pH 8.0 Gibco.트

참고문헌

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