여기서, 우리는 4개의 골수성 혈통에 제대혈 유래 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포의 면역표현특성 및 사이토카인 유도분화를 위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜의 적용은 CD34+ 세포의 골수성 분화에 대한 골수성 질환 돌연변이 또는 소분자의 영향에 대한 조사를 포함한다.
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이 논문에서
요약
초록
인간 조혈줄기세포의 생체내 분화는 조혈을 연구하기 위한 널리 사용되는 모델이다. 여기서 기재된 프로토콜은 4개의 골수성 혈통 세포로 의 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포의 분화를 유도하는 사이토카인을 위한 것이다. CD34+ 세포는 인간 탯줄 혈액으로부터 단리되고 사이토카인이 존재할 때 MS-5 기질 세포와 병용배한다. 줄기 및 전구 세포의 면역표현특성, 및 분화된 골수성 혈통 세포가 기재되어 있다. 이 프로토콜을 사용하여, CD34+ 세포는 작은 분자로 배양되거나 골수성 분화에 미치는 영향을 조사하기 위해 골수성 질환 돌연변이를 발현하기 위해 렌티바이러스로 트랜스화될 수 있다.
서론
조혈 줄기 세포 (HSCs)의 정상적인 분화는 모든 혈액 세포 계의 생리적 수준의 유지에 중요합니다. 분화 도중, 성장 인자 및 사이토카인을 포함하여 세포외 단서에 조정된 반응에서, HSCs는 먼저 림프-골수성 전위가 있는다능한 전구 (MPP) 세포를 초래합니다 1,2,3 ,4 (그림 1). MPP는 일반적인 골수성 전구 (CMP) 및 일반적인 림프종 전구 (Clps)를 계보 제한되는 초래합니다. CLPs는 B, T 및 자연 킬러 세포로 구성된 림프계로 분화합니다. CmP는 2개의 더 제한된 전구 인구, 거핵구 적혈구 전구체 (MEPs) 및 과립 구체 질 전구체 (GPS)를 통해 골수성 계보를 생성합니다. MEP는 거핵구와 적혈구를 초래하는 반면, GPS는 과립구및 단핵구를 초래합니다. CmPs를 통해 발생하는 것 외에도, 거핵구는 또한 비 표준 경로5,6을통해 HSC 또는 초기 MPP에서 직접 발생하는 것....
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프로토콜
실험을 위한 인간 탯줄 혈액은 마리코파 통합 건강 시스템 (MIHS), 피닉스에 통보된 동의 후에 건강한 개별에 의해 기증되었습니다. 식별되지 는 단위는 MIHS와 애리조나 대학 사이의 재료 이전 계약을 통해 얻은.
1. 시약 및 버퍼
참고: 생물학적 안전 캐비닛에 멸균 조건하에서 모든 시약과 완충장치를 준비합니다.
- 멸균 PBS-BSA-EDTA (PBE) 완충액을 7.2 mL의 멸균 35% 소 혈청 알부민 (BSA; 사용 멸균 조직 배양 등급 35% BSA) 및 멸균 0.5 M 에틸렌 당탄 테트라 아세트산 (EDTA)의 5 mL를 487.8 mL에 첨가하여 제조 식염수 (DPBS). 필터 살균 및 탈가스 버퍼는 적어도 2 시간 동안 생물학적 안전 캐비닛에 진공에 부착 된 필터를 방치하여 더 작은 부피 (250 mL)에서 탈 가스 완충액을 4 °C에서 저장합니다.
- 행크스 균형 소금 용액 1회(HBSS 1x)를 준비합니다. 멸균 증류수 900mL에 10x HBSS 스톡 100mL을 희석하여 1X HBSS 의 1L을 만들고 pH를 7.2로 조정합니다. 사용하기 전에 1x HBSS를 살균하는 필터.
- 증류수 98 mL에....
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결과
상기 프로토콜의 적용은 ~100 mL의 제대혈 단위로부터 5.6(±0.5) x 108 MNC 및 1(±0.3) x 106 CD34+ 세포를 산출한다. 총 CD34+ 셀의 백분율은 80-90 % 사이의 범위입니다 (그림2A,B). Manz et al.5에 의해 기술된 계획에 의한 면역 표현형 분석은 CD34+ 세포가 일반적으로 린-/CD34+/CD38-및 린 -/CD34+인 ~20% HSC 및 ~72% MPP로 구성된다는 것을 보여줍니다. /CD38+, 각각 (그림1 및 그림 2A).<.......
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토론
여기서 기재된 프로토콜은 UCB 유래 CD34+ HSPC의 생체 내 분화에 적합하여 4개의 골수성 혈통으로 한다. SCF, TPO, Flt3L 및 IL3로 구성된 사이토카인 혼합물을 사용하여 초기 배양은 CD34+ 세포를 자극한다. 그 후, SCF, IL3, Flt3L, EPO 및 TPO의 칵테일로 차별화가 달성됩니다. 이 혼합에서, SCF, IL3 및 Flt3L은 CD34+ HSC의 생존과 확산에 중요합니다. EPO와 TPO는 각각 적혈구 및 거핵구로 의 분화를 촉진하고 IL3는 초기 과립구 단핵구의 분화를 촉진합니다. 전구체 및 성숙한 세포13,17,18. 이 방법에 대한 한 가지 주의사항은 분화 된 세포의 백분율에서 관찰 된 변화입니다. 이것은 계보 세포를 초래하기 위하여 다른 공여자에게서 격리된 C.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
저자는 비식별 및 기증 코드 혈액 단위에 대한 마리코파 통합 건강 시스템의 웬디 배럿, 레이첼 카바예로, 가브리엘라 루이스, 흐름 세포 측정에 대한 도움을 Mrinalini 칼라, 게이 도둑과 크리스토퍼 씨트에 감사드립니다 전 생체 골수성 분화에 대한 조언. 이 작품은 건강의 국가 학회 (R21CA170786 및 R01GM127464)와 미국 암 학회 (기관 연구 보조금 74-001-34-IRG)에서 S.S.에 기금에 의해 지원되었습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.4% Trypan 블루 솔루션 | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | 에서 작업 재고를 0.2%로 희석; |
| 15575-038 | |||
| 10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14185052 | 멸균 증류수 및 pH를 사용하여 1x로 희석 7.2 |
| 2.5% 트립신, 페놀 레드 없음 | Thermo Fisher Scientific | 15090046 | 멸균 1x PBS 30 µ로 작업 재고를 1x로 희석 |
| ; m 사전 분리 필터 | Miltenyi biotech | 130-041-407 | |
| 35% 멸균 소 혈청 알부민 | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| 7-AAD | Biolegend | 420404 FACS 분석에서 죽은 세포를 제거하기 위해 살아있는/죽은 염색으로 사용 | |
| 항인간 CD10-FITC 항체(클론 HI10a) | Biolegend | 312207 1:20 희석 사용 | |
| Anti-human CD11b-FITC (activated) 항체 (Clone CBRM1/5) | Biolegend | 301403 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD123-APC 항체 (Clone 6H6) | Biolegend | 306012 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD14-PE 항체 (Clone M5E2) | Biolegend | 301806 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD19-FITC 항체 (Clone 4G7) | BD Biosciences | 347543 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD235a-APC 항체 (Clone GA-R2 (HIR2)) | BD Biosciences | 551336 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD235a-FITC 항체 (Clone HIR2) | Biolegend | 306609 | Use 1:50 dilution |
| Anti-human CD34-APC-Cy7 항체 (Clone 581) | Biolegend | 343514 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD38-PE 항체 (Clone HIT2) | Biolegend | 303506 | 1:20 희석액 사용 |
| Anti-human CD3-FITC 항체 (Clone UCHT1) | Biolegend | 300405 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD41a-PerCP-Cy5.5 항체 (Clone HIP8) | Biolegend | 303720 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD45Ra-PE-Cy7 antibody (Clone HI100) | Biolegend | 304126 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD66b-PE-Cy7 항체 (Clone G10F5) | Biolegend | 305116 | Use 1:20 희석 |
| Anti-human CD7-FITC 항체 (Clone CD7-6B7) | Biolegend | 343103 | 1:20 희석 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Filter sterilize before use |
| Dulbecco' s L-글루타민을 함유한 DMEM(Modified Eagle Medium) 분말 | Gibco | 12100046 | 1 패킷을 재구성하여 1 L의 DMEM 매체를 만듭니다 |
| 태아 소 혈청, 호주 소스, 열 비활성화 | Omega Scientific | FB-22 Lot #609716 | |
| Human CD34 microbead kit | Miltenyi biotech | 130-046-702 | |
| 인간 트롬보포이에틴 (TPO), 연구 학년 | Miltenyi biotech | 130-094-011 | 100 µ의 주식을 만드십시오; 1x PBS + 0.1% BSA의 g/mL. 골수성 분화 및 & 자극 매체 |
| L-글루타민 | 오메가 사이언티픽 | GS-60 | 2 mM 농도 자극 매체 |
| LS 컬럼 | Miltenyi biotech | 130-042-401 | |
| MACS 멀티 스탠드 | Miltenyi biotech | 130-042-303 | |
| MidiMACS 자기 분리기 | Miltenyi biotech | 130-042-302 | |
| MNC 분별 매체 (Ficol-Paque PLUS) | GE Healthcare Biosciences | 17-1440-03 | |
| MS-5 세포 | Gay Crooks, UCLA | ||
| 파라포름알데히드 | 시그마-알드리치 | P6148 | 유리 비커에 1x PBS의 800mL를 화학 후드의 교반 플레이트에 가열합니다. 파라포름알데히드 분말 10g을 추가합니다. 파라포름알데히드를 완전히 용해시키려면 1N NaOH를 첨가하여 pH를 높입니다. 용액을 식히고 여과한 다음 1x PBS로 1L로 부피를 구성합니다. pH를 7.2로 조정합니다. |
| 페니실린 & 스트렙토마이신 | 시그마-알드리치 | P4458-100ml | |
| 폴리-L 라이신 | 시그마-알드리치 | P2636 | 1x PBS에서 10mg/mL 스톡 만들기 |
| 재조합 인간 에리트로포이에틴-알파(rHu EPO-&알파;) | BioBasic | RC213-15 | 1x PBS + 0.1% BSA에 2,000 units/mL의 재고를 만드십시오. 골수성 분화를 위해 4 units/mL 사용 |
| 재조합 인간 피브로넥틴 단편 (RetroNectin) | Takara | T100B | 는 20 µ를 사용합니다. g/mL는 CD34+ HSC를 자극하기 전에 웰을 코팅하기 위해 멸균 1x PBS에 희석됩니다. |
| 재조합 인간 Flt-3 리간드 (rHu Flt-3L) | BioBasic | RC214-16 | 100 µ의 주식을 만드십시오. 1x PBS + 0.1% BSA의 g/mL. 골수성 분화를 위해 5ng/mL를 사용합니다. 자극 매체에서 50 ng / mL |
| 재조합 인간 인터루킨 -3 (rHu IL-3) | BioBasic | RC212-14 | 100 µ의 주식을 만드십시오; 1x PBS + 0.1% BSA의 g/mL. 골수성 분화를 위해 5ng/mL를 사용합니다. 자극 매체에서 20 ng/mL |
| 재조합 인간 줄기 세포 인자 (rHu SCF) | BioBasic | RC213-12 | 100 µ의 재고를 만드십시오; 1x PBS + 0.1% BSA의 g/mL. 골수성 분화를 위해 5ng/mL를 사용합니다. 자극 매체에서 50 ng/mL |
| 혈청 무료 매체 (X-Vivo-15) | Lonza | 04-418Q | |
| 소듐 바이카보네이 | 피셔 사이언티픽 | BP328-500 | |
| Wright-Giemsa 염색, 수정된 | 시그마-알드리치 | WG16-500 | 제조사의 지시에 따라 사용 |
| Equipment | |||
| BD LSR II 유세포 분석기 | BD Biosciences | ||
| Centrifuge | Sorvall Legend RT | ||
| 광학 현미경 | Olympus |
참고문헌
- Hao, Q. L., Shah, A. J., Thiemann, F. T., Smogorzewska, E. M., Crooks, G. M. A functional comparison of CD34 + CD38- cells in cord blood and bone marrow. Blood. 86 (10), 3745-3753 (1995).
- Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L.
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재인쇄 및 허가
