마우스 생식 기관 자발적 운동성 및 데이터 분석을 위한 MATLAB 기반 자궁 운동 추적 알고리즘을 평가하기 위한 Ex Vivo 방법

주요 여성 기관으로서 자궁은 태아의 영양을 위해 생식에 매우 중요하며필수적입니다 1. 자궁은 3 개의 층으로 구성됩니다 : 회막, 근막 및 자궁 내막. myometrium는 자궁의 중요한 수축층이고 태아 납품에 있는 중요한 역할을 합니다. 자궁 내막은 자궁 구멍을 안감하는 가장 안쪽 층이고 태아 이식을 위해 필수적입니다. 생식 연령의 임신하지 않은 여성에서 자궁 내막 층은 월경 주기의 시작 부분에 매달 흘린다. 근막은 자궁에서 괴사 자궁 내막 조직을 지우는 데 필요한 자발적인 근심 수축을 유지함으로써이흘리기 과정에서 보조합니다 1.

불행 하 게도, 증가 근심 수축 월 경 질 등 부정적인 부작용귀 착될 수 있습니다., 또는 고통 스러운 생리 경련. 이것은 특히 젊은 여성과 nulliparous 여성2에서 볼 수 있습니다. 그러나, 월경기는 모든 여성을 위해 다르며 근심 수축의 강도에 따라 다릅니다. 강한 수축은 종종 심한 경련의 감각과^연관3. 근위축성은 자궁초음파를 사용하여 가시화될 수 있으며 자궁내막파로 인식되기도 합니다. 자궁내막 슬루핑을 겪고 있는 자궁에서 생리 중 프로스타글란딘의 향상된 방출^4은 근심시험 과수축성 증가에 기여하여 자궁 근육의 허혈 및 저산소증을 초래하고, 따라서 증가시키는 것으로 여겨진다. 통증³.

심한 월경불순은 일부 여성의 일상 적인 활동을 방해 할 수 있으며 여성의 3 ~ 33 %는 매우 심한 통증을 가지고 있으며, 이는 여성이 각 생리 주기⁵일 동안 침대에 누워있을 수 있습니다. 월경불협은 연령, 국적,^{경제상태에}관계없이 생식연령여성의 부인과이병의 주요 원인5. 월경불순의 추정 된 보급은 생식 연령^5의여성에서 45 %에서 93 %까지 높고 가변적입니다.  월경불경 관련 통증은 여성의 일상 생활에 영향을 미치며 청소년의 학업 성적 저하, 수면의 질 저하, 일상 활동의 제한 및 기분 변화⁵.

가혹한 월경불위를 경험하는 많은 여자는 그들의 고통을 구호하기 위하여 창구 판매 약물에 의지합니다. 이러한 창구 판매 약물은 프로스타글란딘의 형성을 방지하는 사이클로옥시게나제 (COX) 억제제를 함유하고^있습니다6. 그러나 COX 억제제는 불리한 심혈관 사건과 관련이 있으며, 월경불경을 가진 여성의 약 18%는이러한 억제제 7에 반응하지 않습니다. 따라서 생리통을 줄이기 위해 새로운 약물이 필요합니다. 자궁의 수축성 이상이 월경불허의 발병기전에 기여하기 때문에 한 가지 가능한 전략은 자궁 이완제의 사용일 수 있습니다.

그것은 자연스럽 게 발생 하는 자발적인 심근 파 같은 수축의 모델에서 잠재적인 이완 제 약물의 효과 정량화 하는 것이 도움이. 그러나, 지금까지, 온전한 자궁에서 근육 이완 약물을 시험하기 위한 효율적인 생체 내 생체 내 방법은 설명되지 않았다. 현재, 아이소메트릭 장력 측정은 이완제 약물 효과를 평가하는 데 사용됩니다. 이러한 측정 동안, 자궁 근육 스트립은 조직 목욕에서 예압하에 일정한 길이로 유지되며 자궁 근육 수축의 힘은 이완제 약물의 존재 또는 부재 에서 옥시토신 자극 전후로 기록됩니다. 이 방법은 매우 유용하지만, 그것은 비싼 장비가 필요합니다. 또한, 등각부종 수축은 자연그대로 자궁에서 자연적으로 발생하는 자발적인 근심파와 유사한 수축과 유사하지 않습니다. 유일하게, 설치류에 있는 자궁 근심파는 전체 생식 기관 (난소, 난관, 자궁 및 질)가 완충액에서 유지될 때 자궁 혼 운동성으로 구상될 수 있습니다. 여기서, 우리는 산소화 된 크렙스 버퍼를 포함하는 페트리 접시에 배치 된 그대로 마우스 자궁의 자발적인 운동성을 모니터링하기위한 생체 내 방법을 제시한다. 또한 MATLAB 모션 트래커를 활용한 운동성 정량화 알고리즘에 대해서도 설명합니다. 이 새로운 접근 방식은 자연적으로 발생하는 치료법과 합성 화합물의 이완 잠재력을 테스트하기 위한 쉽고 저렴한 대안을 제공합니다.

동물을 가진 모든 절차는 인디애나 대학 의과 대학 (인디애나 폴리스, IN)의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 2-5개월 된 F2-129S-C57BL/6 성적으로 성숙한 암컷 마우스를 연구에 사용하였다.

주의 사항: 동물 및 생체 유해 물질로 작업할 때 실험실 코트, 마스크 및 장갑을 착용하여 안전을 보장합니다.

1. 솔루션 준비

1. 포함 크렙스 버퍼를 준비, 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl_2,1.2 mM NaH₂PO_4,0.56 mM MgCl_2,25 mM NaHCO_3,및 5 mM 포도당, pH 7.4. 순환 수조를 사용하여 37°C에서 완충온도를 유지하면서 5% CO2 및 95% O2를 함유하는 압축 가스의 혼합물로 크렙스 완충액을 연속하여 산소화한다.
2. 2.68 mM KCl, 1.47 mM KH₂PO_4,136.89 mM NaCl, 8.1 mM Na₂HPO 4, pH 7.4를포함하는 덜베코의 인산완충식염수(DPBS)를 준비한다.

2. 동물 준비

1. 이소플루란 흡입을 사용하여 마우스를 마취 (3%) 폐 가스 청소와 함께. 철수 반사를 평가하여 적절한 마취를 보장하십시오. 뒤쪽 발가락을 꼬집어 움직임이 없음을 확인하여 반사 반응의 손실을 나타냅니다. 깊은 마취가 달성 된 후, 참수에 의해 동물을 안락사.
   참고: 이소플루란은 평활근 팽창을 일으킬 수 있습니다. 따라서, 생식 기관 제제는 생체 내 실험을 시작하기 전에 적어도 15-30 분 동안 크렙스 완충제에서 광범위하게 세척되고 배양되어야 한다. 이소플루란은 피부에 닿을 때 자극과 불편함을 유발할 수 있으므로 주의해서 진행하십시오.
2. 종이 타월이 늘어선 큰 계량 보트에 몸을 놓습니다.
   참고: 임신 한 여성 실험실 직원은 태아의 체중을 감소시키고 태아 골격 골화를 감소시키고 자발적 낙태의 위험을 증가시킬 수 있기 때문에 isoflurane을 가진 실험에 관여해서는 안됩니다^8,9. _CO2 흡입은 마우스를 안락사시키는 대용품으로서 사용될 수 있다.

3. 에스트로스 사이클 스테이지 의 결정

1. 작은 집게로 클리토리스를 들어 올려 질 오슘에 접근하고 10 μL의 DPBS를 함유 한 마이크로 파이펫 팁을 천천히 질에 삽입하십시오.
   1. 마이크로파이펫 팁이 질 벽에 구멍을 뚫지 않도록 10- 30°의 각도로 오슘을 통해 삽입되었는지 확인합니다. 액체는 삽입 후에도 팁에 계속 표시되어야 합니다. 액체가 보이지 않는 경우에, 끝은 질로 너무 멀리 삽입되고, 질의 paracervical 지역은 천포되었을 지도 모릅니다.
   2. 마이크로파이펫 끝으로 질 오슘 근육을 가볍게 잡아당겨 공기가 질에서 빠져나올 수 있도록 합니다.
2. DPBS 10 μL로 2-3회 위아래로 파이펫팅하여 질 구멍을 천천히 세척하고 유리 슬라이드에 그려진 셀 현탁액을 놓습니다.
3. 반전된 상 대비 현미경을 사용하여 세포학적 분석을 통해 에스트로스 주기 단계를 결정합니다. 절차는 다른 곳에서 설명 한 대로 수행^10,11. 세포 학적 분석을 수행하기 전에 세포 현탁액이 건조되지 않았는지 확인하십시오. 서스펜션은 필요한 경우 신선한 DPBS로 희석될 수 있다.

4. 마우스 생식 기관 Ddissection

1. 마우스를 척추 위치에 배치하고 사지를 확산하여 복부 골반 부위를 노출시하십시오.
2. 70% 에탄올로 스프레이하여 복부를 적시고 소독합니다.
3. 포셉을 사용하여 클리토리스보다 우수한 피부를 조심스럽게 들어 올립니다. 복막을 노출하기 위해 상지까지 하복부 영역의 측면 측면에 작은 횡절개를 합니다 (그림1A). 이 과정에서 외부 플랩이 형성됩니다. 작은 절개가 지속적으로 만들어지면 플랩의 크기가 증가합니다.
4. 조심스럽게 위장관을 노출하는 각막을 잘라 (그림1B). 자궁 경적 종종 peritoneum 의 밑에 직접 위치 할 수 있다는 것을 주의하는 것이 중요합니다, 그래서 조심스럽게 절개를하고이 자궁 운동성에 영향을 미칠 수 있기 때문에 뿔을 만지지 마십시오.
5. 집게를 사용하여 위장관을 덮는 근막과 지방 조직을 제거하십시오. 복강에서 다음 위장관 세그먼트를 제거: 십이지장, jejunum, 장, 장, 요양, 오름차순 및 횡결장 (그림1C).
6. 생식 기관을 찾으려면 먼저 안락사 후 무효로 인해 수축 된 외관을 가질 수있는 오줌 방광 (그림1C, "4")을 식별하십시오. 질은 오줌 방광의 밑에 있을 것입니다.
7. 음모 뼈의 합류에서 음모 심포지엄을 찾습니다 (방광에 가시적으로).
8. 가위를 사용하여, 신중하게 간 섬유 판염 조직을 통해 측면에 절개를함으로써 음모 심경을 제거하고 질을 추출하기위한 경로를 제공하고 (그림1D).
9. 외음부의 항문과 하부 사이에위치한 회음부를 통해 잘라.
10. 집게를 사용하여 질을 들어 올리고 천천히 직장을 절제하십시오.
11. 질에 장밋빛 포크로 분기 두 자궁 뿔을 식별합니다. 각 뿔의 끝에 복잡한 난관과 난소를 찾아, 이는 나머지 위장관 세그먼트 아래에 숨길 수 있습니다. 작은 해부 가위를 사용하여 복강 내의 뿔, 난관 및 난소를 연결하고 지지하는 인대를 제거하십시오.
12. 복강에서 질, 자궁, 난관 및 난소를 포함하는 생식 기관을 제거하십시오.
13. 단리된 생식 기관(그림1E)을 100 mm 페트리 접시에 DPBS 10 mL로 채워진 다. 자궁 경적을 압축하여 근중세균을 손상시키지 않도록 하십시오.
14. 집게와 외과 가위를 사용하여 자궁 뿔과 질을 둘러싼 결합 및 지방 조직뿐만 아니라 음부 부위의 모피를 제거하여 이미지 품질을 방해할 수 있습니다. 자궁 경적의 운동성을 허용하기 위해 넓은 인대를 제거하십시오.
15. 분리된 생식 기관을 신선한 DPBS로 두 번 세척하고 3mL의 산소 로고된 크렙스 용액으로 채워진 35mm 페트리 접시로 옮니다.

5. 조직 화상 진찰

1. 산소화된 크렙스 버퍼에 생식기관을 함유한 페트리 접시를 검은 표면에 놓습니다. 접시를 실온에서 유지합니다.
   참고: 적외선 온난화 패드를 사용하여 37°C에서 조직을 유지할 수 있습니다.
2. 자발적인 수축이 시작될 수 있도록 15-30분 간 허용하십시오. 모든 유형의 디지털 비디오 장비를 사용하여 축 평면에서 10 분 동안 자발적인 자궁 운동성을 기록하십시오.
3. 시험 화합물로 보충된 산소화 된 크렙스 완충제를 함유한 페트리 접시로 제제를 옮김. 디지털 비디오 장비의 모든 유형을 사용하여 축 평면에서 약 10 분 동안 자발적인 자궁 운동성을 기록합니다.
4. 치료의 가역성을 평가하기 위해 DPBS의 10mL로 100mm 페트리 접시에 전체 생식 기관을 세척합니다.
5. 갓 산소를 공급받은 크렙스 버퍼로 페트리 접시에 준비를 옮김. 디지털 비디오 장비의 모든 유형을 사용하여 축 평면에서 약 10 분 동안 자발적인 자궁 운동성을 기록합니다.
6. 자발적인 자궁 운동성에 기계적으로 유도된 변화가 없도록 시험 화합물을 위한 비히클과 함께 보충된 산소화 된 Krebs 버퍼로 채워진 다른 35 mm 페트리 접시로 준비를 옮김. 이것은 중요한 제어입니다.
7. 비디오 푸티지를 컴퓨터 하드 드라이브로 전송합니다.

6. 데이터 분석

1. 컨트롤, 처리 및 세척 에피소드가 포함된 원본 비디오 푸티지의 비디오 편집 소프트웨어를 사용하여 클립을 만듭니다.
2. MATLAB 소프트웨어와 제공된 스크립트(온라인 보충 자료 참조)를 사용하여 자발적인 자궁 운동성을 정량화합니다.
   참고: 스크립트가 완벽하게 작동하려면 MATLAB용 컴퓨터 비전 도구 상자 추가 기능을 설치해야 합니다.
   1. MATLAB 스크립트를 열고 편집기 탭으로 이동한 다음 실행 을클릭합니다.
   2. 첫 번째 비디오 파일을 선택하고 열기를 클릭합니다.
   3. 팝업 대화 상자에 비디오 파일에 대한 레이블을 입력하고 확인을 클릭합니다.
   4. 경적 이동 속도를 계산하는 데 필요한 시간 간격(들)을 입력합니다(Δ 유클리드 거리 /Δs).
   5. 마우스 커서를 사용하여 비디오의 첫 번째 프레임에서 두 점을 선택합니다. 팝업 창에서 선택한 포인트를 추적에 사용해야 하는지 확인하라는 요청이 표시됩니다. 시작을 클릭하여 팝업 창에 표시되는 실시간 추적 프로세스를 시작합니다. 또는 점 재선택을 클릭하여 두 점을 다시 선택합니다.
   6. 팝업 창에서 추적 프로세스의 정확도를 모니터링합니다.
   7. 새 팝업 창에서 속도 대 시간 산란도표 및 거리 와 시간 분산도를 관찰합니다. FILE |을 선택하여 두 그림을 저장합니다. 데이터를 문서화하려면 동일한 창에서 와 같이 저장합니다.
   8. MATLAB 스크립트가 있는 동일한 디렉토리에서 MATLAB에서 자동으로 만든 PointTrackerData라는폴더를 찾습니다. 두 개의 별도 워크시트 탭에서 비디오에서 수집된 데이터 요소가 포함된 label_Data라는 Excel 파일을 식별합니다.
      참고 : 모든 대체 모션 추적 소프트웨어는 자발적인 자궁 운동성을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.
3. 적절한 소프트웨어(예: Excel 또는 SigmaPlot 13)를 사용하여 통계 분석을 수행합니다.

도 1은 본 프로토콜에 기재된 전체 생식관 격리 절차 동안 촬영된 대표적인 이미지를 나타낸다. 비디오 품질을 저하시킬 수 있는 모피로 버퍼를 오염시키는 것을 방지하기 위해 마우스 본체를 70% 에탄올로 적십시켰습니다. 프로토콜의 해부 섹션에 대한 주요 벤치 마크는 오줌 방광을 찾는 것입니다. 자궁과 질은 오줌 방광에 열등하게 위치할 것입니다.

프로토콜을 테스트하기 위해, 우리는 에피네프린으로 전체 생식 기관을 치료했습니다. 피 네 프 린 은 자 두 근 이완을 일으키는 원인이 되는 잘 알려져 있다. 이 호르몬은 내 생 부 신 수 질에서 생산 하 고 포유류에서 스트레스 호르몬 역. 우리는 실험에서 1 μM 에피네프린을 사용했습니다. 이는 최대 반응을 유발하는 것으로 알려진 포화농도(12)이다. 4개의 실험의 시리즈를 수행하였다. 모든 시험에서, 1 μM 피네프린가 자발적으로 자궁 운동성을 가역적으로억제하였다(그림 2).

생식 기관의 자발적인 운동성을 정량화하기 위해 마우스 생식 기관에서 선택한 두 지점 사이의 유클리드 거리의 평균 변화 속도를 평가할 수 있는 알고리즘을 설계했습니다. 포인트 위치는 MATLAB 소프트웨어의 모션 트래킹 모듈을 사용하여 추적됩니다. 유클리드 거리를 계산하는 데 사용한 MATLAB의 해당 스크립트는 온라인 보충 자료에 제공됩니다. 포인트의 위치는 성공적인 모션 트래킹 절차에 매우 중요합니다. Petri 접시 의 벽에서 빛 반사가 모션 트래커를 방해 할 수 있기 때문에 비디오의 품질에 대해 신중하게 고려해야하며, 라이트 중 하나에 점을 다시 할당하는 동안 경적 움직임 추적을 중지 할 수 있습니다. 반사. 우리는 페트리 접시 벽 반사에서 충분히 멀리 있는지 확인하기 위해 경적 의 중간에 포인트 중 하나를 배치하기로 결정했습니다. 두 번째 점은 일반적으로 자발적인 운동성을 나타내지 않았기 때문에 질에서 선택되었습니다. 그림 3은 데이터 분석 샘플을 제공하고, 보충 그림 1은 모션 추적 중에 획득한 대표 이미지를 보여 주다.

그림 1 : 전체 생식기관 분리단계. (A) 피부에 절개가 이루어졌고 복부 골반 부위가 복막 (1) 위에 노출되었습니다. (B) 장액막을 천천히 열어 위장관을 노출하였다(2). (C) 위장관은 자궁경적을 노출시키기 위해 이동하였다(3). 오줌 방광 (4)는 뿔의 결합 의 가까이에 구상될 수 있습니다. (D) 자궁경적항이 풀려나 음부(5)의 측면측에 상처가 되어 질을 노출시켰다(6). (E) 분리된 생식기관을 제거하고 DPBS 용액에 배치한다. 임의의 과잉 모피 또는 결합 조직을 제거시켰다. (F) 직장을 제거 한 후 질 (오른쪽)에서 깊은 들여 쓰기를 볼 수 있습니다 (왼쪽, 7). (G) 주변 결합 조직이 제거됩니다. 디지털 카메라 및 애플리케이션 스위트 소프트웨어(버전 3.7.0)는 해부(카메라 설정: 색조 20/채도 80)동안 실시간 이미지를 획득하는 데 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2 : 전체 분리된 생식기관을 위한 대표적인 실험이 표시됩니다. 이미지는 1μM 피네프린을 적용하기 전(A), (B) 및 후(C) 적용 전 15s를 촬영하였다. 생식 기관 제제는 에피네프린이 없는 패널 A 및 C에서 높은 운동성을 나타내었지만, 1 μM 에피네프린이 존재하는 패널 B에서 정지하다. 편집되지 않은 비디오 푸티지는 보충 비디오 1-3으로제공됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3 : 생체외 실험에서 데이터 분석 그림 2. (A) 유클리드 거리 변화율의 시간 과정이 표시됩니다. 자발적인 자궁 운동성 동안 거리가 결정된 기준점은 인세트에 녹색 점으로 표시됩니다. 포인트는 묘사 된 바와 같이 질의 근위 부분과 자궁 경적의 중간 세그먼트에서 선택되었다. 청색 채워진 원은 에피네프린을 추가하기 전에 자발적인 운동성 비율 값을 보여주고, 빨간색 원은 1 μM 에피네프린이 있는 경우 자발적인 운동률을 나타내고, 녹색 으로 채워진 원은 세척 후 자발적인 운동률을 보여준다. (B) 에피네프린(blue bar)을 첨가하기 전의 평균 유클리드 거리 변화율(픽셀/s)의 비교, 1 μM 에피네프린(빨간 막대)의 존재, 및 세척 후(녹색 막대) MATLAB 소프트웨어는 자궁 운동성을 정량화하는 데 사용되었습니다. Δt 간격은 5s. "ΔDistance"로 설정되었고 초기 프레임 거리와 5초 후프레임 거리 사이의 차이로 계산된다. 통계 분석은 SigmaPlot 13을 사용하는 던의 방법에 따라 모든 쌍으로 여러 비교 절차가 다음 순위에 분산의 Kruskal-Wallis 편도 분석을 사용하여 수행되었다. 별표는 다른 실험 데이터 세트와 크게 다른 데이터 집합을 나타냅니다(P = <0.001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 영화 1: 1 μM 피네프린을 추가하기 전에 자발적인 자궁 운동성을 보여주는 타임 랩스 비디오 클립. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)

보충 영상 2: 크렙스 완충제가 1 μM 에피네프린으로 보충되었을 때 자발적인 자궁 운동성을 보여주는 타임랩스 비디오 클립. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)

보충 영화 3: 세척 후 자발적인 자궁 운동성을 보여주는 타임 랩스 비디오 클립. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)

추가 그림 1: 모션 추적 중에 15s마다 찍은 대표 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 자료: MATLAB 기반 추적 알고리즘 스크립트입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 공개 할 것이 없다.