여기서는 작은 RNA를 격리하고, microRNAs를 보강하고, 처리량이 높은 시퀀싱을 위한 샘플을 준비하기 위한 단계별 전략을 설명합니다. 그런 다음 시퀀스 읽기를 처리하고 오픈 소스 도구를 사용하여 microRNAs에 정렬하는 방법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
모든 인간 적인 전사체의 반은 microRNAs에 의해 통제되기 위하여 생각됩니다. 따라서 microRNA 발현을 정량화하면 질병 상태의 기본 메커니즘을 밝히고 치료 대상 및 바이오마커를 제공할 수 있습니다. 여기서는 마이크로RNA를 정확하게 정량화하는 방법을 자세히 설명합니다. 간단히 말해서, 이 방법은 microRNAs를 분리하고, 고처리량 시퀀싱에 적합한 어댑터에 합착하고, 최종 제품을 증폭하고, 샘플 라이브러리를 준비하는 방법을 설명합니다. 이어서, 얻어진 시퀀싱 읽기를 마이크로RNA 헤어핀에 정렬하고, 정량화, 정규화 및 차등 발현을 계산하는 방법을 설명한다. 다재다능하고 견고한 이 결합된 실험 워크플로우와 생물정보학 분석을 통해 사용자는 조직 추출을 시작하고 microRNA 정량화로 마무리할 수 있습니다.
서론
1993년에 처음발견된 1, 현재 거의 2000개의 마이크로RNA가 인간 게놈2에존재하는 것으로 추정된다. MicroRNAs는 전형적으로 21-24 뉴클레오티드 긴 작은 비코딩 RNA입니다. 그(것)들은 단백질 발현을 억압하고 mRNA를 저하시키기 위하여 표적 유전자의 3-번역되지 않은 지역 (3-UTR)에 있는 상보적인 사이트에 수시로 결합하는 유전자 발현의 사후 전사 조절자입니다. 마이크로RNA를 정량화하면 유전자 발현에 대한 귀중한 통찰력을 제공할수 있으며 이 목적을 위해 여러 프로토콜이 개발되었습니다 3.
당사는 작은 RNA 시퀀싱을 위한 정의되고 재현 가능하며 오래 지속되는 프로토콜을 개발했으며, 오픈 소스 생물정보학 도구를 사용하여 정규화된 판독을 분석했습니다. 중요한 것은, 우리의 프로토콜은 내인성 microRNAs와 외인성 으로 마이크로RNA 와 같은 종을 생성하는 생성물 모두를 동시에 식별할 수 있게 하는 동시에, 리보솜 RNA를 포함한 다른 작은 RNA 종에 대한 지도를 최소화하는 동시에 ( rRNA), RNA 유래 작은 RNA(tsRNAs), 반복 유래 작은 RNA 및 mRNA 분해 산물을 전달한....
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프로토콜
동물 실험은 워싱턴 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
작은 RNA 라이브러리 준비
1. RNA 격리
- 표준 RNA 격리 시약 또는 마이크로RNA를 농축하는 키트를 사용하여 생물학적 공급원으로부터 RNA를 분리합니다. 조직의 경우 액체 질소에서 스냅 냉동 시료로 시작하여 미리 냉각 된 모르타르와 유봉을 사용하여 분말로 분쇄하는 것이 가장 좋습니다.
- RNA를 정량화하고 RNA 무결성 번호(RIN)를 제공할 수 있는 기기에서 각 샘플의 RNA 무결성을 측정합니다. Rin은 >7이어야 합니다.
2. 3' 어댑터 결찰
- PCR 스트립 튜브에서 결찰 반응을 준비: RNA 11 μL (1-3 μg, 각 샘플에 대해 동일한 양을 사용), 1.5 μL의 10x T4 RNA 리가제 반응 완충제, ATP 무료, 폴리 에틸렌 글리콜 (PEG) 1 μL, 및 0.5 μL의 3'링커 (100m 00ml 커)를 참조하십시오.
참고: ATP가 없으면 miRNA를 풍부하게 하고 mRNA 분해 제품의 복제를 최소화할 수 있습니다....
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결과
라이브러리 준비와 관련된 단계의 회로도
작은 RNA 추출, 시퀀싱 및 정렬의 전반적인 회로도는 그림2에 설명되어 있습니다.
1마리의 수컷 마우스와 1마리의 암컷 마우스로부터의 간 샘플을 수집하고 액체 질소로 냉동 스냅하였다. 총 RNA를 추출하고 품질 및 농도에 대해 평가하였다.
작은 RNA 시퀀싱은 시퀀싱을 위한 충분한 RNA를 산출합니다.
2개의 독립적인 RNA 추출으로부터 3 μg의 RNA를 작은 RNA 염기서열 분석의 시작 물질로서 사용하였습니다. 샘플을 아크릴아미드 겔상에서 실행하고 RNA의 17-28 nt에 해당하는 크기 마커사이를 잘라냈다(도 1A). 샘플을 RNA 단리.......
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토론
20 년 전13년 전 microRNAs의 확인에도 불구하고, microRNA 시퀀싱의 과정은 힘든 남아 있고 전문 장비를 필요로, 일상적으로 사내 프로토콜을 채택에서 실험실을 방해14. 그밖 기술은 microRNA 마이크로어레이 및 다중화한 표현 패널 같이 microRNA를 동시에 평가할 수 있습니다; 그러나, 이러한 접근법은 그들의 프로브 세트에 존재하는 microRNAs만 정량화한다는 점에서 제한된다. 이 때문에, 그들은 새로운 microRNA의 식별과 같은 작은 RNA 시퀀싱의 중요한 특징을 놓치고, 마이크로 RNA 이소폼 -중요한 생물학적 기능을 가질 수있는 뉴클레오시드 변화 6,7,15 .
새 실험을 시작할 때 상용 공급.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
우리는 앤드류 화재와 마크 케이의 실험실의 구성원에게 지침과 제안에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 100 bp DNA ladder | NEB | N3231 | |
| 19:1 비스-아크릴아미드 | Millipore Sigma | A9926 | |
| 25 bp DNA 스텝 래더 | Promega | G4511 | |
| 산성 페놀/클로로포름 | ThermoFisher | AM9720 | |
| 아크릴아미드 RNA 로딩 염료 | ThermoFisher | R0641 | |
| 과황산암모늄(APS) | Biorad | 161-0700 | |
| Bioanalyzer 기기 | Agilent | G2991AA | RNA 품질 및 농도 평가용 |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
| 에탄올(100%) | Sigma | E7023 | |
| 겔 로딩 버퍼 II | ThermoFisher | AM8547 | |
| GlycoBlue | ThermoFisher | AM9516 | 파란색은 펠릿 HCl 시각화에 도움이 됨 |
| 시 | 그마 | 320331 | |
| KOH | 시그마 | P5958 | |
| 맥시 수직 젤 상자 20 x 20cm | Genesee | 45-109 | |
| miRVana microRNA 분리 키트 | ThermoFisher | AM1560 | |
| miSeq 시스템 | Illumina | SY-410-1003 | 작은 RNA 염기서열 분석 데이터 |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Nusieve 저융점 아가로스 | Lonza | 50081 | |
| 파라필름(실험실 밀봉 필름) | Millipore Sigma | P7793 | |
| 폴리-에틸렌 글리콜 8000 | NEB M0204 | ||
| ProtoScript II에 포함됨 첫 번째 가닥 cDNA 합성 키트 | NEB | E6560S | |
| QIAquick 젤 추출 키트 | Qiagen | 28704 | |
| 큐비트 형광측정기 | ThermoFisher | Q33226 | DNA 농도 정량화용 |
| 큐비트 RNA HS 어세이 키트 | ThermoFisher | Q32855 | |
| 면도날 | Fisher Scientific | 12640 | |
| 실리콘화 저잔량 1.5ml 튜브 | Fisher Scientific | 02-681-331 | |
| T4 RNA 리가제 1 | NEB | M0204 | |
| T4 RNA 리가제 2, 절단된 K227Q | NEB | M0351S | |
| TapeStation | Agilent | G2939BA | RNA 품질 및 농도 평가용 |
| Taq DNA 중합효소 | NEB M0273X | ||
| TEMED | Biorad | 161-0800 | |
| Tris 염기 pH 7.5 | 시그마 | 10708976001 | |
| Tris-buffered EDTA | Sigma | T9285 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | |
| UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Universal miRNA cloning linker | NEB | S1315S | |
| Urea | Sigma | U5378 |
참고문헌
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
- Bartel, D. P. Metazoan MicroRNAs. Cell. 173 (1), 20-51 (2018).
- Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., B....
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재인쇄 및 허가
