수생 생태계에서 유기 탄소 흐름의 새로운 경로를 밝히기 위해 추적자로 형광으로 분류 된 박테리아

요약

여기에 제시된 것은 높은 정밀도와 분류학적 분해능으로 수생 약탈 진핵생물의 방목 속도를 정량화하는 단일 세포, epifluorescence 현미경 기반 기술에 대한 프로토콜입니다.

초록

포식과 그 효과와 같은 영양 상호 작용을 해명하는 것은 생태학에 있는 많은 연구원을 위한 빈번한 작업입니다. 미생물 공동체의 연구는 많은 한계를 가지고 있으며, 육식 동물, 먹이 및 약탈 비율을 결정하는 것은 종종 어렵습니다. 여기에 제시된 것은 형광으로 표지된 먹이를 트레이서로 추가하여 수생 육식 진핵생물의 방목 속도의 안정적인 정량화와 더 높은 영양 수준으로의 영양 전달 추정을 가능하게 하는 최적화된 방법입니다.

서론

이종 영양 성 원생 체는 수생 시스템의 주요 생물학적 구성 요소이며 플랑크톤 바이오 매스^1,2,3의상당한 부분을 차지합니다. 그들의 풍부, 다양성 및 활동을 통제하는 요인은 생물 지구 화학 사이클링에 있는 그들의 역할을 이해하는 위해 중요합니다 (즉, 유기 탄소 및 그밖 양분의 운명 및 원핵생물에서 더 높은 영양 수준에 에너지의 교류). 원생 동물 방목은 이러한 중요한 요소 중 하나입니다. 이종 영양 나노 깃 형성 및 섬모의 박취는 원핵 생물 풍부, 지역 사회 기능, 구조, 다양성, 심지어 세포 형태와 특정 세균 그룹의 성장 속도에 대한 강력한 하향식 제어를 부과^{4, 5,6}. 일부 시스템에서는, protists세균 사망의 주요 원인으로 봉사^6,7.

지금 얼마 동안 이용된 원생 동물 세균을 평가하기 위하여 이....

프로토콜

1. 샘플 수집

1. 저수지 물 샘플 의 수집: 첫 번째 사례 연구 (Exp I; 체질 육식 동물과 먹이 풍부 시스템에서 낮은 자연)
   1. 적절한 깊이에서 원하는 위치에서 물 샘플을 수집합니다. 실험실로 운반하는 동안 시료를 온도 조절 식 쿨러에 체재하여 (온도 충격을 피하며, 프로티스트의 섭취 율은 온도에 따라 달라지도록 주의해야 합니다).
      참고 : 우리의 샘플링은 메소 - 영양 성 협곡 모양의 르지 모프 저수지 (사우스 보헤미아, 볼륨 34.5 x 10^{6m 3,}최대 깊이 43 m, 평균 체류 시간 100 일, dimictic)에서 수행되었습니다. 샘플링 사이트는 댐에 가까운 30m 깊이에 위치했다. 0.5 m 깊이에서 혼합 된 샘플을 2 l 프리딩거 샘플러에 의해 수집하였다.
   2. 가능한 한 빨리 섹션 1.2를 계속합니다.
2. 육식 성 Utricularia 반사 요법 식물의 함정에서 유체의 컬렉션 : 두 번째 사례 연구 (Exp II; 높은 육식 동물과 먹이 풍부 시스템, 매우 작은 샘플 볼륨)
   1. 식물을 수중으로 부드럽게 흔들어 재배 용기에서 제거하고 흡수성 물질에 배치하여 여분의 물을 흡수하십시....

결과

실시예 실험은 지모프 저수지(South Bohemia, CZ)에서 실행되었는데, 이는 현장 포식자와 먹이 풍부도에서 자연이 낮은 자연지대이다. 대표적인 데이터는 피코플랑크톤(&2 μm) 입자^10,16,17,18의 풍부하고 효율적인 방목인 잡식성 섬모 종 할테리아 그란디넬라에대해 보고되고 있다. ^,22. 그림 3은 호르히모프 저수지에서 할테리아 sp. 세포당 FLB 수의 상자 및 수염 플롯을 나타내며(그림3A)시간당 세균 섭취율로 재계산.......

토론

수생 시스템에서 영양 상호 작용을 해독하는 것은 항상 도전^28,특히 protists와 그들의 먹이, 박테리아를 포함하는 나노 플랑크톤 규모에서. 영양 섭취 경로 및 정량화에 관해서, 성공적으로 높은 영양 수준에서 사용 하는 방법의 응용 프로그램은 덜 가능, 생물 학적 상호 작용의 높은 복잡성으로 인해. 여기에는 예를 들어 안정적인 동위원소 라벨링 접근법이 포함됩니다. 이 프로토콜은 epifluoresccs 현미경 검사법과 형광표지 된 박테리아를 추적하여 탄소 흐름을 추적하고 반정화 / 추정하는 장점을 보여줍니다 (박테리아 먹이 : mixotrophic grazers^29를포함한 다양한 프로티스탄 방목제) 미생물 식품 웹의 기초를 통해 경로. 이러한 장점 중 하나는 단일 셀 접근법의 높은 정확도이며, 다른 하나는 방목장 커뮤니티 구조와 다른 기능 적 길드, 종 (Exp I) 및 동일한 하위 집단을 구별하는 전례없는 해상도입니다. 종 (Exp II).......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.2-&마이크로; M 모공 크기 필터	SPI 용품, https://www.2spi.com/	B0225-MB	검정색, 폴리카보네이트 트랙 에칭 멤브레인 필터, 직경 approprite 필터링 장치에 사용
-(4,6-dichlorotriazin-2-yl) aminofluorescein (DTAF)	Any brand
자동 피펫은 볼륨을 조절할 수 있습니다	모든 브랜드, 다양한 크기의
원심분리기	22 000 x g
Cryovials	모든 브랜드, 2 mL 크기
DAPI (4´,6-Diamidino-2´-phenylindole dihydrochloride)	모든 브랜드		1 mg ml-1
Epiflorescence 현미경	확대 크기는 400 x에서 최대 1000 x
	DAPI 및 DTAF 범위에서
			하나에서 그리드를 세는
	보통 지름이 25 mm입니다.
포름알데히드	A 현미경 검사
글루타르알데히드	A 현미경 검사
용 브랜드: 현미경 검사용 침지 오일			낮은 특정 오일
: Lugol´ s 솔루션	어떤 브랜드 또는 댓글		다음과 같이 알칼리성 Lugol' 용액을 만드십시오: 솔루션 1 - 요오드화 칼륨 10g을 MQ 물 20ml에 녹인 다음 요오드 5g을 추가합니다. 해결책 2 - 아세트산 나트륨 5g 추가  MQ 물 50ml에. 용액 2를 용액 1에 추가하고 철저히 혼합하십시오.
메탄올 안정화 포르말린을	검사
현미경 슬라이드와 커버 슬립	현미경 검사용으로 제작된 모든 브랜드
샘플 희석을 위한 MQ 물	모든 브랜드
인산염 완충 식염수(PBS; pH = 9)	모든 브랜드		0.05 M Na2HPO4-NaCl 용액, pH 9로 조정
PPi-Saline 완충액	모든 브랜드		0.02 M Na4P2O7-NaCl 용액. 0.53 g Na4P2O7를 MQ 물 100 ml에 추가하고 0.85 g NaCl
샘플링 장치	대표적인 샘플을 얻는 데 적합		예: 호수 플랑크톤용 Friedinger 샘플러
티오황산나트륨 용액	프로토콜에는 모든 브랜드		3% 용액이 사용됩니다.
Sonicator	모든 브랜드		30 W
Vortex	용질과 샘플
수조 온도를	60°C로 유지할 수 있는 모든 브랜드; 씨

5까지입니다. 보기 적합한 필터 안구 필터링 장치 중 것은 용 브랜드, 형광이 참조 현미경 용으로 사용 가능한 모든 브랜드의 철저한 혼합을 허용하는 모든 브랜드