본 문서는 대식세포를 유치하기 위해 종양 세포로부터 조절된 배지의 능력을 평가하는 유용한 시험관내 분석방법을 나타낸다.
이 논문에서
요약
초록
종양 관련 대식세포 (TAM)는 암의 다른 모형을 위한 종양 질량에 있는 세포의 큰 비율을 차지합니다. 아교 모세포종 (GBM), 치료법이없는 악성 뇌종양은 종양 질량 의 절반까지 있습니다. TAM은 세포에서 특정 유전자의 활성화에 따라 종양 또는 항종양일 수 있다. 종양에 있는 유전 돌연변이는, 핑거레이토카인 발현을 통제해서, 종양 미세 환경에 TAM의 모집에 영향을 미칠 수 있습니다. 여기서, 우리는 종양 세포로부터의 조절된 배지에 의한 대식세포 모집을 평가하기 위한 정량적 세포 기반 분석방법을 기술한다. 이 분석은 인간 대식세포주 MV-4-11을 사용하여 교모세포종으로부터 조절된 배지에 의한 대식세포 인매력을 연구하여 높은 재현성과 낮은 가변성을 허용합니다. 이 분석으로 생성된 데이터는 종양과 종양 미세 환경 사이의 상호 작용에 대한 더 나은 이해에 기여할 수 있다. 유사한 분석은 종양 세포와 T 세포 및 자연 살인자 (NK) 세포를 포함하여 그밖 면역 세포 사이 상호 작용을 평가하기 위하여 이용될 수 있습니다.
서론
대식세포는 높은 자형질 및 기능적 이질성을가진 면역 세포1. 그들은 숙주 방어 시스템, 조직 수리, 발달및 종양 진행에 중요한 역할을 한다 1. TAM은 고형 종양의 미세 환경의 대식세포입니다. 특정 T는 T 세포 매개 세포 독성 활성을 억제하고, 종양 미세 환경(TME)을 조절하고, 혈관신생, 침입 및 전이 를 촉진하여 종양 성장을 촉진할 수있습니다2,3,4, 5.TAM은 TME에서 가장 풍부한 세포 유형 중 하나이며 더 많은 수의 TAM은 일반적으로 많은유형의 고형 종양에서 환자 생존과 상관 관계가 6. 종양 세포의 명백한 유전 서명은 대식세포를 모집하는 그들의 기능에 영향을 미칩니다. GBM에서, 아무 치료도 없는 공격적인 뇌종양, 대식세포는 종양질량 7의 반까지 나타낼 수 있습니다. 표피 성장 인자 수용체(EGFR)와그의 절단 돌연변이체 EGFRvIII의 공....
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프로토콜
1. 중간 준비
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무혈청 줄기세포 배지의 제조
- 50x B27 보충제, 표피 성장 인자(EGF, 20 μg/mL에서 0.1% BSA) 및 섬유아세포 성장 인자(FGF, 20 μg/mL 를 0.1% BSA로 10 mM 아세트산)를 해동하였다.
- EGF 500 μL(최종 농도 20 ng/mL), FGF 500 μL(최종 농도 20 ng/mL), 덜베코의 수정된 이글 미디엄/영양소 혼합물 F-12(DMEM/F12) 및 5 mL의 FGF(최종 농도 20 ng/mL), 50mL의 FGF(최종 농도 20 ng/mL), 10 mL을 추가합니다. 병을 4-6회 반납하고, 500 mL 0.1 μm 여과 컵을 통해 걸러내다. 병에 표시하고 4 °C에서 저장합니다.
참고: 배지는 4°C에서 최대 한 달 동안 사용하는 것이 좋다.
- MV-4-11 배양 배지 준비: 이스코브의 변형된 덜베코 배지(IMDM)의 500 mL에 태아 소 혈청(FBS) 50mL를 추가합니다. 병을 4-6회 반납하고, 500 mL 0.1 μm 여과 컵을 통해 걸러내다. 병에 표시하고 4 °C에서 저장합니다.
참고: 배지는 4°C에서 최대 한 달 동안 ....
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결과
결과는 일반적으로 막대 그래프를 통해 표시됩니다(그림 1에도시된 예). 값이 480/520이 높은 샘플은 컨디셔닝된 미디어가 대식세포를 모집할 수 있는 능력이 높다는 것을 나타냅니다. 실험적 필요에 따라 추가 컨트롤을 포함할 수 있습니다. 예를 들어, 중화 항체를 사용하여 대식세포 화학요법을 폐지하고, 동일한 분석법을 수행하기 위해 조절된 매체를 치료할 수 있다. 하나는 또한 추가 케모카인 (즉, CCL2)을 컨디셔닝 된 미디어에 추가 할 수 있으며, 이는 긍정적 인 대조군역할을합니다.
도 1: EGFR 및 EGFRvIII를 공동 발현하는 U87 세.......
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토론
이 프로토콜에는 1) Transwell 삽입물의 선택이라는 몇 가지 주요 단계가 있습니다. MV-4-11 세포주, 5 μm 트랜스웰 인서트가 잘 작동합니다. 그러나, 일반적으로 사용되는 단핵구 세포주 THP-1과 같은 다른 세포주, 다른 기공 크기는 더 잘 작동 할 수 있습니다. 2) 다른 세포주가 다른 속도로 증가함에 따라, 세포 수에 따라 조절 된 매체의 부피를 조정하는 것이 중요합니다. 이를 위해, 동일한 실험 조건 하에서 배양된 무세포 방진 매체는 컨디셔닝된 매체를 희석하는데 사용될 수 있다. 3) FBS는 사이토 카인을 포함합니다. 상부 챔버에서 MV-4-11 세포를 시드하기 위해 무혈청 배지를 사용하는 것이 중요합니다. 여기서 FBS를 사용하는 경우 셀 마이그레이션을 관찰할 수 없는 경우도 있습니다.
연구원은 다른 응용 프로그램에 대 한이 분석 이 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 다른 종양 세포는, 일차적인 환자 유래 이종이식 배양, 또는 마우스 세포가 전술한 예에서.......
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공개 사항
윌리엄 A. 와이즈는 StemSynergy 치료제의 공동 설립자입니다. 제니 안은 공개할 것이 없다.
감사의 글
교부금 지원: Z. An은 알렉스의 레모네이드 스탠드 재단, 미국 뇌종양 협회, NIH T32CA108462 및 획기적인 생물 의학 연구 프로그램으로부터 지원을 받았으며, 이는 부분적으로 샌드러 재단에 의해 지원됩니다. W. 와이즈는 NIH 보조금 R01CA221969, R01NS091620, P50CA097257, U01CA217864, P30CA82103에 의해 지원되었다; 새뮤얼 G. 왁스만 암 연구 재단; 그리고 에블린과 매티 앤더슨 의자.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.1 &뮤; m 여과 컵 | 써모 피셔 | 566-0010 | |
| 0.45 μ m 필터 장치 | Millipore | SLHA033SS | |
| 10mL 혈청학 피펫, | Olympus 플라스틱 | 12-104 | |
| 15mL 멸균 원심분리기 튜브 | , Olympus 플라스틱 | , 28-103 | |
| 1mL 피펫 팁 | , ART molecular bioproducts | 2779-RI | |
| 2mL 흡인 피펫 | Falcon | 357558 | |
| 24웰 플레이트 | Millipore | ECM507 | ECM507의 일부, 또는 별도로 구매할 수 있습니다 |
| 4x 용해 버퍼 | Millipore | ECM507 | ECM507의 일부, 또는 별도로 구매할 수 있습니다 |
| . 5 μ m Transwell insert | Millipore | ECM507 ECM507 | 의 일부, 또는 별도로 구매 가능 |
| 75 cm2 플라스크 | Corning | 430641U | |
| Accutase | Innovative cell technologies | AT-104 | |
| B27 | Gibco | 12587-010 | |
| CyQuant Dye | Millipore | ECM507 | ECM507의 일부 또는 별도로 구매 가능 |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| DMEM:F12 | Gibco | 10565-018 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| FGF | Peprotech | 100-18B | |
| IMDM | Gibco | 12440-053 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| 펜 스트렙 | Gibco | 15140-122 | |
| 트리판 블루 | Biorad | 1450021 |
참고문헌
- Liu, Y., Cao, X. The origin and function of tumor-associated macrophages. Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 1-4 (2015).
- Riabov, V., et al. Role of tumor associated macrophages in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis. Front....
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