만성 CDK9 억제의 뮤린 세포주 기반 모델은 암에서 광범위한 비 유전 적 전사 신장 결점 (TE확실히)을연구합니다.

Summary

프로토콜은 비 유전적 결함 전사 신장의 시험관 내 뮤린 암종 모델을 자세히 설명합니다. 여기서, CDK9의 만성 억제는 모든 암 유형의 약 20%에서 존재하는 임상적으로 과용된^TE 를 모방하고 연구하기 위해 프로-염증 반응 유전자를 따라 RNA Pol II의 생산적인 신장을 억압하는 데 사용된다.

Abstract

우리는 이전에 암의 부분 집합이 mRNA 전사 신장 (TE)에 있는 광범위한 결핍을 가진 글로벌 전사 deregulations에 의해 정의된다는 것을 보고했습니다- 우리는 TE와 같은 암을^확실히칭합니다. 특히, TE^확실히 암은 그들의 억압으로 이끌어 내는 인터페론/JAK/STAT 및 TNF/NF-θB 통로와 같은 유전자의 큰 세트에서 가짜 전사 및 결함이 있는 mRNA 처리를 특징으로 합니다. TE는 신장 세포 암및 전이성 흑색종 환자에 있는 종양의^확실히 특수형은 면역 요법에 있는 나쁜 반응 및 결과와 유의하게_{상관합니다.} ^면역 요법에 대한 중요한 장애물을 포팅으로 -이 프로토콜의 목표는 이러한 광범위하고 비 유전적 연구를 위해 체외 TE^확실히 마우스 모델을 확립하는 것입니다. 암에 있는 전사 이상 및 새로운 통찰력, 기존 약에 대한 새로운 용도를 얻거나, 그 같은 암에 대하여 새로운 전략을 찾아내십시오. 우리는 RNA 폴리머라제 II(RNA Pol II)의 C 말단 반복 도메인(CTD)에 세린 2 잔기의 인산화를 폐지하기 위해 만성 플라보피리돌 중재 CDK9 억제를 상세히 설명하며, RNA Pol II의 방출을 생산적인 전사체로 억제합니다. 신장. TE가^확실히 어떤 특정 체세포 돌연변이의 밑에 분류되지 않다는 것을 감안할 때, 약리학 모형은 유리하고, 그(것)들에서 관찰된 광범위한 전사 및 후생유전학 결함을 가장 잘 모방합니다. 플라보피리돌의 최적화된 치사용량의 사용은 전사 신장 및 mRNA 처리 결함에서 비유전적 광범위한 중단의 일반화 가능한 모델을 만드는 유일한 효과적인 전략이며, 임상적으로 관찰된 TE를 밀접하게 모방합니다. ^확실히 특성. 따라서, TE의 이 모형은^확실히 면역성이 있는 중재한 세포 공격에 저항하는 에서 그(것)들을 가능하게 하는 세포 자율적인 요인을 해부하기 위하여 이용될 수 있습니다.

Introduction

거의 모든 활성 유전자의 발현에서 중요한 속도 제한 단계는 프로모터 근위식 일시에서 생산적인 신장^1,2로의RNA 폴리머라제 II(RNA Pol II)의 전이이다. 전사 신장의 후생 유전학 적 dysregulationTE^확실히로 정의 된 여러 인간의 악성 종양의 진행에 도움이 주어진, 가난한 응답에 달하는 프로 염증 반응 경로에서 최적이 아닌 신호로 이어지는 면역 요법^3에대한 결과, 이 프로토콜의 가장 중요한 목표는 암에서 이러한 광범위한 비 유전 적 전사 이상을 연구하는 유용한 시험관 내 모델을 확립하는 것입니다. 이러한 관점에서, CDK9의 만성 약리학적 억제의 사용은 전사 신장 및 mRNA 처리 결함에 있는 비 유전적 광범위한 중단의 일반화 가능한 모형을 만들기위한 효과적인 전략이다. 만성 CDK9 억제를 사용하는 근거는 RNA Pol II의 C 말단 반복 도메인(CTD)에 세린 2 잔기의 인산화를 제거하여 RNA Pol II의 방출을 생산적인 전사 신장으로 억제한다는 것입니다. 또한,^TE확실히 암, 우리의 그룹^3에의해 이전에 설명한, 어떤 특정 체세포 돌연변이....

Protocol

신시내티 아동 연구 재단의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 및 기관 생물 안전위원회는 모든 동물 실험 절차 (IACUC 프로토콜 #2017-0061 및 IBC 프로토콜 #IBC2016-0016)를 승인했으며, 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드에 설명된 표준에 따라 수행되었다.

1. 플라보피리돌 치료에 의한 RNA Pol II의 만성 억제-기본 전략

1. 종자 B16/F10 마우스 흑색종 세포는 저밀도 (0.2 x 10⁶⁾그들의 해당 배지에서 10cm 배양 판 (덜베코의 변형 된 독수리 배지 [DMEM], 10 % 태아 소 혈청 [FBS], 1 % 페니실린 및 연쇄상 구균 [펜 / 스트렙]) 및 밤새 인큐라토리 37°C, 5%_CO2 가습 인큐베이터에.
2. 다음 날, 1x 인산완충식염수(PBS)로 세포를 세척하고, RNA Pol II 연신계 p-TEFb(사이클린 T/CDK9)의 억제제인 플라보피리돌의 서브치명적인 용량(25nM으로 추정)을 가진 배양 배지의 새로운 배치를 추가합니다-1주일 동안 추가 없이 하위 배양.
3. flavopiridol 처리의 주 에 따라,^{TE에서 본} 전사 신장 결점의 각종 속성을 재량화하는 모형의 능....

Results

여기서, 우리는 25 nM에서 플라보피리돌로 치료한 만성 서브치사(도2)에의해 얻어진^TE확실히 세포 모델을 확립하기 위한 상세한 계획(도1)을제공한다. 도 3에서,플라보피리돌로 치료한 3일 동안, B16 OVA 세포는 TE의 부분적인 특성을^확실히 나타내지만, 1주일의 치료 후, B16/F10 OVA 세포는 RNA Pol II의 CTD에 대한 세린 2 위치에서 의인산화의 심오한 손실을 나타낸다. H3K36me3의 현저한 감소와 함께, 엑슨 경계를 정의하는 데 연루된 히스톤 수정과 도망가는 비밀 전사의 억제제. 결과적으로, TE^확실히 세포 모델은 부적절하게 캡및 비-폴리-아데닐화 mRNA의 명백하게 증가된 비율로 중요한 mRNA 처리 결함을

Discussion

RNA Pol II 신장 조절은 악성 세포의 이점에 대한 자극 반응유전자 발현을 조절하기 위한 결정적인 지렛대로 대두되고^{있다 5,7,8.} 발기인-근위성 일시 중단을 극복하여 연신장 및 후속 mRNA 생산을 위해서는 P-TEFb^9,10,11의키나아제 활성이 요구됩니다. 우리의 모델은 필수 사이클린 의존키나제 CDK9의 억제제인 플라보피리돌(25 nM)을 사용하여^TE에서 Pol II 신장 기간 동안 관찰된 결함을 모방합니다. 이전³.

CDK9 키나아제 활성은 오랫동안 Pol II의 대형 소단.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
hhis6FasL	세포 신호	5452
10X TBS	Bio-Rad	170-6435
12 웰 플레이트	Falcon	353043
20% 메탄올	Fisher Chemical	A412-4
24웰 플레이트	Falcon	351147
4– 18% SDS 폴리아크릴아미드 겔	Bio-Rad	4561086
4% 파라포름알데히드	Thermo Fisher Scientific	AAJ19943K2
5% 분유	Bio-Rad	170-6404
7-메틸구아노신 항체	BioVision	6655-30T
96-well plates	Cellstar	655180
AF647-conjugated mouse CD8	Biolegend
항생제 및 항진균제	Gibco	15240-062
항-His 항체	세포 신호	2366  P
Anti-Rabit	Cell Signaling	7074	Dilution 1:5000
Anti-Rat	Cell Signaling	7077S	Dilution 1:5000
Bradford assay Kit	Bio-Rad	5000121
BSA	ACROS Organics	24040-0100
BV421-conjugated mouse CD45	Biolegend	109831
crystal violet	Sigma	C3886-100G
DMEM	Gibco	11965-092
Dynabeads Oligo (dT)25	Ambion	61002
FBS	Gibco	45015
고정성 생염색제/사염색염료 e780	eBioscience	65-0865-14
Flavopiridol	Selleckchem	S1230
H3k36me3	Abcam	ab9050	희석 1:2000
IFN-&알파;	R& D 시스템	12100-1
IFN-&감마;	R& D 시스템	485-MI-100
IMDM	Gibco	12440053
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate	Millipore	WBKLS0500
MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit	Biolegend	480007
NF-κ B	세포 신호	8242s	희석 1:1000
PBS	Gibco	14190-144
p-NF-κ B	세포 신호	3033s	희석 1:1000
p-Ser2-RNAPII	활성 모티프	61083	희석 1:500
p-Ser5-RNAPII	활성 모티프	61085	희석 1:1000
p-STAT1	세포 신호	7649s	희석 1:1000
RiboMinu 진핵생물 키트	Ambion	A10837-08
RIPA 버퍼	산타 크루즈 생명공학	sc-24948
RNAPII	Active Motif	61667	희석 1:1000
STAT1	세포 신호	9175s	희석 1:1000
TNF-&알파;	R& D 시스템	410-MT-010
총 H3	세포 신호	4499	희석 1:2000
트라이 시약	시그마	T9424
트리톤	시그마	T8787-50ML
트윈 20	AA Hoefer	9005-64-5
β-Actin	세포 신호	12620S	희석 1:5000
&베타;-ME	G 바이오사이언스	BC98