Method Article

격자 광 시트 현미경을 사용하여 표면 T 세포 수용체 역학 4 차원 시각화

DOI:

10.3791/59914

⸱

January 30th, 2020

 , 
1Committee on Cancer Biology, The University of Chicago, 2Pritzker School of Molecular Engineering, The University of Chicago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜의 목표는 살아있는 세포에 있는 표면 수용체 역학을 4 차원으로 가시화하기 위하여 격자 빛 시트 현미경 검사를 사용하는 방법을 보여주기 위한 것입니다. 여기서CD4+ 원발성 T 세포상에 T 세포 수용체가 도시된다.

Abstract

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세포의 신호 및 기능은 표면 수용체의 동적 구조와 상호 작용에 의해 결정됩니다. 진정으로 이 수용체의 구조 기능 관계를 이해하기 위하여는, 우리는 충분한 주분체 해결책을 가진 살아있는 세포 표면에 그(것)들을 구상하고 추적할 필요가 있습니다. 여기에서 우리는 살아있는 세포막에 있는 T 세포 수용체 (TCRs) 4 차원 (4D, 공간 및 시간)를 심상하기 위하여 최근에 개발한 격자 빛 시트 현미경 검사법 (LLSM)를 사용하는 방법을 보여줍니다. T 세포는 적응형 면역 계통의 주요 이펙터 세포 중 하나이며, 여기서 우리는 이러한 세포의 신호및 기능이 TCRs의 역학 및 상호작용에 의해 구동된다는 것을 보여주기 위해 T 세포를 예로사용하였다. LLSM은 전례 없는 시공간 해상도로 4D 이미징을 가능하게 합니다. 이 현미경 기술은 그러므로 생물학에 있는 다른 세포의 표면 또는 세포내 분자의 넓은 배열에 일반적으로 적용될 수 있습니다.

Introduction

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3차원 세포 표면에서 실시간으로 트래피킹하고 확산되는 분자의 정확한 역학은 해결해야 할 수수께끼였습니다. 현미경 검사법은 항상 속도, 감도 및 해상도의 균형이었습니다. 하나 또는 두 개가 최대화되면 세 번째가 최소화됩니다. 따라서 표면 수용체가 이동하는 작은 크기와 엄청난 속도로 인해 역학을 추적하는 것은 세포 생물학 분야의 주요 기술적 과제로 남아 있습니다. 예를 들어, 많은 연구는 전체 내부 반사 형광을 사용하여 실시되었습니다 (TIRF) 현미경 검사법1,2,3,이는 높은 측두력을 가지고 있지만, T 세포 막의 매우 얇은 조각을 이미지 할 수 있습니다 (~ 100 nm), 따라서 세포에서 멀리 일어나는 이벤트를 놓친다. 이러한 TIRF 이미지는 또한 세포의 2차원 섹션만을 보여준다. 이와 대조적으로, 경질 광학 재건 현미경 검사법(STORM)4,광활성화 국소화 현미경(PALM)5및 자극방출 고갈 현미경(STED)6,빛의 절제 한계를 극복할 수 있는 초고해상도 기술. 이러한 기술은 높은 공간 해상도....

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Protocol

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5C. B10에서 C7 TCR 형질전환 RAG2 녹아웃 마우스. 배경은 시카고 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라이 연구에서 사용되었다.

1. 수확 및 T 세포 활성화

참고: 프로토콜의 이 부분은 이전 프로토콜을 기반으로 합니다. 자세한 내용은 인용을 참조하십시오20,21.

  1. 10-12 주 된 5C를 안락사. 승인된 IACUC 프로토콜에 따라 어느 성별(~20-25 g)의 C7 형질전환 마우스(즉,CO2 챔버 뒤에 자궁 경부 탈구).
  2. 70% 에탄올로 마우스 시체를 철저히 스프레이하여 모피를 흡수하고 BSL-2 안전 캐비닛에 넣습니다.
  3. 마우스를 오른쪽으로 돌리고 수술용 가위로 신체 구멍에 작은 절개를 합니다. 수술 집게를 사용하여 비장을 제거합니다. 수술 가위로 필요에 따라 결합 조직을 잘라냅니다.
  4. 비장을 70 μm-모공 메쉬 셀 스트레이너에 넣고 1 mL 주사기 플런저 뒷면으로 으깬다. 완전한 RPMI (RPMI와 10 % 태아 소 혈청 [FBS], 2 mM L-글루타....

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Results

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여기서, 우리는 1차 마우스 5C의 분리, 준비 및 이미징에 대해 설명한다. 격자 광 시트 현미경을 사용하여 C7 T 세포. 섹션 3 동안, 현미경을 올바르게 정렬하고 수집 후 데이터를 디선볼로 하는 매일 PSF를 수집하는 것이 필수적입니다. 그림 2에서는현미경을 정렬할 때 볼 수 있는 올바른 정렬 이미지를 보여 준다. 그림 2A 및 도 2B는 플루오레세인으로 이미지화될 때 각각 올바른 빔 경로와 빔 정렬을 보여줍니다. 대물 스캔은 XZ 및 YZ 투영에 가능한 한 대칭으로 큰 X 모양을 표시해야 합니다. 또한 가능한 한 X의 작은 크기로 조정해야합니다(그림 2C). 이것은 주로 방출 목표 칼라를 조정하여 달성된다. z galvo.......

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Discussion

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제시된 프로토콜은 5C로부터 단리된CD4+ T 세포의 사용을 위해 최적화되었다. LLSM 계측기상 C7 형질전환 마우스가 사용되고, 따라서 다른 세포 시스템 및 LLSM은 다르게 최적화되어야 할 수도 있다. 그러나, 이 프로토콜은 생리적 조건에서 최소한의 왜곡으로 전체 세포에 표면 수용체의 역학을 정량화하는 데 사용될 수 있기 때문에 4D 이미징의 힘을 보여줍니다. 따라서 이 기술의 향후 응용 프로그램에는 여러 가지가 있을 수 있습니다.

중요한 단계는 세포가 적당한 사격량에 정착하는 것을 허용합니다. 너무 많은 APC가 커버슬립에 정착하여 너무 조밀해지면 단일 APC와만 상호 작용하는 T 셀을 찾기가 어렵습니다. T 세포에 여러 시냅스가 있는 경우 데이터의 추적 및 해석이 매우 복잡해질 수 있습니다. 유사하게, 너무 적은 APC가 존재하는 경우에, 시냅스를 형성하는 T 세포를 찾는 것은 또한 어렵습니다. 50,000개의 세포가 10분 동안 정착할 수 있도록 하.......

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Disclosures

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저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgements

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우리는 시카고 대학의 비타스 빈도카 박사의 조언과 지도를 인정하고 싶습니다. 우리는 격자 광 시트 현미경을 지원하고 유지에 대한 시카고 대학의 통합 빛 현미경 코어 시설에 감사드립니다. 이 작품은 NIH 뉴 이노베이터 어워드 1DP2AI14245 및 NSF 커리어 어워드 1653782(J.H.)에 의해 지원되었습니다. J.R.은 NSF 대학원 연구 펠로우십 프로그램에 의해 지원됩니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL 주사기BD309659T 세포 수확
2-메르캅토에탄올Sigma-AldrichM3148-25MLT 세포 배양용
5 mm 라운드 커버 슬립World Precision Instruments502040이미징
용 70um 멸균 세포 스트레이너Corning7201431T 세포 수확
Alexa Fluor 488 안티 마우스 TCR β 체인 항체소
태아 혈청(FBS)X& 이미징을 위한 BioLegend 109215 Y 세포 배양FBS-500T 세포 배양을 위한
FicollGE Healthcare17-1440-02T 세포 수확을 위한 Denisty gradient 시약
플루오레세인 나트륨 염Sigma-AldrichF6377현미경 정렬용
FluoSpheres Carboxylate-Modified MicrospheresThermo Fisher ScientificF8810현미경 정렬용
ImarisBitplaneN/A추적 소프트웨어; 추적 소프트웨어를 위한 다른 옵션으로는 Amira 또는 Trackmate(피지)가 있습니다.
격자 광시트 현미경3iN/A현미경 사용
Leibovitz의 L-15 매체, 페놀 레드없음 Thermo Fisher Scientific21083027이미징용
L-글루타민Thermo Fisher Scientific25030-081T 세포 배양용
LLSpyJanelia Research CampusN/ALLSpy는 Janelia Research Campus의 Howard Hughes Medical Institute의 라이선스 하에 사용되었습니다. 액세스하려면 innovation@janelia.hhmi.org 문의하십시오. 다른 디콘볼루션 및 디크재잉 방법은 Fiji, Slidebook, Amira 등과 같은 이미지 처리 소프트웨어에서 사용할 수 있습니다. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/
나방 사이토크롬 C(MCC), 서열 ANERADLIAYLKQATKElimbio맞춤형 합성T 세포 수확
Penacillin/StreptamycinLife Technologies15140122_3683884612T 세포 배양용
Poly-L-LysinePhoenix 연구 제품P8920-100ML이미징
RBC 용해 버퍼eBioscience00-4300-54T 세포 수확 재
조합 마우스 IL-2Sigma-AldrichI0523T 세포 배양
RPMI 1640 매체코닝MT10040CVT 세포 배양
슬라이드 북3iN/ALLSM 이미징 소프트웨어
외과 해부 도구Nova-Tech InternationalDSET10T 세포 수확용
T-25 플라스크Eppendorf2231710126T 세포 배양용
Thermo Scientific Pierce Fab 마이크로 준비 키트Thermo Fisher Scientific44685준비 팹
용

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications. Methods in Molecular Biology. 1251, Clifton, N.J. 1-23 (2015).
  2. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z.

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