자외선-C (UV-C) 손상에 응하여 1 차 마우스 안구 표면 세포/줄기 세포에 있는 산화 손상의 평가

요약

이 프로토콜은 마우스 안구 표면 세포로부터살아있는 1차 배양에서 반응성 산소 종(ROS), 살아있는 세포 및 죽은 세포의 동시 검출을 입증한다. 2',-7'-디클로로플루오레세테이트, 프로피듐 요오드화물 및 Hoechst 염색은 ROS, 죽은 세포 및 살아있는 세포를 각각 평가하기 위해 사용되며, 이미징 및 분석이 뒤따릅니다.

초록

안구 표면은 다양한 환경 적 요인으로 인해 정기적으로 마모됩니다. UV-C 방사선에 노출은 직업 건강 위험을 구성합니다. 여기에서, 우리는 UV-C 방사선에 마우스 안구 표면에서 1 차적인 줄기 세포의 노출을 보여줍니다. 반응성 산소 종 (ROS) 형성은 산화 스트레스 / 손상의 정도의 판독이다. 시험관 내 실험 환경에서는 산화 스트레스로 인해 생성된 죽은 세포의 백분율을 평가하는 것도 필수적입니다. 이 기사에서는 UV-C 노출 된 마우스의 2',7'-Dichlorofluescececetate (DCFDA) 염색을 시연할 것이며 DCFDA 염색의 형광 이미지에 기초한 1 차적인 안구 표면 줄기 세포 및 정량화를 시연할 것입니다. DCFDA 염색은 ROS 생성에 직접적으로 해당합니다. 우리는 또한 각각 프로피듐 요오드화물 (PI) 및 Hoechst 3332와 DCFDA (ROS 양성) 및 PI 양성 세포의 백분율로 동시에 염색함으로써 죽은 세포와 살아있는 세포의 정량화를 입증합니다.

서론

안구 표면(OS)은 주로 각막, 래크리말 선, 마이보미안 선, 결막, 눈뚜껑 의 일부 및 신호를 변환하는 안구 의 일부의 외층 및 선 상피로 구성된 기능적 단위이다^1. 투명 한 돔 모양의 각막 층망막에 빛을 초점을 맞추고 있습니다. 이러한 혈관 조직은 상피 세포, 각질 세포, 내피 세포 및 콜라겐 및 글리코사미노글리칸과 같은 세포 성분으로 구성된다^2. 이 지역은 또한 대부분의 영양소를 공급하는 눈물로 배수됩니다. OS의 해부학 적 위치는 종종 밝은 빛, 미생물, 먼지 입자 및 화학 물질과 같은 다양한 가혹한 구성 요소에 노출, 외부 환경과 직접 접촉하도록 강요한다. 이 요인은 물리적 인 부상에 OS를 걸리기 쉽게하고 다양한 질병에 경향이있습니다.

산화 스트레스는 반응성 산소 종(ROS)의 생산과 내인성 항산화 방어 메커니즘 사이의 불균형으로 인해 발생한다^3. ROS는 반응성 분자 및 자유 라디칼로 분류되며, 둘 다 미토콘드리아 산화 인산화를 통해 분자 산소_(O2)에서유래된다^4. 상기 전군은 과산화수소(H2O2), 일중항^산소(1_O2)와같은 비라디칼 종으로 구성되며, 후자는 수퍼옥사이드 음이온(O2-) 및 하이드록실 라디칼(• OH)과 같은 종을 포함한다. 이들 분자는 정상적인 세포 과정의 부산물이며, 이들의 역할은 신호 전이, 유전자 발현 및 숙주 방어^5와같은 중요한 생리기능에 연루되어 왔다. ROS의 향상된 생산은 병원균 침습, 제노바이오틱스, 및 자외선(UV) 방사선에 의한 노출과 같은 인자에 반응하여 생성되는 것으로 알려져^{있다 4.} ROS의 이 과잉 생산은 핵산, 단백질 및 지질과 같은 분자의 손상으로 이끌어 내는 산화 응력 에서 유래^6.

UV 방사선의 가장 지배적 인 소스 인 자연 태양광은 UV-A (400-320 nm), UV-B (320-290 nm), UV-C (290-200 nm)^7로구성됩니다. 파장과 스펙트럼 에너지 사이의 역 상관 관계가 보고되었습니다. 천연 UV-C 방사선은 대기에 흡수되지만 수은 램프 및 용접 기구와 같은 인공 공급원이 방출되므로 직업적 위험이 있습니다. 눈에 노출의 증상은 광각막염과 광각막결막염 을 포함⁸. ROS의 생산은 UV 유도 된 세포 손상을 유발하는 주요 메커니즘 중 하나입니다^9. 현재 연구에서는 UV-C에 노출된 마우스 1차 안구 표면 세포/줄기 세포에서 2',7'-디클로로디로디하이드로플루오레스세인 디아세이테인 디아세이테(DCFDA) 염색 방법을 사용하여 ROS검출을 입증합니다. 녹색 형광은 형광 현미경 검사법을 사용하여 포착되었습니다. 세포는 2개의 염료, Hoechst 33342 및 적색 프로피듐 요오드화물로 카운터-염색하였고, 살아있는 세포와 죽은 세포를 각각 염색하였다.

프로토콜

실험은 스위스 알비노 마우스 눈에서 유래한 1차 안구 세포/줄기 세포에서 수행되었다. 이 실험을 위해 눈을 채취하기 위한 동물의 사용은 기관 동물 윤리위원회, 예네포야(대학로 간주됨)(IEAC 승인 번호, 6a/19.10.2016)에 의해 승인되었다.

1. 시약의 준비

참고 : 마우스 안구 표면에서 1 차 세포 / 줄기 세포의 유도는이 프로토콜의 범위를 벗어납니다. 그러므로, 우리는 UV-C 노출 복용량, ROS, 살아있는 죽은 세포 및 그들의 정량화를 평가하기 위한 시약 준비를 설명합니다. 시약의 각각부(최종 염색 용액을 얻기 위해 첨가될 10% 태아 소 혈청, DCFDA, Hoechst 및 프로피듐 요오드화 스톡 용액)에 대해서는 표 1을 참조하십시오.

1. DMSO 5.13 mL에 25 mg의 DCFDA 분말을 용해시켜 10 mM DCFDA의 재고 용액을 준비하십시오. Aliquot 250 μL 각각 호박색 1.5 mL 튜브에 -20°C에서 보관한다.
2. 10 mg/mL(16.23 mM 용액)의 스톡 용액을 준비하여 2.5 mL의 탈이온수에서 25 mg 바이알의 전체 내용을 용해시킴으로써 Hoechst 33342를 준비합니다. 호박색 미세원원지 튜브에 100 μL의 알리쿼트를 만들고 최대 6개월 동안 2-6°C에 보관하십시오. 장기간 보관을 위해 -20°C에 보관하십시오.
3. 탈이온수에서 1 mg/mL 프로피듐 요오드화물의 스톡 용액을 준비하고, 호박색 1.5 mL 튜브에 각각 1 mL을 aliquot하고, 4 °C에서 저장합니다.

2. 세포 도금 및 UV-C 방사선 처리

1. 도금 전에, 우리 실험실에서 분리된 마우스 1차 안구 표면 세포를 해리(미공개 결과; 이러한 세포는 각막 상피, 기질 세포 및 각화세포의 혼합물)을 부드러운 세포 해리제를 사용하여해리한다(자료표).
2. 플레이트 0.2 x 10⁶ 마우스 1차 안구 표면 세포를 35 mm 0.2% 지하 막 매트릭스 코팅 세포 배양 접시에 2.5 mL의 완전한 배지. 5%_CO2 및 가습 인큐베이터에서 37°C에서 밤새 배양한다.
   참고: 마우스 안구 표면에서 1차 세포를 배양하기 위한 완전한 매체는 20% FBS, 1% 펜 스트렙, 1% 글루타맥스, 1% 비필수 아미노산(NEAA), 1% 피루브나트륨 및 0.1% β-메르카포에탄올을 함유하는 DMEM 고혈당으로 구성됩니다.
3. UV-C의 각종 복용량에 세포를 드러내기 전에, 매체의 최대 양을 버리고 매체의 얇은 층 (~500 μL)만 세포와 접촉하는 것을 허용합니다, 그(것)들을 커버하기 위하여 충분히.
4. UV-C 소스 / 챔버 (하이브리드 화 오븐 / UV 크로스 링커의 하부 챔버)에 한 번에 하나씩 접시를 가져 가라. 재료 표)를 참조하십시오. 접시를 챔버에 넣고 접시 뚜껑을 제거합니다. 접시의 열린 뚜껑 위치는 세포가 UV-C 노출 동안 최대 UV-C 용량을 수신하도록 보장합니다.
5. UV-C의 다른 등급 / 복용량에 세포를 노출 : 1 J /^m2,100J /^m2,1,000 J /^m2 및 10,000 J /^m2.
6. UV-C 노출 후, 각 접시의 뚜껑을 즉시 교체하고 UV-C 소스 챔버에서 제거하십시오.
7. 각 접시를 층류 공기 흐름 후드에 가져와서 신선한 완전한 매체 2 mL로 각 요리를 마무리하십시오.
8. 37°C_CO2 인큐베이터에서 3시간 동안 세포를 배양한다. 3시간의 배양 후 UV-C 노출은 초기 효과를 시각화하고 정량화하는 데 최적이다.

3. 살아있는 세포 염색 매체의 준비

1. UV-C 노출 후 3시간 동안 의 마지막 15분 동안 염색매체를 신선히 준비한다.
2. 10% FBS-DMEM을 함유하는 염색매체의 10 mL를 37°C로 1% 펜-스트렙으로 보충하였다.
3. 10 mM DCFDA의 5 μL을 추가; 5 μL 의 10 mg/mL Hoechst 용액 및 200 1 mg/mL 프로피듐 요오드화의 200 μL. DCFDA, Hoechst 및 PI의 최종 농도는 염색 매체의 10 mL에서 각각 5 μM, 5 μg/mL 및 20 μg/mL입니다.

4. UV-C 노출 마우스 1 차 안구 세포의 DCFDA 염색

1. UV-C의 3시간 배양 후 다양한 용량으로 마우스 1차 안구 세포를 노출하고, 35 mm 접시로부터 매미를 흡인한다.
2. 신선하게 준비된 DCFDA 염색 매체 2 mL로 각 요리에 부드럽게 보충하십시오.
3. 살아있는 세포 염색을 위해 37°C_CO2 인큐베이터에서 어둠 속에서 15분 동안 염색 매체로 세포를 배양하였다.

5. DCFDA (ROS), 호히스트 및 PI 염색 된 세포의 보기

1. 배양이 완료된 후 염색 매체를 폐기하십시오.
2. 세포에 신선한 완전한 매체를 추가하고 반전된 형광 현미경/세포 이미저(재료표)에서세포를 관찰합니다. 원하는 필드를 사진 : 밝은 필드, 푸른 형광, 붉은 형광, 녹색 형광.
   참고: 청색 형광 염색 세포는 핵이고, 녹색 형광은 ROS 생성 세포를 위한 것이고 적색 형광은 PI 양성 죽은 세포를 나타낸다.

6. 이미징 기술을 사용하여 스테인드 셀 (Hoechst-Blue, PI-Dead 및 Green-ROS)의 정량화

1. 반전형광현미경/셀 이미저로 캡처한 이미지를 ImageJ로 내보내 정량화를 위해.
2. 각 이미지를 한 번에 하나씩 열고 계산을 위해 각 채널(즉, 파란색(핵/Hoechst), 녹색(ROS), 빨간색(죽은/PI 양성))을 순차적으로 사용합니다. 노출되지 않은 컨트롤에서 시작하여 순차적으로 1, 100, 1,000 및 10,000^J/m-2로이동합니다.
3. 각 필드에 대한 소프트웨어 메뉴에서 십자가로 표시된 셀 카운팅 도구를 사용하여 세포를 카운트[청색 양성(Hoechst positive; 핵), 적색 양성(PI 양성; 죽은 세포); 각각의 이미지에 대응하는 녹색 양성(ROS)] 치료.
4. 각 필드의 각 특정 신호를 클릭하여 계산합니다. 예를 들어, 청색/Hoechst 스테인드 핵을 클릭하면 주어진 필드에 있는 핵의 총 수를 볼 수 있습니다.
5. UV 손상에 의한 세포 사멸율(PI 양성 세포 수 x 100을 Hoechst 양성 세포의 수로 나눈 값)과 UV 손상에 의한 ROS 생산 비율(DCFDA 양성 세포 수 x 100의 백분율로 나눈 호에스트 양성 세포의 수)으로 결과를 계산합니다.

결과

DCFDA는 세포에서 ROS를 검출하기 위한 지표로 사용되는 형광의 화학적으로 감소된 형태인 무색 염료이다. 이 염료는 세포 내부에 갇히게되고 녹색 형광을 방출하는 형광 디클로로디하이드로 플루오레스신 (DCF)으로 쉽게 산화됩니다. 이 형광은 형광 현미경 검사법을 사용하여 검출될 수 있습니다. 세포는 다음과 같이 ROS 축적과 가시화 및 상관될 수 있다: (i) ROS가 없는 살아있는 세포는 높은 청색 형광을 방출한다; (ii) ROS 축적을 가진 살아있는 세포는 낮은 녹색 형광을 가진 높은 청색 형광을 방출합니다; (iii) ROS 축적이 있는 죽은 세포는 높은 적색 및 높은 녹색 형광을 가진 낮은 청색 형광을 방출합니다.

UV-C의 1^J/m2에 노출된 대조군 세포 및 세포는 DCFDA/ROS 및 PI 양성 세포를 나타내지 않았다. UV-C 미노출 대조군은 Hoechst 염색에 의해 지시된 것만핵 염색을나타냈다(그림 1)...

토론

여기에 기술된 DCFDA 염색 방법은 UV-C 방사선으로 처리된 마우스 1차 안구 라이브 세포에서 ROS의 시각화를 가능하게 한다. 이 염색 방법의 장점은 연구원이 살아있는 세포에 대한 UV-C (3 시간 UVC 노출 후)의 즉각적인 효과와 ROS 양성의 비율에 대한 동시 열거, 죽은 세포의 동시 열거를 연구 할 수 있다는 것입니다. 더욱이, 염색 방법이 살아있는 세포에 사용됨에 따라, 세포는 UV-C 방사선의 지연된 효과의 연구를 위해 더 긴 시간(수일) 동안 동일한 매체에서 더 배양될 수 있다. 따라서, 이 염색 방법은 ROS 생성 (녹색)을 구상하고 동시에 반전된 형광 현미경의 밑에 살아있는 세포에 있는 살아있는, apoptotic 및 죽은 세포 인구를 구별하는 가능하게 합니다. 그러나 특정 상황에서는 ROS 양성 및 PI 양성 세포를 얻을 것이라는 기대에도 불구하고 시각화가 실패할 수 있습니다. 이러한 경우 문제 해결이 권장됩니다(표2).

이...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2',7'-디클로로플루오레세인 디아세테이트(DCFDA)	시그마	D6883	2',7'-디클로로플루오레세인 디아세테이트는 형광 프로브이며 세포에 투과성이 있습니다. 반응성 산소 종의 정량화에 사용됩니다.
Cell culture dish (35 mm)	Eppendorf	SA 003700112	세포 배양을 위한 멸균 디쉬.
DMEM High Glucose	HiMedia	AT007	가장 널리 사용되는 세포 배양 배지에는 4500mg/L의 포도당이 포함되어 있습니다.
소 태아 혈청, EU Origin	HiMedia	RM99955	세포 배양 배지의 가장 중요한 구성 요소 중 하나입니다. 성장 인자, 아미노산, 단백질, A, D, E, K와 같은 지용성 비타민, 탄수화물, 지질, 호르몬, 미네랄 및 미량 원소를 제공합니다.
GlutMax	Gibco, Thermo Fisher Scientific	35050061	L-글루타민의 보충제 및 대체품으로 사용됩니다. 세포 생존력과 성장을 개선하는 데 도움이 됩니다.
HL-2000 Hybrilinker	UVP		혼성화 오븐/UV 크로스 링커
Hoechst 33342	Sigma	B2261	Hoechst 염색은 살아있는 세포와 죽은 세포 모두에 투과성이 있습니다. 그것은 세포가 죽었는지 살아 있는지에 관계없이 이중 starnded DNA에 결합합니다.
Matrigel	Corning		기저막 매트릭스
MEM 비필수 아미노산 (100X)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	11140050	성장과 생존력을 증가시키기 위한 보충제로 사용됩니다.
페니실린-스트렙토마이신(Pen-Strep)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15140122	페니실린과 스트렙토마이신은 배양물 내 박테리아 오염을 방지하는 데 사용됩니다.
프로피듐 요오드화물	시그마	P4170	죽은 세포에만 투과할 수 있는 형광 염료. 그것은 DNA와 결합하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하는 데 도움이 됩니다.
TryplE Express	Thermo Fisher Scientific		연성 세포 해리제
ZOE 형광 세포 이미저	Bio-rad