이 프로토콜은 마우스 안구 표면 세포로부터살아있는 1차 배양에서 반응성 산소 종(ROS), 살아있는 세포 및 죽은 세포의 동시 검출을 입증한다. 2',-7'-디클로로플루오레세테이트, 프로피듐 요오드화물 및 Hoechst 염색은 ROS, 죽은 세포 및 살아있는 세포를 각각 평가하기 위해 사용되며, 이미징 및 분석이 뒤따릅니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
자외선-C (UV-C) 손상에 응하여 1 차 마우스 안구 표면 세포/줄기 세포에 있는 산화 손상의 평가
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
안구 표면은 다양한 환경 적 요인으로 인해 정기적으로 마모됩니다. UV-C 방사선에 노출은 직업 건강 위험을 구성합니다. 여기에서, 우리는 UV-C 방사선에 마우스 안구 표면에서 1 차적인 줄기 세포의 노출을 보여줍니다. 반응성 산소 종 (ROS) 형성은 산화 스트레스 / 손상의 정도의 판독이다. 시험관 내 실험 환경에서는 산화 스트레스로 인해 생성된 죽은 세포의 백분율을 평가하는 것도 필수적입니다. 이 기사에서는 UV-C 노출 된 마우스의 2',7'-Dichlorofluescececetate (DCFDA) 염색을 시연할 것이며 DCFDA 염색의 형광 이미지에 기초한 1 차적인 안구 표면 줄기 세포 및 정량화를 시연할 것입니다. DCFDA 염색은 ROS 생성에 직접적으로 해당합니다. 우리는 또한 각각 프로피듐 요오드화물 (PI) 및 Hoechst 3332와 DCFDA (ROS 양성) 및 PI 양성 세포의 백분율로 동시에 염색함으로써 죽은 세포와 살아있는 세포의 정량화를 입증합니다.
서론
안구 표면(OS)은 주로 각막, 래크리말 선, 마이보미안 선, 결막, 눈뚜껑 의 일부 및 신호를 변환하는 안구 의 일부의 외층 및 선 상피로 구성된 기능적 단위이다1. 투명 한 돔 모양의 각막 층망막에 빛을 초점을 맞추고 있습니다. 이러한 혈관 조직은 상피 세포, 각질 세포, 내피 세포 및 콜라겐 및 글리코사미노글리칸과 같은 세포 성분으로 구성된다2. 이 지역은 또한 대부분의 영양소를 공급하는 눈물로 배수됩니다. OS의 해부학 적 위치는 종종 밝은 빛, 미생물, 먼지 입자 및 화학 물질과 같은 다양한 가혹한 구성 요소에 노출, 외부 환경과 직접 접촉하도록 강요한다. 이 요인은 물리적 인 부상에 OS를 걸리기 쉽게하고 다양한 질병에 경향이있습니다.
산화 스트레스는 반응성 산소 종(ROS)의 생산과 내인성 항산화 방어 메커니즘 사이의 불균형으로 인해 발생한다3. ROS는 반응성 분자 및 자유 라디칼로 분류되며, 둘 다 미토콘드리아 산화 인산화를 통해 분자 산소(O2)에서유래된다4. 상기 전군은 과산화수소(H2O2), 일중항
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
실험은 스위스 알비노 마우스 눈에서 유래한 1차 안구 세포/줄기 세포에서 수행되었다. 이 실험을 위해 눈을 채취하기 위한 동물의 사용은 기관 동물 윤리위원회, 예네포야(대학로 간주됨)(IEAC 승인 번호, 6a/19.10.2016)에 의해 승인되었다.
1. 시약의 준비
참고 : 마우스 안구 표면에서 1 차 세포 / 줄기 세포의 유도는이 프로토콜의 범위를 벗어납니다. 그러므로, 우리는 UV-C 노출 복용량, ROS, 살아있는 죽은 세포 및 그들의 정량화를 평가하기 위한 시약 준비를 설명합니다. 시약의 각각부(최종 염색 용액을 얻기 위해 첨가될 10% 태아 소 혈청, DCFDA, Hoechst 및 프로피듐 요오드화 스톡 용액)에 대해서는 표 1을 참조하십시오.
- DMSO 5.13 mL에 25 mg의 DCFDA 분말을 용해시켜 10 mM DCFDA의 재고 용액을 준비하십시오. Aliquot 250 μL 각각 호박색 1.5 mL 튜브에 -20°C에서 보관한다.
- 10 mg/mL(16.23 mM 용액)의 스톡 용액을 준비하여 2.5 mL의 탈이온수에서 25 mg 바이알의 전체 내용을 용해시킴으로써 Hoechst 33342를 준비합니다. 호박....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
DCFDA는 세포에서 ROS를 검출하기 위한 지표로 사용되는 형광의 화학적으로 감소된 형태인 무색 염료이다. 이 염료는 세포 내부에 갇히게되고 녹색 형광을 방출하는 형광 디클로로디하이드로 플루오레스신 (DCF)으로 쉽게 산화됩니다. 이 형광은 형광 현미경 검사법을 사용하여 검출될 수 있습니다. 세포는 다음과 같이 ROS 축적과 가시화 및 상관될 수 있다: (i) ROS가 없는 살아있는 세포는 높은 청색 형광을 방출한다; (ii) ROS 축적을 가진 살아있는 세포는 낮은 녹색 형광을 가진 높은 청색 형광을 방출합니다; (iii) ROS 축적이 있는 죽은 세포는 높은 적색 및 높은 녹색 형광을 가진 낮은 청색 형광을 방출합니다.
UV-C의 1J/m2에 노출된 대조군 세포 및 세포는 DCFDA/ROS 및 PI 양성 세포를 나타내지 않았다. UV-C 미노출 대조군은 Hoechst 염색에 의해 지시된 것만핵 염색을나타냈다(그림 1).......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
여기에 기술된 DCFDA 염색 방법은 UV-C 방사선으로 처리된 마우스 1차 안구 라이브 세포에서 ROS의 시각화를 가능하게 한다. 이 염색 방법의 장점은 연구원이 살아있는 세포에 대한 UV-C (3 시간 UVC 노출 후)의 즉각적인 효과와 ROS 양성의 비율에 대한 동시 열거, 죽은 세포의 동시 열거를 연구 할 수 있다는 것입니다. 더욱이, 염색 방법이 살아있는 세포에 사용됨에 따라, 세포는 UV-C 방사선의 지연된 효과의 연구를 위해 더 긴 시간(수일) 동안 동일한 매체에서 더 배양될 수 있다. 따라서, 이 염색 방법은 ROS 생성 (녹색)을 구상하고 동시에 반전된 형광 현미경의 밑에 살아있는 세포에 있는 살아있는, apoptotic 및 죽은 세포 인구를 구별하는 가능하게 합니다. 그러나 특정 상황에서는 ROS 양성 및 PI 양성 세포를 얻을 것이라는 기대에도 불구하고 시각화가 실패할 수 있습니다. 이러한 경우 문제 해결이 권장됩니다(표2).
이.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 기사를 후원하기위한 바이오 라드 연구소 인도 개인 제한에서 자금 지원을받았다.
감사의 글
저자는 예네포야 연구 센터, 예네포야 (대학으로 간주)의 지원을 인정 인프라 시설에 대한.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2',7'-디클로로플루오레세인 디아세테이트(DCFDA) | 시그마 | D6883 | 2',7'-디클로로플루오레세인 디아세테이트는 형광 프로브이며 세포에 투과성이 있습니다. 반응성 산소 종의 정량화에 사용됩니다. |
| Cell culture dish (35 mm) | Eppendorf | SA 003700112 | 세포 배양을 위한 멸균 디쉬. |
| DMEM High Glucose | HiMedia | AT007 | 가장 널리 사용되는 세포 배양 배지에는 4500mg/L의 포도당이 포함되어 있습니다. |
| 소 태아 혈청, EU Origin | HiMedia | RM99955 | 세포 배양 배지의 가장 중요한 구성 요소 중 하나입니다. 성장 인자, 아미노산, 단백질, A, D, E, K와 같은 지용성 비타민, 탄수화물, 지질, 호르몬, 미네랄 및 미량 원소를 제공합니다. |
| GlutMax | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-글루타민의 보충제 및 대체품으로 사용됩니다. 세포 생존력과 성장을 개선하는 데 도움이 됩니다. |
| HL-2000 Hybrilinker | UVP | 혼성화 오븐/UV 크로스 링커 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | B2261 | Hoechst 염색은 살아있는 세포와 죽은 세포 모두에 투과성이 있습니다. 그것은 세포가 죽었는지 살아 있는지에 관계없이 이중 starnded DNA에 결합합니다. |
| Matrigel | Corning | 기저막 매트릭스 | |
| MEM 비필수 아미노산 (100X) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11140050 | 성장과 생존력을 증가시키기 위한 보충제로 사용됩니다. |
| 페니실린-스트렙토마이신(Pen-Strep) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 페니실린과 스트렙토마이신은 배양물 내 박테리아 오염을 방지하는 데 사용됩니다. |
| 프로피듐 요오드화물 | 시그마 | P4170 | 죽은 세포에만 투과할 수 있는 형광 염료. 그것은 DNA와 결합하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하는 데 도움이 됩니다. |
| TryplE Express | Thermo Fisher Scientific | 연성 세포 해리제 | |
| ZOE 형광 세포 이미저 | Bio-rad |
참고문헌
- Gipson, I. K. The ocular surface: the challenge to enable and protect vision: the Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).
- Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
