증식은 세포 기능의 중요한 부분이며, 신약의 잠재적 독성을 평가하는 데 사용되는 일반적인 판독값입니다. 따라서 증식 측정은 세포 생물학에서 자주 사용되는 분석입니다. 여기에서 우리는 부착 및 비 부착 세포에서 사용될 수 있는 증식을 측정하는 간단하고 다양한 방법을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
증식하는 세포의 능력은 대부분의 세포의 정상적인 기능에 필수적이며, 증식의 dysregulation은 많은 질병 과정의 핵심입니다. 이러한 이유로, 증식 측정은 세포 기능을 평가하는 데 사용되는 일반적인 도구입니다. 세포 증식은 계수만으로 측정할 수 있습니다. 그러나 이것은 확산을 측정하는 간접적인 수단입니다. 분할을 준비하는 세포를 직접 검출하는 한 가지 일반적인 방법은 표지된 뉴클레오시드 유사체의 통합입니다. 이들은 방사성 뉴클레오시드 아날로그 3H-티미딘 플러스 5-브로모-2' deoxyuridine (BrdU) 및 5-에티닐-2′-데옥시우리딘 (EdU)와 같은 비방사성 뉴클레오시드 유사체를 포함한다. EdU의 통합은 BrdU에 비해 몇 가지 장점이 클릭 화학에 의해 감지됩니다. 이 보고서에서는 EdU의 통합에 의한 확산을 측정하기 위한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜에는 각각의 장점과 단점과 함께 다양한 판독값에 대한 옵션이 포함되어 있습니다. 또한 계획된 실험의 특정 요구 사항을 충족하기 위해 프로토콜을 최적화하거나 변경할 수 있는 위치에 대해서도 설명합니다. 마지막으로, 우리는 이 기본적인 프로토콜이 그밖 세포 대사 산물을 측정하기 위해 수정될 수 있는 쪽에 접촉합니다.
서론
증식은 세포 기능1,2의중요한 부분입니다. 증식의 통제는 발달과 같은 일반적인 프로세스, 암과 심장 혈관 질병과 같은 병리학 적인 프로세스에 영향을 미칩니다. 혈관 평활근 세포의 과소 플라스틱 성장은 예를 들어, 죽상 동맥 경화증의 전구체로 생각된다3. 세포 증식의 변화는 또한 새로운 약물의 잠재적인 독성을 평가 하는 데 사용 됩니다. 그것의 광범위 한 영향을 감안할 때, 증식 측정은 많은 세포 생물학 기반 실험실의 주류.
관심있는 세포 인구가 상당히 급속하게 분할하는 경우에 세포 증식은 단순히 세포를 계수해서 측정될 수 있습니다. 느린 성장 세포의 경우 세포 수가 덜 민감할 수 있습니다. 증식은 종종 표지된 뉴클레오시드 유사체의 혼입에 의해 측정됩니다. 금 표준은 3H-티미딘 통합이지만, 많은 실험실은 새로운 비 방사성 대안의 가용성을 감안할 때이 방법에서 벗어나고 있다. 이들은 세포질 형광 염료, 세포 주기 관련 단백질의 검출, 및 5-브로모-2' deoxyuridine (BrdU) 및 5-에티닐-2′-데옥시우리딘 (EdU)와 같은 비 방사성 뉴클레오시드 유사체의 혼입을 포....
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프로토콜
1. 형광 라벨을 사용하여 EdU의 검출
- 재고 솔루션
- 이중 증류H2O의 10 mL에 12.5 mg의 EdU를 추가하여 5 mM EdU 재고 솔루션을 준비합니다.
- 라벨 링 솔루션 구성 요소를 준비: 200 mM 트리스 (3-하이드록시 프로필리아졸라메틸) 아민 (THPTA) (1.15 mL H2O에서 100 mg), 100 mM CuSO4 (15.95 mg 1mL H2O; 신선한만들기), 10 mM Cy3 피콜릴-아지드 (10 mM Cy3 피콜릴-아지드 3m , -20 °C에서 5 μL aliquots에 저장하고, 1 M 나트륨 아스코르브산염 (1 mL H2O에서 200 mg; 신선하게 만들다).
- 0.15 mg/mL의 농도로 resazurin 스톡 솔루션을 준비합니다. 필터 살균 및 4 °C에서 1 mL 알리쿼트 저장.
참고: 피콜릴 아지드는 여러 가지 다른 형광, 비오틴 및 고추냉이 과산화공 (HRP)에 공액으로 제공됩니다.
- EdU로 혈관 평활근 세포(VSMC)에 라벨을 붙입니다.
참고: 인간 VSMC는 조직의 이식 된 조각에서 자라난을 통해 장골 동맥에서....
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결과
도 2에서,PDGF에 응하여 VSMC의 증식을 측정하는 3가지 다른 실험의 결과를 입증하였다. SMC를 위해 제형화된 매체에서 세포를 성장한 후, 혈청 무첨가 DMEM에서 실험을 수행하여 혈청 또는 증식에 대한 성장 인자의 잠재적 인 영향을 제거하였다. 그림 2A에서는 형광 대 발광 판독을 사용하여 동일한 실험에서 결과를 비교합니다. 이러한 플레이트를 읽기 위해 흡광도, 형광 및 발광을 읽을 수 있는 멀티 모드 마이크로플레이트 리더를 사용했습니다(재료 표참조).
플레이트 리더를 스캐닝 웰 모드에서 사용하면 형광 수치가 전체 웰에 걸쳐 평균화됩니다. 이 모드는 웰의 중심과 가장자리 간의 차이로 인해 잠재적인 부정확성을 완화합니다. 그러나, 아주 몇몇 핵이 양성인 경우에, 몇몇만 긍정적인 때 이 방법으로 결과를 읽는 것은 확률이 높습니다 양성 세포.......
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토론
EdU의 통합은 세포 증식을 측정하는 간단하고 간단한 방법입니다. 특히 부착세포(13)에유용하다. 우리의 프로토콜은 평활근 세포를 사용하지만 모든 부착 세포 (상피, 내피 등)에 적용 할 수 있습니다. 프로토콜이 복잡하지는 않지만, 한 가지 중요한 단계는 라벨링 솔루션을 만드는 것입니다 - 성분은 나열된 순서대로 추가되어야 합니다. 또한, 케미발광웨스턴 블롯과 마찬가지로, 발광 판독을 사용하는 경우 플레이트를 즉시 읽어야 한다.
필요에 따라 프로토콜의 여러 부분을 수정하거나 최적화할 수 있습니다. 한 부분은 EdU를 가진 배양 기간입니다. 우리의 목표는 가능한 한 많은 증식 세포를 검출하는 것이었기 때문에, 우리는 고정및 염색하기 전에 전체 24 시간 동안 EdU를 추가했습니다. 그러나, 이 타이밍은 S와 G2/M 단계 둘 다에 있는 세포를 측정할 가능성이 높습니다. S 상에서 만 세포에 라벨을 붙이기 위해 Cecchini 등은 천천히 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
케이티 캐롤에게 기술 지원을 부탁드립니다. 우리는 또한 Cytation 화상 진찰 격판덮개 리더의 지시 그리고 제공을 위한 박사 데이비드 쿨 과 Proteomics 분석 실험실감사합니다. 이 작품은 라이트 주립 재단 보조금(L.E.W.)에 의해 지원되었습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Carbosynth | NE08701 | |
| 비오틴 피콜릴 아지드 | 클릭 화학 도구 | 1167-5 | |
| CuSO4 | Fisher Scientific | C1297-100G | |
| Cy3 피콜릴 아지드 | 클릭 화학 도구 | 1178-1 | |
| Cytation Plate Reader | Biotek | ||
| EVOS 현미경 | Thermo Fisher Scientific | ||
| 과산화수소 용액 | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| Na 아스코르브산염 | Sigma-Aldrich | 11140-250G | |
| NucBlue 고정 세포 염색 준비 프로브 | Invitrogen | R37606 | DAPI 핵 염색 |
| Odyssey 차단 버퍼 | Li-Cor | 927-40000 | 차단 버퍼 |
| 파라포름알데히드 | 전자 현미경 서비스 | 15710 | |
| PBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| 염화나트륨 | 시그마 생명 과학 | S3014-5kg | |
| Streptavidin 양 고추냉이 과산화효소 접합 | 생명 과학 | S911 | |
| 슈퍼 신호 ELISA Femto | Thermo Scientific | PI137075 | ELISA 기판 |
| Synergy Plate Reader | Biotek | ||
| THPTA | Click Chemistry Tools | 1010-100 | |
| Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl) | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Triton X 100 | Bio-Rad | 1610407 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
참고문헌
- Fuster, J. J., et al. Control of cell proliferation in atherosclerosis: Insights from animal models and human studies. Cardiovascular Research. 86 (2), 254-264 (2010).
- Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell ....
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재인쇄 및 허가
