엽록체는 식물을 정의하는 소기관입니다. 엽록체는 많은 대사, 발달, 신호 전달 기능과 함께 광합성을 담당합니다. 광합성은 햇빛 에너지를 이용해 생명의 세포 활동을 활성화하는 과정입니다. 따라서 엽록체는 식물뿐만 아니라 식물에 의존하는 수많은 생태계와 농업에도 필수적입니다. 엽록체는 수천 개의 서로 다른 단백질로 구성되어 있으며, 대부분은 핵으로 암호화되어 세포질에서 수입된 후 내부적으로 여러 명확히 구분되는 기관내 구획 중 하나로 전달됩니다. 엽록체 발달과 기능에 대한 보다 완전한 이해를 얻고, 식량 안보나 바이오에너지와 관련된 글로벌 과제를 해결하는 엽록체 조작을 포함한 생명공학 전략을 가능하게 하기 위해서는 중요한 엽록체 단백질의 표적, 위치 및 상호작용을 규명하는 것이 필수적입니다. 이 방법 모음은 이러한 목표를 달성하기 위해 사용할 수 있는 매우 중요하고 상호 보완적인 기법 집합을 설명합니다. 이 컬렉션은 주로 널리 사용되는 모델 식물인 애기장대(Arabidopsis thaliana , 탈레 크레스)에 초점을 맞추지만, 이 방법들은 다른 생물에도 적용될 수 있습니다.
이 컬렉션에는 핵 암호화 단백질이 이중 막 외피를 가로질러 엽록체로 이동하는 과정을 분석하는 두 가지 다른 기법에 대한 설명이 포함되어 있습니다. Ling과 Jarvis의 논문(2)에서는 분리된 엽록체를 방사성 표지된 전구체 단백질과 함께 배양하는 시험관 내 방법을 설명합니다. 엽록체가 전구체 단백질을 얼마나 흡수하는지는 SDS-PAGE와 인광체-영상을 이용해 트랜짓 펩타이드(리더 서열을 표적으로 하는 것) 절단에 따른 단백질 크기 변화를 모니터링하여 결정합니다. 제시된 방법은 수십 년간 시험관 내에서 엽록체 단백질 수입을 연구해온 접근법을 발전시킨 것으로, 공장이 겪는 스트레스 조건에 대한 수입 기계의 반응성을 평가할 수 있는 추가 단계를 포함하고 있습니다. 반면, Lee 등의 논문(6)은 형광 단백질 도메인을 가진 키메라 전구체 단백질의 일시적 발현을 온전한 세포(원형질체)에서 일시적으로 발현하는 방법을 설명합니다. 이 분석에서 엽록체 단백질 수입 정도는 두 가지 방법으로 추적할 수 있습니다: 형광 현미경을 이용해 형광 신호의 위치와 강도를 모니터링하는 방법; 그리고 면역블롯팅을 이용해 전이 펩타이드 절단에 따른 단백질 크기 변화를 분석합니다. 이 두 방법은 매우 상호 보완적이며, 병렬5에서 함께 사용하면 설득력 있는 결과를 낼 수 있습니다.
단백질이 외피를 통해 엽록체로 수입되고, 그 통과 펩타이드가 제거되면, 기질(소기관의 주요 내부 수성 구획)에서 최종 구조를 갖거나, 여러 내부 분류 경로 중 하나에 참여할 수 있습니다. 풍부한 광합성 복합체가 있는 곳으로서 틸라코이드 막은 이러한 내부 분류의 주요 장소입니다; 실제로 틸라코이드 단백질 표적화는 여러 개의 기전적으로 구분되는 경로를 포함합니다. Asher 등7의 논문에서는 다양한 틸라코이드 단백질 전위 경로를 연구할 수 있는 다양한 시험관 내 방법을 설명합니다. 이 방법들은 방사성 표지된 전구체 단백질과 경우에 따라 농축된 기질 추출물과 함께 분리된 틸라코이드를 배양하는 것을 포함합니다. 틸라코이드가 단백질을 얼마나 흡수하는지는 표적 신호의 절단 여부를 평가하고, SDS-PAGE 및 인광체 영상을 사용하여 외부 적용된 열분해신 프로테아제로부터 단백질을 보호하는 방식으로 모니터링됩니다. 물론 틸라코이드만이 엽록체의 하위 구획은 아니며, 다른 구획도 평가할 수 있는 능력이 종종 바람직합니다. 이와 관련해 Bouchnak 등의 논문은 특히 중요한데, 엽록체의 하위 분획을 통해 외피막, 기질, 틸라코이드에 해당하는 고순도 샘플을 생산하는 방법을 설명하고 있습니다. 이 분획들은 준비 후 면역블롯 및/또는 질량분석법으로 분석하여 엽록체 단백질의 아세포자 위치 분석에 관한 풍부한 정보를제공합니다.
단백질-단백질 상호작용 및 다중 단백질 복합체 조립체 분석과 관련하여, 이 컬렉션에는 두 가지 다른 방법론이 설명되어 있습니다. Shanmugabalaji 등의 논문10은 엽록체 다단백질 복합체의 친화성 정제 방법을 제시합니다. 이 기법은 친화성 태그(소위 연합 친화성 정화 태그, TAP 태그)를 부착하도록 설계된 복합체의 구성 요소를 발현한 형질전환 식물을 분석하는 것을 포함합니다. 이 태그가 원래 불활성 매트릭스에 강하게 결합하는 능력은 정제 전략의 일부로 활용됩니다. 제시된 방법은 특히 엽록체 단백질 도입 기구(외피막1에 내장된 TOC와 TIC라는 다중 단백질 복합체로 구성됨)의 정제에 초점을 맞추지만, 원칙적으로는 엽록체11에 존재하는 다른 다중 단백질 조립체 연구에도 적용할 수 있습니다. Rantala 등의 논문12에서는 자연 조건에서 전기영동을 기반으로 한 복잡한 특성 분석에 대한 보완적 접근법을 설명하고 있습니다. 여기서 제시된 이 기술은 순한 비이온 세제를 사용해 정제된 틸라코이드에서 광합성 복합물을 해방한 후, 블루 네이티브(BN)-PAGE를 사용해 분리하는 과정을 포함합니다. 복합체의 1차 분해 후에는 변성 조건에서 두 번째 차원의 전기영동이 진행될 수 있으며, 이를 통해 첫 번째 차원에서 식별된 각 복합체의 개별 성분을 시각화할 수 있습니다. TAP 방법과 마찬가지로, 이 네이티브 PAGE 접근법은 소기관 내 다른 단백질 복합체 연구에도 성공적으로 적용할 수 있습니다. 어느 방법이든 정제 복합체는 면역 블롯 및 질량 분석법 등 다양한 방식으로 분석할 수 있습니다.
이 방법 모음에 포함된 논문들은 기존 자료15,16과 결합하여 엽록체 생합성과 기능의 다양한 측면, 특히 소기관 단백질체와 밀접하게 연관된 측면에 대한 이해를 크게 향상시킬 수 있는 강력한 보완 기법 세트를 제시합니다. 엽록체는 육상 광합성 1차 생산의 대부분을 담당하며, 식물이 환경에 반응하는 것(생물적 및 비생물적 스트레스 모두)에서 중요한 역할을 하기 때문에, 이 놀라운 소기관들은 앞으로도 전 세계적으로 기초 및 응용 연구의 주요 초점으로 남을 것입니다.