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방법 논문

마우스에서 심근 경색을 연구하는 극저온 손상 모델

9.3K 조회수

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DOI:

10.3791/59958

⸱

2019년 9월 19일

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1Transplant and Stem Cell Immunobiology Lab, University Heart Center, 2Department of Surgery, Transplant and Stem Cell Immunobiology Lab, University of California San Francisco, 3Cardiovascular Research Center (CVRC) and DZHK German Center for Cardiovascular Research, 4Division of Cardiology, Cardiovascular Research Institute, University of California San Francisco, 5Cardiovascular Surgery, University Heart Center

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 문서는 마우스에서 심근 극저온 손상 후 심장 리모델링을 연구하는 모델을 보여줍니다.

초록

동물 모델의 사용은 급성 관상 동맥 증후군과 그 합병증에 대한 새로운 치료 전략을 개발하는 데 필수적입니다. 이 문서에서는 높은 재현성과 복제성을 가진 정확한 경색 크기를 생성하는 뮤린 저온 상해 경색 모델을 보여줍니다. 간단히 말해서, 동물의 삽관과 흉기 절제술 후 심장이 흉부에서 들어 올려지습니다. 핸드헬드 액체 질소 전달 시스템의 프로브가 심근 벽에 적용되어 저온 손상을 유발합니다. 심실 기능 및 전기 전도 가 손상된 심초음파 또는 광학 매핑으로 모니터링할 수 있습니다. 경색 된 영역의 경막 심근 리모델링은 콜라겐 증착 및 심근 세포의 손실을 특징으로합니다. 다른 모델(예: LAD-결찰)과 비교하여, 이 모델은 핸드헬드 액체 질소 전달 시스템을 활용하여 보다 균일한 경색 크기를 생성합니다.

서론

급성 관상 동맥 증후군 (ACS)은 서방 세계1,2에서사망의 주요 원인입니다. 관상 동맥의 급성 폐색은 영향을받는 심장 조직의 허혈성 캐스케이드 및 괴사의 활성화로 이어진다3. 손상된 심근은 점차 적으로 비 수축성 흉터 조직으로 대체되며, 이는 임상적으로 심부전으로 매니페스트4,5. ACS의 처리에 있는 최근 어드밴스에도 불구하고, ACS 와 ACS 관련 심부전의 보급은 상승하고, 치료 선택권은 제한됩니다6,7. 따라서 ACS와 그 합병증을 연구하기 위한 동물 모델을 개발하는 것은 엄청난 관심사입니다.

현재까지 ACS 및 ACS 유도 심근 리모델링을 연구하기 위해 가장 널리 사용되는 동물 모델은 좌측 내림차순 관상 동맥(LAD)의 결찰이다. LAD의 결찰은 ACS 동안 인간의 심근 조직과 유사한 심근의 급성 허혈을 유도합니다.  그러나, 일치하지 않는 경색 크기는 LAD 결찰의 아킬레스건 발 뒤꿈치 남아있다. LAD의 외과적 변이 및 해부학적 가변성은 일관되지 않은 경색 크기로 이어지고 이 절차의 재현성 및 복제성을 저해하는8,9,10. 또한, LAD 결찰은 높은 수술 후 사망률을 가지고 있다. 재현성을 향상시키고 사망률을 줄이기 위한 최근의 노력에도 불구하고11,12,많은 수의 동물이 여전히 리모델링 방지 요법을 제대로 평가할 필요가 있다.

ACS의 대체 모델은 무선 주파수13,열14 또는 극저온 상해15,16,17,18을포함하여 최근 몇 년 동안 제안되고 연구되었다. 현재 의 극저온 손상 방법은 액체 질소에 미리 냉각된 금속 막대를 적용하여 피험자의 심장 조직을 손상시키는15,16. 그러나 이 절차는 충분한 경색 크기를 생성하기 위해 여러 번 반복되어야 합니다. 조직에 비해 막대의 높은 전도도 및 낮은 열 용량으로 인해 프로브가 빠르게 따뜻해지고 조직이 이질적으로 냉각됩니다(따라서 경색)됩니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 휴대용 액체 질소 전달 시스템을 활용하는 극저온 절색 모델을 설명하기 위해 여기에 기술한다. 이 모델은 재현 가능하고 수행하기 쉬우며 빠르고 안정적으로 확립할 수 있습니다. 관상 동맥 해부학의 독립적인 재현가능한 경색 병변은 결국 심장 실패로 이끌어 내는 생성됩니다. 이 방법은 신규한 치료 적 약리학 및 조직 공학 기반 전략의 평가를 위한 리모델링 공정을 연구하는 데 특히 적합하다.

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프로토콜

동물은 실험실 동물 자원 연구소에 의해 준비, 실험실 동물의 원칙에 대한 가이드를 준수인도적 치료를받았다, 건강의 국립 연구소에 의해 출판. 모든 동물 프로토콜은 책임있는 지역 당국 (캘리포니아 샌프란시스코 대학 (UCSF) 기관 동물 관리 및 사용위원회)에 의해 승인되었습니다.

1. 동물 관리

  1. 약 27g의 체중14주(예: 실험실 동물 연구소)에서 생쥐를 구하십시오.
    참고: BALB/c 마우스는 이 문서에 사용됩니다.
  2. 통풍이 잘되는 캐비닛에 마우스를 보관하고 표준 마우스 차우와 오토클레이브 워터 광고 리비텀을 공급하십시오.

2. 마우스 준비

  1. 유도 챔버를 사용하여 이소플루란 (3.5 %)으로 마우스를 마취하십시오.
  2. 헤어 트리머를 사용하여 가슴과 목 의 머리카락을 제거합니다.
  3. 가열 된 패드에 supine 위치에 마우스를 놓고 마우스의 입과 코를 덮는 얼굴 마스크와 마취를 유지합니다.
  4. 뒷발과 꼬리를 꼬집어 반사 신경이 없는지 확인하여 마취의 깊이를 충분히 확인하십시오.
  5. 피하 부프레노르핀을 주입 (0.03 mg/kg) 진통에 대한.
  6. 뒷다리와 앞다리를 펴고 테이프를 사용하여 위치를 고정합니다.
  7. 포비동 요오드를 사용하면 면도 부위를 소독한 다음 80 % 에탄올로 문질러보입니다. 이 단계를 두 번 반복합니다.
  8. 작은 가위를 사용하여 흉골의 아래 쪽 3 분의 1에서 턱까지 중간 선 피부를 절개합니다.
  9. 구부러진 집게를 사용하고 목 주위의 근육을 조심스럽게 분리하여 기관을 노출시하십시오.
  10. 두 번째와 세 번째 연골 반지 사이의 기관 절제술을 수행하기 위해 마이크로 가위를 사용합니다.
  11. 0.5 mL의 조수 부피로 인공 호흡기를 분절110/분의 환기 주파수로 설정합니다.
  12. 안면 마스크를 제거하고 인공호흡기에 연결된 플라스틱 캐뉼라(20G)를 기관에 삽입합니다. 동물을 환기시다.
    참고: 양측 폐 환기를 확인하여 환기 캐뉼라가 너무 깊게 삽입되지 않았는지 확인하십시오.
  13. 소작을 사용하여 세 번째와 일곱 번째 갈비뼈 사이의 흉골 기원에서 오른쪽 가슴 근육을 분리하십시오.
  14. 측면 각진 스프링 가위를 사용하여 흉골에 가능한 한 가깝게 네 번째에서 여섯 번째 갈비뼈를 자른다.
  15. 유방동맥을 소작, 출혈이 보이는 경우.
  16. 이소플루란을 2.5%로 감소시.
  17. 가슴 구멍으로 명확한 보기를 얻기 위하여 근본적인 결합 조직을 해부하십시오.
  18. 무딘 포셉을 사용하여 심낭을 열고 심장을 노출시하십시오.
  19. 미니 골드스타인 리트랙터를 사용하여 갈비뼈를 펼치고 가슴 구멍을 열어 두십시오.
  20. 무딘 막대로 흉부 구멍에서 심장을 들어 올립니다.
  21. 가슴 개구부를 줄이고 심장이 뒤로 떨어지는 것을 막기 위해 리트랙터의 장력을 줄입니다.
  22. 냉동 프로브(직경 3mm)를 10s로 미리 식힙니다.
  23. 전방 좌심실 벽에 저온 프로브를 적용하고 좌심실 저온 손상 경색을 생성하기 위해 10 s동안 동결합니다.
    참고 : 저온 프로브는 과학적 질문과 필요에 따라 다른 심장 벽에 적용 할 수 있습니다.
  24. 좌심실 벽에서 프로브를 분리하기 위해 실온 식염수로 저온 프로브를 관개합니다.
  25. 리트랙터를 사용하여 가슴 개구부를 확대합니다.
  26. 무딘 막대로 심장을 흉강으로 부드럽게 되돌려 보냅니다.
  27. 리트랙터를 제거하고 6-0 봉합사를 사용하여 단일 매듭으로 스테노토미를 연결하십시오.
  28. 6-0 실행 봉합사를 사용하여 가슴 구멍을 닫습니다. 매듭을 묶기 전에 10 mL 주사기를 사용하여 가슴에서 남은 공기를 배출하십시오.
  29. 꼬리 가장자리에서 피부를 적응시키고 실행 봉합사 (5-0)로 기관 개구부 지점에 봉합하십시오.
  30. 이소플루란을 1.5%로 설정하고 동물이 자발적으로 호흡할 때까지 기다립니다.
  31. 기관 카테터를 제거하고 마취를 유지하기 위해 동물의 입과 코에 얼굴 마스크를 다시 적용합니다.
  32. 기관 절개를 하나 8-0으로 닫습니다. 봉합 사.
  33. 기관을 덮기 위하여 복부 목 근육을 그들의 위치로 다시 재배치하십시오.
  34. 피부 봉합사를 완료합니다.
  35. 마시기 물에 메타미졸을 추가 (50 mg 메타 미졸 당 100 mL) 통증 진통에 대 한 3 일 동안 매일 동물을 모니터링.
    참고: 이 모델의 관찰 기간은 8주입니다. 진통제 처방에 관한 기관의 지침을 따라야합니다.

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결과

극저온 상해 경색 모델은 ACS 및 그 합병증을 연구하기에 적합합니다. 낮은 사망률과 효율적인 수술 후 회복이 이 모델에서 볼 수 있습니다. 극저온 손상은 심근 손상을 유발하여 심장 기능 감소, 전기 분리 및 교란 리모델링으로 이어집니다.

심초음파는 생체 내에서 비침습적으로 심장 기능을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 극저온 손상 된 심장에서, 심초음파는 크게 감소 된 배출 분획 및 분수 영역 변화를 보여줍니다(그림 1a-c). 기능장애는 수술 후 7일째부터 56일간의 관찰종점까지 이어진다.

상세한 심장 기능은 압력 체적 루프 (PV 루프) 분석을 통해 침략적으로 평가될 수 있습니다. 1.2 Fr 전도도 카테터가 좌심실로 도입되고 좌심실 압력이 좌심실 부피에 대해 플롯됩니다. 스트로크 볼륨, 스트로크 작업, 심장 출력 및 예부하 조정 된 최대...

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토론

이 문서에서는 ACS 및 관련 약리학 및 치료 선택권을 조사하기 위하여 마우스 극저온 상해 모형을 기술합니다.

가장 중요한 단계는 심장 조직에 저온 프로브를 적용하는 것입니다. 최적의 경색 크기를 얻고 재현 가능한 결과를 보장하기 위해 접촉 기간을 엄격하게 제어해야 합니다. 심근의 장기간 냉각은 대형 경색 또는 심실 천반으로 이어질 것입니다. 대조적으로, 단축된 냉각 시간은 제한된 epicardial 병변을 생성하고 모든 상주 세포를 제거하지 않습니다. 따라서, 이것은 재생 세포 이식을 공부할 때 혼란스러울 수 있습니다.

다른 극저온 절색방법(20)에비해, 본 문서에 설명된 개방흉도 접근법은 경색이 심장의 상이한 위치에 자유롭게 유도될 수 있다는 장점이 있다. 더욱이, 이 접근법은 경색 경계가 보이고, 세포 이식 부위가 그에 따라 선택될 수 있기 때문에 치료 세포 주입 또는 패치 적용을 ...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

크리스티안 파르만이 기술적인 도움을 주신 것에 대해 감사드립니다. D.W.는 맥스 케이드 재단의 지원을 받았습니다. T.D.는 엘스 크뢰너 기념회(2012_EKES.04)와 도이치 포르충스게마인샤프트(DE2133/2-1_)로부터 보조금을 받았다. S. S. 도이치 포르충제마인샤프트(DFG; SCHR992/3- 1, SCHR992/4-1).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10 ml 주사기Thermo Scientific03-377-23
5-0 프롤렌 봉합EthiconEH7229H
6-0 프롤렌 봉합사Ethicon8706H
8-0 Ethilon 봉합사Ethicon2808G
Absorption SpearsFine Science Tools18105-01
BALB/cThe Jackson Laboratory재고 번호 000651
Bepanthen 눈과 코 연고Bayer1578675눈 연고
Betadine Solution BetadinePurdue PharmaNDC:67618-152
둔기 펜치파인 사이언스 도구18025-10
BuprenexReckitt BenckiserNDC 코드:  12496-0757-1, 12496-0757-5부프레노르핀
극저온 시스템 3mmBrymill 극저온 시스템Cry-AC-3 B-800
에탄올 70%Th. Geyer2270
집게 곡선S& T00284
집게 미세과학 도구11251-20
집게 표준미세 과학 도구11023-10
총 해부학 프로브미세 과학 도구10088-15
이발기WAHL8786-451A ARCO SE
고온 소작 키트Bovie18010-00
ISOFLURANEHenry Schein 동물 건강029405
IV 카테터 20GB. Braun603028
Mini-Goldstein 견인미세 과학 도구17002-02
NaCl 0.9%B.BraunPZN 06063042                  예술. 번호: 3570160식염
바늘 홀더Fine Science Tools12075-14
바늘 홀더, 곡선형하버드 장치72-0146
NovaminsulfonRatiopharmPZN 03530402Metamizole
운영 보드 Braintree Scientific39OP
교체 가능한 세밀한 팁BovieH101
가위세밀한 과학 도구14028-10
작은 동물 인공호흡기Kent ScientificRV-01
스프링 가위 - 옆면에 각도밀한 과학 도구15006-09
수술용 현미경Leica M651
Transpore 수술 테이프3M1527-1
Vannas 스프링 가위미세 과학 도구15400-12
기화기 켄트 사이언티픽VetFlo-1205S
사 기 수 조절 세

참고문헌

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  20. van den Bos, E. J., Mees, B. M., de Waard, M. C., de Crom, R., Duncker, D. J. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: a comparison with coronary artery ligation. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (3), 1291-1300 (2005).

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