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깨지기 쉬운 X 정신 지체-1 유전자에서 시토신 구아닌-구아닌 트리뉴클레오티드 반복을 정량화하기 위한 견고한 폴리머라제 연쇄 반응 기반 분석

DOI:

10.3791/59963

⸱

September 16th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Central Laboratory, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University, 2Department of Obstetrics and Gynaecology, The Chinese University of Hong Kong, 3Shenzhen Research Institute, The Chinese University of Hong Kong, 4Department of Genetics and Metabolism, Maternal and Child Health Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, 5PerkinElmer Diagnostics, 6Department of Obstetrics and Gynecology, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University, 7Maternal-Fetal Medicine Institute, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

연약한 X 정신 지체-1 유전자에서 시토신 구아닌-구아닌 트리뉴클레오티드 반복을 정량화하기 위한 정확하고 견고한 중합효소 연쇄 반응 기반 분석은 깨지기 쉬운 X 증후군 및 연약한 X 증후군및 연약한 X 관련의 분자 진단 및 스크리닝을 용이하게 합니다. 턴라운드 시간이 짧고 장비에 대한 투자가 부족합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

깨지기 쉬운 X 증후군(FXS) 및 관련 장애는 연약한 X 정신지체-1(FMR1)유전자 프로모터의 5' 번역되지 않은 영역(UTR)에서 시토신 구아닌(CGG) 삼뉴클레오티드 반복의 확장에 의해 유발된다. 종래에는 유전분석기의 모세관 전기동공단편 분석이 FMR1의CGG 반복의 크기 조정에 사용되지만, 반복 횟수가 200개 이상일 때 정확한 측정을 위해 추가적인 남부 얼룩 분석이 요구된다. 여기서, 우리는 FMR1의CGG 반복의 정량화를 위한 정확하고 견고한 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기반 방법을 제시한다. 이 시험의 첫 번째 단계는 깨지기 쉬운 X PCR 키트를 사용하여 FMR1 프로모터의 5'UTR에서 반복 서열을 증폭한 다음, PCR 제품의 정제 및 미세 유체 모세관 전기 동공 계측기의 단편 크기 조정, 및 분석 소프트웨어를 사용하여 알려진 반복으로 표준을 참조하여 CGG 반복 횟수를 후속 해석합니다. 이러한 PCR 기반 분석법들은 재현가능하고 200개 이상의 반복 횟수(전체 돌연변이로 분류됨), 55~200(전분), 46~54(중간), 및 10을 포함하는 FMR1 프로모터의 전체 범위의 CGG 반복을 식별할 수 있다. 45 (정상). 그것은 견고성과 빠른보고 시간으로 FXS 및 깨지기 쉬운 X 관련 장애의 분류를 용이하게하는 비용 효율적인 방법입니다.

Introduction

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깨지기 쉬운 X 증후군 (FXS) 및 깨지기 쉬운 X 관련 무질서, 예를 들면, 전율 및 운동 실조 증후군 (FX-TAS), 및 1 차적인 난소 불충분 (FX-POI)는 주로 5'번역되지 않은 에 있는 cytosine 구아닌 구아닌 (CGG) trinucleotide 반복 확장에 기인합니다 Xq27.31,2에깨지기 쉬운 X 정신 지체-1(FMR1)유전자의 영역 (UTR) FMR1 인코딩 단백질 (FMRP)은 mRNA의 대체 접합, 안정성 및 수지상 수송을 조절하여 신경 발달 및 시냅스 가소성에서 작동하는 폴리리보솜 관련 RNA 결합 단백질 또는 변조 합성입니다. 부분 적인 후두 단백질의 3,4 ,5,6,7.

>200의 CGG 반복 크기를 가진 동적 변이는 전체 돌연변이로 설명되며, 이는 FMR1 프로모터....

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Protocol

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홍콩 공동 중국대학-신계 동쪽 클러스터 임상 연구 윤리위원회(참조 번호: 2013.055)

1. PCR 증폭

  1. 시작하기 전에 PCR 완충제 혼합물, 시료 희석제 및 DNA 샘플(검사 및 참조 DNA 모두)을-20°C 냉동고에서 제거하고 모든 시약과 DNA가 완전히 해동되었는지 확인하기 위해 실온에서 20-30분 동안 보관하십시오. 소용돌이와 사용하기 전에 잠시 아래로 돌루.
  2. 분광광도계를 사용하여 DNA 샘플의 농도를 측정합니다(재료 표참조). DNA 농도는 25 ng/μL이어야 합니다. 필요한 경우 적절한 농도로 희석된 시료로 희석하십시오.
    참고: DNA는 단백질과 높은 염분 농도와 같은 방해 물질을 제거하기 위해 추출되고 정제되어야합니다. 비 분해, 고품질 DNA는 후속 PCR 증폭 및 분석에 사용되어야한다 (A260 / A280 : 1.8-2.0 및 A260 / A230 : >1.0).
  3. 참조 및 테스트 된 DNA 샘플을 식별하기 위해 PCR 플레이트 또는 0.2 mL PCR 튜브의 우물을 라벨.
  4. 테스트 샘플, 2개의 참조 샘플 및 음성 대조군 샘플에 필요한 PCR 반응 수를 ....

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Results

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상기 전돌연변이 암 기준 샘플(NA20240, 30 및 80의 반복 크기)과 전체 돌연변이 암 기준 샘플(NA20239, 20 및 200의 반복 크기)의 크기 조정 결과는 각각 도 1A 및 도 1B에나타내고 있다. 전형적으로, 2개의 마커 피크(하부 마커 50 염기 쌍 [bp] 및 상부 마커 10,380 bp)는 단편 크기 프로파일에 포함된다. 일반적으로 거의 95 bp의 크기와 프라이머 복잡한 피크가있다. 참조 샘플을 통해 그림 1C에나타낸 것처럼 4개의 점이 있는 선형 회귀 표준 곡선을 구성할 수 있습니다.

임상 정상, 중간, 전분 및 전체 돌연변이 샘플의 대표적인 크기 특징은 도 2A-D에나타내고 있다. 특히, 두 개의 확장된 단편 .......

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Discussion

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FXS는 삼중 21 후 지적 장애의 두 번째 가장 흔한 원인이며, X 연결 정신 지체30의거의 절반을 차지하며, 이는 4,000명의 남성중 약 1명, 8,000명의 여성 중 1명에 영향을 미칠 수 있습니다. 더 중요한 것은, 250-1,000명의 암컷에 있는 거의 1은 premutation를 전송하고, 이 주파수는 남성26,31,32,33에서250-1,600에서 1입니다. CGG의 반복 팽창 위험이 전열 대립 유전자를 자식으로 전송할 때 급격히 상승하기 때문에, 예를 들어, 모계 반복 크기가 55-59 ~ 98%일 때 크기가 100-20014일때 CGG의 결정이 결정됩니다. 더 넓은 범위에서 반복 크기는 그들의 생식 .......

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Disclosures

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저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgements

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이 연구는 NSFC 비상 관리 프로젝트 (그랜트 번호 81741004), 중국의 국립 자연 과학 재단 (그랜트 번호 81860272), 광시 지방 과학 기술 재단의 주요 연구 계획 ( 그랜트 번호 AB16380219), 중국 박사 후 과학 재단 보조금 (그랜트 번호 2018M630993), 광시 자연 과학 재단 (그랜트 번호 2018GXNSFAA281067).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Agilent 2100 Bioanalyzer 기기: 0.2 mL PCR 튜브AxygenPCR-02D-C
Agilent 2100 Bioanalyzer 기기: 1x TE 버퍼, pH 8.0, Rnase-freeAmbionAM9849
Agilent 2100 Bioanalyzer 기기: 2100 Bioanalyzer 기기AgilentG2939AA
Agilent 2100 Bioanalyzer 기기: 96-well PCR PlateThermo FisherAB0800
Agilent 2100 Bioanalyzer 기기 : 전극 카트리지Agilent는 2100 Bioanayzer 기기의 장비를 공급
Agilent 2100 Bioanalyzer 기기 : IKA 와류 믹서Agilent는 2100 Bioanayzer 기기의 장비를 공급
Agilent 2100 Bioanalyzer 기기 : 사이징 소프트웨어 2100 Expert 소프트웨어Agilent2100 Bioanayzer 기기
Agilent 2100 Bioanalyzer 기기 장비 공급: 테스트 칩Agilent2100 Bioanayzer 기기
Agilent DNA 7500 키트Agilent5067-1506장비
Agilent DNA 7500 키트: DNA 7500 Ladder(노란색 캡)AgilentIn 키트: Agilent DNA 7500 키트(카탈로그 번호: 5067-1506)
애질런트 DNA 7500 키트: DNA 7500 마커(녹색 캡)애질런인 키트: 애질런트 DNA 7500 키트(카탈로그 번호: 5067-1506)
애질런트 DNA 7500 키트: DNA 칩애질런인 키트: 애질런트 DNA 7500 키트(카탈로그 번호: 5067-1506)
애질런트 DNA 7500 키트: DNA 염료 농축액(파란색 캡)애질런인 키트: 애질런트 DNA 7500 키트(카탈로그 번호: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 키트: DNA Gel Matrix Vial (빨간색 캡)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (카탈로그 번호: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: 전극 세정제AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (카탈로그 번호: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: 스핀 필터AgilentDNA 7500 kit (카탈로그 번호: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: 주사기애질런트 AgilentDNA 7500 키트 소모품 (카탈로그 번호: 5067-1506)
칩 프라이밍 스테이션Agilent5065-44012100 Bioanayzer 장비
Cubee Mini-centrifugeGeneReachaqbd-i
필터 플레이트 진공 매니폴드: MultiScreenHTS 진공 매니폴드Merck MilliporeMSVMHTS00PCR 제품 정화를 위한 필터 플레이트 진공 매니폴드용 진공
기기 필터 플레이트 진공 매니폴드: 실리콘 스토퍼Merck MilliporeXX2004718필터 플레이트 진공 매니폴드
필터 플레이트 진공 매니폴드: 진공 펌프Merck MilliporeWP6122050필터 플레이트 진공 매니폴드
필터 플레이트 진공 매니폴드: 폐기물 수집 용기Merck MilliporeXX1004705필터 플레이트 진공 매니폴드
FragilEase Fragile X PCR 키트PerkinElmer3101-0010PCR 증폭용
합니다 합니다 공급 트 트 트

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Verkerk, A. J., et al. Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome. Cell. 65, 905-914 (1991).
  2. Fu, Y. H., et al.

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