제시된 방법은 DNA 이중 가닥 나누기 (DSBs), 세포 주기 분포 및 세포 자멸의 정량 분석을 결합하여 DSB 유도 및 수리의 세포 주기 별 평가뿐만 아니라 수리 실패의 결과를 가능하게합니다.
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이 논문에서
요약
초록
제시된 방법 또는 약간 변형된 버전은 임상 종양학에서 사용된 것과 같이 각종 항암 처리의 특정 처리 반응 그리고 부작용을 공부하기 위하여 고안되었습니다. 방사선 요법과 다수의 항암 제에 의해 유도된 바와 같이, 유독성 스트레스 후 DNA 손상 반응의 정량적 및 세로 분석을 가능하게 한다. 이 방법은 DNA 손상 반응의 모든 단계를 커버, DNA 이중 가닥 휴식의 유도 및 수리를위한 엔드 포인트를 제공 (DSBs), 세포 주기 체포 및 수리 실패의 경우 세포 사멸에 의한 세포 사망. 이 측정을 결합하는 것은 세포 주기 의존적인 처리 효력에 관하여 정보를 제공하고, 이렇게 DNA 손상에 대하여 세포 증식과 대처 기계장치 사이 상호 작용의 심층적인 연구를 허용합니다. 화학요법제 및 이온화 방사선을 포함한 많은 암 치료제의 효과는 특정 세포 주기 단계에 따라 제한되거나 강하게 변화하기 때문에, 상관분석은 치료 효과를 평가하기 위한 강력하고 실행 가능한 방법에 의존합니다. 세포 주기 특정 방식으로 DNA에. 이것은 단일 엔드포인트 어세이와 제시된 방법의 중요한 이점으로는 불가능합니다. 이 방법은 임의의 특정 세포주에 제한되지 않으며 다수의 종양 및 정상 조직 세포주에서 철저히 시험되었다. 종양 세포의 유전적 불안정성 평가, 약물 스크리닝 및 평가를 포함하여 방사선 종양학 외에 종양학의 많은 분야에서 포괄적인 유전독성 분석술로 널리 적용될 수 있다.
서론
종양학의 목표는 정상적인 세포를 손상시키지 않고 암세포를 죽이거나 비활성화하는 것입니다. 많은 치료는 직접 또는 간접적으로 암세포에서 유전자 독성 스트레스를 유도하지만, 일부는 정상 세포에서 확장됩니다. 화학요법 또는 표적 약물은 종종 방사선 요법과 결합되어 조사된종양 1, 2,3,4,5의방과민성을 향상시킵니다. 방사선 선량은 정상적인 조직 손상을 최소화합니다.
이온화 방사선 및 기타 유독성 제제는 염기 수정, 가닥 가교 및 단일 또는 이중 가닥 파손을 포함한 다양한 종류의 DNA 손상을 유발합니다. DNA 이중 가닥 나누기 (DSBs)는 가장 심각한 DNA 병변이고 그들의 유도는 방사선과 방사선 화학요법에 있는 각종 세포 성 약의 세포 살해 효력의 열쇠입니다. DSB는 게놈의 무결성을 해칠뿐만 아니라 돌연변이 6,7의형성을촉진합니다. 따라서, 다른 ....
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프로토콜
1. 준비
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시작 물질로 배양 용기의 모든 유형에 ≥1 x 105 세포 / 샘플을 준비합니다.
- 예를 들어, U87 아교모세포종 세포를 이온화 방사선에 노출한 후 시간 코스 실험을 수행합니다: 각 시점마다 삼중배액으로 T25 플라스크에서 하위-Confluent U87 세포를 조사합니다. 초기 시간 포인트(조사 후 15분에서 최대 8시간)를 선택하여 DSB 수리(γH2AX 수준) 및 늦은 시간 점(24h ~ 96시간)의 역학을 따라 잔류 DSB 수준, 세포 주기 효과 및 세포 사멸을 평가합니다.
참고: 프로토콜은 조사 실험 또는 임의의 특정 세포주에 제한되지 않는다. 그것은 모든 종류의 수많은 세포주, 다른 종에서 그리고 다양 한 치료 조건에 대 한 테스트 되었습니다.
- 예를 들어, U87 아교모세포종 세포를 이온화 방사선에 노출한 후 시간 코스 실험을 수행합니다: 각 시점마다 삼중배액으로 T25 플라스크에서 하위-Confluent U87 세포를 조사합니다. 초기 시간 포인트(조사 후 15분에서 최대 8시간)를 선택하여 DSB 수리(γH2AX 수준) 및 늦은 시간 점(24h ~ 96시간)의 역학을 따라 잔류 DSB 수준, 세포 주기 효과 및 세포 사멸을 평가합니다.
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10% 초과 부피를 포함한 다음 솔루션을 준비합니다.
- 인산완식염수(PBS)에서 4.5% 파라포름알데히드(PFA)로 구성된 고정 용액 샘플당 2 mL를 준비합니다. 솔루션을 신선하게 준비합니다. 연기 후드 하에서 천천히 교반하여 80°C로 가열하여 PBS에서 PFA를 희석한다. 열 손실을 방지하기 위해 알루미늄 호일로 플라....
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결과
인간 U87 또는 LN229 교모세포종 세포를 광자 또는 탄소 이온 방사선의 4Gy로 조사하였다. 세포 주기 특이적 γH2AX 수준 및 세포자멸은 여기에 제시된 유세포측정 방법을 사용하여 조사 후 최대48시간까지 상이한 시점에서 측정하였다(도 3). 두 세포주에서, 탄소 이온은 더 느린 감소와 동일한 물리적 용량에서 광자 방사선에 비해 24~48시간에서 유의하게 상승된 γH2AX 피크 수준을 유도하였다(도4A). 이것은 탄소 이온이 덜 효율적으로 수리된 광자보다 DNA 이중 가닥 파손(DSB)의 피크 수치가 더 높다는 것을 나타냈습니다. 두 방사선 유형 모두에 대해, γH2AX 수준은 G1 세포에서 가장 높았는데, 아마도 DSB 수리가 세포 주기의 이 단계에서 비상동성 종단 접합의 경로로 제한되기 때문일 것이다.
더 높은 DSB 유도 속도 및 .......
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토론
추천된 방법은 사용하기 쉽고 이중 가닥 브레이크(DSB) 유도 및 수리, 세포 주기 효과 및 세포 사멸을 포함한 DNA 손상 반응의 빠르고 정확하며 재현 가능한 측정을 제공합니다. 이러한 끝점의 조합은 개별 적인 비약적인 비고지 보다는 그들의 상호 관계의 더 완전한 그림을 제공합니다. 이 방법은 방사선 생물학, 치료 및 보호, 그리고 종양학 (예를 들어, 환경 위험 요소 평가, 약물 스크리닝 및 유전 평가)의 분야에서 포괄적 인 유전 독성 분석법으로 널리 적용 될 수 있습니다. 종양 세포의 불안정성).
이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 셀의 고정입니다. 명확하게 정의된 세포 집단과 다른 세포 주기 단계의 최적 분해능을 가진 깨끗한 견본을 장악하기 위하여는, 배양 용기에서 분리하고 완전히 둥근 모양을 형성하기 위하여 부착된 세포를 충분히 시간을 주는 것이 중요합니다. 세포는 세포 덩어리없이 단일 세포 현탁액으로 고정 용액으로 옮겨져야한다. 그(것)들을 분리하기 위하여는, 세포는 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
우리는 독일 암 연구 센터 (DKFZ)의 흐름 세포 측정 시설 팀에게 그들의 지원에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1,000 &마이크로; L 필터 팁 | Nerbe plus | 07-693-8300 | |
| 100-1,000 µ L 피펫 | Eppendorf | 3123000063 | |
| 12 mm x 75 mm 튜브, Cell Strainer Cap 포함, 35 µ m 메쉬 기공 크기 | BD Falcon | 352235 | |
| 15 mL 튜브 | BD Falcon | 352096 | |
| 200 µ L 필터 팁 | Nerbe 플러스 | 07-662-8300 | |
| 20-200 &마이크로; L 피펫 | Eppendorf | 3123000055 | |
| 4',6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | 200 µ에서 물에 용해; g/mL 및 부분 표본을 -20 °로 저장합니다. C |
| Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) 항체, RRID: AB_2248011 | BioLegend | 613406 | 1:20 |
| Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 항체, AB_1727414 | BD Pharmingen | 560626 | Dilute 1:20 |
| BD FACSClean solution | BD Biosciences | 340345 | 측정 후 세포분석기 세척 루틴 |
| BD FACSRinse solution | BD Biosciences | 340346 | 측정 후 세포분석기 세척 루틴 |
| Dulbecco' s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182 | 배 농도로 물에 용해 |
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| Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639 | Cell Signaling Technology | #3475 | Dilute 3:200 |
| PIPETBOY acu 2 | Integra Biosciences | 155 016 | |
| 혈청학적 피펫, 10 mL | Corning | 4488 | |
| 혈청학적 피펫, 25 mL | Corning | 4489 | |
| 혈청학적 피펫, 5 mL | Corning | 4487 | |
| SuperKillerTRAIL (modified TNF related apoptosis-inducing ligand) | Biomol | AG-40T-0002-C020 | 세포사멸 양성 대조군 |
| T25 세포 배양 플라스크 | Greiner bio-one | 690160 | 프로토콜에 사용된 예시 세포주를 위한 일상적인 세포 배양 물질 |
| 프로토콜에 사용된 예시 세포주에 대한 일상적인 세포 배양 물질 | |||
| U87 MG 교모세포종 세포 | ATCC | ATCC-HTB-14 | 프로토콜에 사용된 예시 세포주 |
참고문헌
- Jensen, A., et al. Treatment of non-small cell lung cancer with intensity-modulated radiation therapy in combination with cetuximab: the NEAR protocol (NCT00115518). BMC Cancer. 6, 122(2006).
- Oertel, S., et al.
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