방법 논문

뼈 치환 재료의 뼈 성장 및 혈관 혈관 의 평가를 위한 토끼에 있는 뼈 증강의 Calvarial 모형

DOI:

10.3791/59976

⸱

2019년 8월 13일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Fixed Prosthodontics and Biomaterials, Biomaterials Laboratory, University of Geneva, University Clinic of Dental Medicine, 2Department of Surgery, Division of Oral and Maxillofacial Surgery (HUG), Unity of Oral Surgery and Implantology, University of Geneva, University Clinic of Dental Medicine, 3Department of Surgery, Division of Oral and Maxillofacial surgery (HUG), Laboratory of Oral & Maxillofacial Pathology, University of Geneva, University Clinic of Dental Medicine, 4Division of Fixed Prosthodontics and Biomaterials, University of Geneva, University Clinic of Dental Medicine

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서 우리는 뼈 재생 능력의 관점에서 뼈 치환 물질을 평가하는 것을 목표로 토끼에 있는 외과 프로토콜을 제시합니다. 토끼 두개골에 고정된 PEEK 실린더를 사용하여, 골전도, 골연, 골형성 및 물질에 의해 유도된 혈관발생은 살아있는 동물 또는 안락사된 동물상에서 평가될 수 있다.

초록

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토끼 calvarial 모형의 기본적인 원리는 두개골의 피질 부분의 위에 수직으로 새로운 뼈 조직을 성장하는 것입니다. 이 모형은 뼈 성장 및 신생혈관 지원의 관점에서 경구와 두개안면 뼈 재생을 위한 뼈 치환 물자의 평가를 허용합니다. 일단 동물이 마취되고 환기 (endotracheal 삽관) 일단, polyether 에테르 케톤 (PEEK)로 만든 4개의 실린더는 중앙분리대와 관상 봉합사의 양쪽에 두개골에 나사로 조입니다. 각 실린더에 의해 구분된 뼈 영역 내에서 5개의 침구구멍을 뚫어 골수 세포의 유입을 허용합니다. 재료 샘플은 실린더에 배치된 다음 닫힙습니다. 마지막으로, 수술 부위는 봉합되고 동물은 깨어있습니다. 뼈 성장은 현미경 촬영을 사용하여 살아있는 동물에 평가될 수 있습니다. 일단 동물이 안락사되면, 뼈 성장 및 신생혈관은 현미경 단층 촬영, 면역 조직학 및 면역 형광을 사용하여 평가 될 수있다. 재료의 평가에는 최대 표준화 및 교정이 필요하므로 종변 계열 모델이 이상적으로 나타납니다. 접근이 매우 용이하며, 정의된 실린더를 사용하여 교정 및 표준화가 용이하며 4개의 샘플을 동시에 평가할 수 있습니다. 더욱이, 살아있는 단층 촬영은 사용될 수 있고 궁극적으로 안락사되는 동물의 큰 감소가 예상될 수 있다.

서론

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뼈 확대의 calvarial 모형은 경구와 두개안면 외과 도메인에 있는 지도한 뼈 재생 (GBR)의 개념을 낙관하는 것을 목표로 90 년대에 개발되었습니다. 이 모델의 기본 원리는 두개골의 피질 부분 위에 수직으로 새로운 뼈 조직을 성장하는 것입니다. 이를 위해, 반응기(예를 들어, 티타늄-돔, -실린더 또는 -케이지)는 이식편(예를 들어, 하이드로겔, 뼈 대용 등)에 의해 수행된 골 재생을 보호하기 위해 두개골 상에 고정된다. 이 모델의 도움으로, 티타늄 또는 세라믹케이지 1,2,3,4,5,6,GBR 멤브레인7,8,9 ,10,골생성 요인11,12,13,14,15,16,17,새로운 뼈 대체12,16,17,18,19,20,21,22,23 , 24세 , 25개 , 26세 , 27세 , 28세 , 29 또는 골 재생 과정 동안 신생 혈관의메커니즘(30)을 평가했다.

번역 관점에서, 종변선 모델은 턱(31)에서 클래스 IV 결함과 비교될 수 있는1벽 결함을 나타낸다. 목표는 내인성 뼈 벽에서 어떤 측면 지원없이, 피질 영역 위의 새로운 뼈를 성장하는 것입니다. 이 모델은 매우 엄격하고 뼈의 피질 부분에 수직 골전도의 실제 잠재력을 평가합니다. 본 원에 기재된 모델이 주로 골 대용물에서 골전도의 평가에 전념하는 경우, 골형성 및/또는 골형성은 또한 혈관발생1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30.

본질적으로 윤리적, 실용적 및 경제적 이유로, calvarial 모델은 인간32에비해 뼈 대사 및 구조가 매우 관련이있는 토끼에서 개발되었습니다. 위에 인용된 30개의 참고문헌 중 80%는 토끼 칼변리모델1,2,3,4,5,6,7,8을 사용했다. ,9,10,11,12,13,14,15,17,22, 23,26,27,28,29,30,33,따라서이 동물 모델의 관련성을 보여. 2008년, 부센레흐너 그룹은 송아지 모델을 돼지로 옮겼고, 8개의 뼈 대용품을 동시에 20개(토끼와 2개의 뼈 대용품과 비교)를 비교할 수 있도록 하였다. 다른 한편으로는, 우리 그룹은 양에 토끼 calvarial 모형을 옮겼습니다. 간단히 말해서, 티타늄 돔은 새로운 3D 인쇄 뼈 대용품의 골전도를 특성화하기 위해 양 두개골에 배치되었습니다. 이러한 연구를 통해 우리는 종변 모델과 분석16,21을개발하고 마스터 할 수 있었습니다.

마지막 세 연구는인용 16,20,21,함께 여러 다른 조사 와 함께12,17,18,19,22, 23,24,26,27,28,29,스크리닝 및 특성화로 칼변리 모델의 큰 잠재력을 확인 모델. 그러나, 얻은 결과는 매우 만족스러웠지만, 그들은 또한 몇 가지 한계를 지적했다: (1) 티타늄 돔의 사용, 이는 X 선 확산을 방지하고 차례로 라이브 마이크로 CT 사용을. 이들은 조직학 처리의 앞에 제거될 수 없었다, 연구원은 폴리 (메틸 메타크릴레이트) 수지 (PMMA)에 견본을 포함하도록 강요했습니다. 따라서 결과 분석은 주로 지형으로 제한되었습니다. (2) 특히 동물의 비용, 동물의 물류, 유지 보수 및 수술과 관련된 비용으로 인해 높은 재정적 비용. (3) 대형 동물에 대한 윤리적 승인을 얻기위한 어려움.

폴로에 의해 최근 연구, 외.26 크게 토끼에 모델을 향상. 티타늄 돔은 일정한 양의 재료로 채워질 수 있는 클로스식 실린더로 대체되었습니다. 이 실린더 중 4개는 토끼 두개골에 놓여 있었다. 완료되면 실린더를 제거하여 생검이 금속이 없도록 하여 시료 처리와 관련하여 훨씬 더 많은 유연성을 제공합니다. 토끼 calvarial 모델은 낮은 비용, 쉬운 동물 취급 및 샘플 처리의 촉진과 동시 테스트에 대한 매력이되었다. 이러한 최근의 발전을 활용하여 티타늄을 PEEK로 대체하여 실린더를 생산함으로써 X 선 확산및 살아있는 동물에 대한 현미경 촬영을 허용함으로써 모델을 더욱 개선했습니다.

이 기사에서는 마취 및 수술 과정을 설명하고 이 프로토콜, 즉 (면역-) 조직학, 조직학, 라이브 및 생체 내 현미경 검사기구를 사용하여 얻을 수 있는 출력의 예를 보여 주며 뼈의 메커니즘을 평가합니다. 재생 및 뼈 대체 재료에 의해 지원 되는 새로운 뼈 합성을 정량화.

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프로토콜

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스위스 의정서는 스위스 의정서의 승인을 받았으며 주 및 연방 수의학 기관(승인 n° GE/16/16 및 GE/100/18)의 감독을 받았습니다.

1. 특정 장치 및 동물

  1. 실린더
    1. PEEK에서 측면 안정화 탭이 있는 기계 실린더는 내경 5mm, 외경 8mm, 높이5mm(그림 1)입니다.
    2. 실린더 의 상단에 정확하게 클립 할 수 있도록 디자인 기계 PEEK 캡 (두께 1mm).
    3. 수술 전에 오토클레이브를 통해 PEEK 실린더와 캡을 살균합니다.
  2. 나사
    1. 자체 드릴링 마이크로 나사(상업용 순수 티타늄(5등급)로 제작)을 사용하여 실린더(직경 1.2mm, 길이 4mm)를 고정합니다. 수술 전에 오토클레이브에 의해 살균.
  3. 동물
    1. 3개월 된 뉴질랜드 흰 토끼(남성 또는 암컷)를 구입하여 각각 2.5kg의 무게를 측정합니다.
      참고 : 우리는 제네바 대학에서 사육하여 토끼를 얻었다.

2. 수술

  1. 수술 용지함
    1. 메스, 가위, 두 집게, 페리오스텔 엘리베이터, 주사기 (1, 2, 5, 50 mL), 수술 모터, 둥근 수술 용 버스 (직경 0.8 mm), 바늘, 멸균 식염수, 4 개의 실린더, 8 개의 나사 및 드라이버를 준비하십시오.
  2. 전임상 치료
    1. 수술 1주일 전에 동물을 적응시킴.
    2. 매일 예방 항생제를 제공 (5-10 입에 의해 mg/kg (PO)) 시작 2 수술 전에 시간 3 수술 후 일.
  3. 마취 및 삽관
    1. 케타민 (25 mg/kg, 50 mg/mL, 0.5 mL/ kg) + 자일라진 (3 mg/kg, 20 mg/mL, 0.15 mL/ kg)의 근육 내 (IM) 주입으로 동물을 진정시금. 동물이 잠들 때까지 ~20분 기다립니다.
      깊이 (완전한 근육 아토니).
      참고 :이 전투는 간단하고 빠르며 통증이없는 삽관 과정을 허용합니다. 깊은 진통 및 마취는 단계 2.3.8에서 기술한 대로 유도됩니다.
    2. 정맥 (IV) 캐뉼라를 귀에서 한계 정맥에 넣고 삽관이 완료 될 때까지 닫아 두십시오.
      참고 : 이 IV 라인은 깊은 진통 및 마취를 위해 펜타닐과 프로포폴을 각각 침투시키는 역할을 합니다 (단계 2.3.8 참조).
    3. 삽관이 수행 될 때까지 순수 산소에 5 % 세보 플루란을 공급하여 마취를 유지합니다.
      참고 : 이 단계는 동물이 각성의 징후 (눈의 움직임, 근육 수축)를 보여주는 경우에만 필요합니다.
    4. 10% 리도카인을 분사하여 기관을 국소적으로 마취시다. 토끼를 쉬운 위치에 놓고 머리를 수직 확장으로 유지하십시오.
    5. 공기 흐름이 튜브에서 들을 수 있을 때까지 토끼 기관에 작은 직경 (2.5 mm)의 첫번째 endotracheal 관을 밀어 넣습니다. 이것은 후두를 열고 최종 튜브의 삽입을 용이하게합니다.
    6. 튜브에 가이드 (삽관 카테터)를 삽입하여 튜브의 위치를 기관에 고정시십시오. 작은 직경의 튜브를 제거하고 가이드에 최종 endotracheal 튜브 (4.9 mm)를 밀어.
    7. 가이드를 제거하고 엔도트라클 튜브 끝에 있는 풍선을 팽창하여 장치를 기관으로 밀봉하고 차단합니다. 튜브는 제자리에 유지되지만 이마 주위에 묶인 레이스를 사용하여 고정 될 수 있습니다.  순수한 산소로 3% 세보플루란을 가진 동물을 즉시 환기(7 mL/kg, 40/분)로 배출합니다.
    8. 지속적으로 관류 (귀 정맥) 펜타닐 (0.01 mg / mL, 2-4 mL / h) 진통을 유도하기 위해, 2-4 mg / kg의 (2%) 프로포폴 (20 mg /mL, 4-8 mL/h) 마취를 유도, 그리고 4 lL/kg/h의 링거 아세테이트의 아이소 체적 조건을 유지 합니다.
    9. 직장 온도 프로브를 놓습니다. 또한 전체 공정 동안 심장 기능, 온도 및 산소 포화도를 모니터링합니다.
    10. 자율 호흡을 모니터링하여 마취의 깊이를 제어; 동물이 자율 호흡의 징후를 보이면 프로포폴과 펜타닐의 작은 볼러스를 분배하십시오.
  4. 현장 준비
    1. 토끼를 매트리스 패드로 덮은 가열 패드(39°C)에 놓고 수술 테이블에 놓습니다. 두피를 면도하십시오.
    2. 자극과 건조를 피하기 위해 눈에 윤활 젤을 바르십시오. 포비도 요오드 (10 %)로 피부를 문질러 부위를 소독하십시오. 그런 다음 멸균 수술 드레이프와 토끼를 드레이프하고 두개골에 대한 액세스 영역을 잘라.
    3. 포비동 요오드로 수술 부위 소독 (10%) 두 번째로. 자극과 건조를 피하기 위해 눈에 윤활 젤을 바르십시오.
    4. 전체 수술 트레이를 배치할 드레이프 테이블(멸균 드레이프)을 준비합니다.
  5. 수술 부위 개통
    1. 두개골에 리도카인 2 % (1 mL)의 피하 (SC) 주사로 국소적으로 마취.
    2. 칼변리 시상선을 따라 피부(메스)를 통해 절개하고 궤도에서 외부 후두 경각선(길이~4cm)에 이르기까지 절개합니다. 섬막이 절개되었는지 확인하십시오.
    3. 절개 양쪽의 회막(페리오스텔 엘리베이터)을 부드럽게 들어 올레시킵니다. 멸균 식염수로 부위를 헹구어 보시고 자라고 있습니다.
  6. 원통 배치
    1. 두개골의 중앙분리대와 관상 봉합사를 찾습니다(그림2A,B). 이러한 해부학 적 선은 십자가를 형성합니다. 실린더는 십자가에 의해 정의된 각 사분면에 배치되어 실린더의 가장자리가 봉합사위에 있지 않도록 합니다(그림 2C).
    2. 왼쪽 상단 사분면(왼쪽 정면 골격)에 첫 번째 원통을 배치하고 장치를 평평하게 놓습니다. 강한 손 압력으로 위치를 고정하고 저항이 느껴될 때까지 마이크로 나사를 조입니다. 나사 헤드가 실린더 탭의 표면과 플러시되어 있는지 확인합니다.
    3. 다른 탭에서 동일한 절차를 반복하여 실린더를 두개골에 단단히 고정시다. 원통이 뼈에 미수로 고정되어 있는지 확인합니다.
    4. 오른쪽 위 분기 (오른쪽 정면 뼈), 왼쪽 아래 분기 (왼쪽 정수리 뼈) 및 오른쪽 하부 분기 (오른쪽 정수리 뼈)에 절차를 반복합니다.
  7. 실린더에 의해 외주된 영역 내의 5개의 굴착 구멍의 뼈 드릴링(그림1)
    1. 실린더에 의해 외주된 영역의 중앙에 뼈에 둥근 버로 식염수 관개(직경 0.8mm, 깊이 ~1mm)로 굴절구멍을 뚫습니다. 출혈이 나타나는지 확인하십시오.
    2. 원통의 내부 가장자리에 있는 두 개의 탭 나사를 통과하는 축을 따라 두 개의 굴절 구멍을 더 드릴합니다. 수직 도끼를 따라 원통의 안쪽 가장자리에 두 개의 굴절 구멍을 더 뚫습니다. 출혈이 나타나는지 확인하십시오.
    3. 세 개의 다른 실린더 내에서 작업을 반복합니다.
  8. 재료 샘플 및 캡핑으로 실린더 채우기(그림 3)
    1. 제조업체 지침 또는 재료 사양에 따라 원하는 뼈 대체 재료를 준비합니다.
    2. 첫 번째 원통을 테두리에 재료 샘플로 채우고 캡을 끼움으로써 실린더를 닫습니다. 다른 실린더 3개에서 이 과정을 반복합니다.
  9. 수술 부위 폐쇄
    1. 간헐적으로 반응할 수 없는 봉합사로 실린더 위의 피부를 닫습니다.
    2. 상처에 스프레이 드레싱을 바하십시오.

3. 수술 후 치료

  1. 진통 과 마취 (프로포폴 및 펜타닐 관류 체포) 공급을 중지하고 자율 호흡의 회복을 확인합니다.
  2. 동물이 자율 호흡을 회복하면 환기를 중지합니다. 완전한 각성 전에 순수한 산소 하에서 동물을 유지하십시오.
  3. buprenorphine 염산염 SC를 주입 (0.02 mg/ kg, 0.03 mg/mL, 0.67 mL/ kg) 모든 주입을 반복 6 시간 마다 3 수술 후 진통으로 일.
  4. 물과 완전한 먹이로 동물을 평소 하우징으로 옮김하십시오.
  5. 상처 치유의 약 10 일 후에 봉합사를 제거하십시오.

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결과

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본 원에 기재된 모델은 골 치환에서 골전도의 평가에 전념한다. 골형성 및 또는 골대체의 골형성(pre--)세포화 또는 생체활성 분자로 적재된 골형성은 또한 혈관발생 1,2,3,4, 5개 , 6개 , 7명 , 8개 , 9개 , 10개 ,

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토론

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본 명세서에 설명된 모델은 간단하며 모든 단계를 따르고 장비가 적합한 한 매우 쉽게 개발되어야 합니다. 설명된 프로토콜은 외과 적 방법이므로 모든 단계가 중요하고 올바르게 따라야합니다. 특히 토끼 취급 및 마취에서 동물 실험에 대한 교육을받는 것이 중요합니다. 전문 마취전문의와 수의사의 도움을 요청하는 것을 망설이지 마십시오. 봉합사 제거 전후에 동물의 매일 시각적 모니터링을 주장하는 것이 중요합니다. 두개골의 피부가 두껍고 풍부하고 느슨하더라도 실린더의 고정은 큰 긴장을 유발합니다. 봉합사가 너무 일찍 제거되면 상처가 다시 열릴 수 있으며 1 주일 이상의 봉합과 새로운 항생제 치료가 필요합니다. 상처 라인에서 탈의 경우, 외과 의사는 봉합이 가능한지 아닌지 고려해야합니다. 그렇지 않은 경우 샘플 거부를 고려해야 합니다.

프로토콜 섹션에 설명된 중요한 단계 외에도 아래 세부 사항은 이 프로토콜의 적절한 구현에 도움이 될 수 있습니다. 기술적 관점에서, 사용되는 토끼는 젊고 작기 ...

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 가이스트틀리치 AG (울후센, CH)와 골학 재단 (루체른, CH) (그랜트 n ° 18-049)뿐만 아니라 글로벌 D (Brignais, FR)에 빚을지고 나사를 제공합니다. 특히 가이스트틀리히의 B. 셰퍼 박사에게 특별한 감사를 전합니다. 우리는 또한 뛰어난 조직학적 처리와 소중한 조언에 대해 엘리안 더보이스와 클레어 헤르만에게 감사드립니다. 마지막으로, 우리는 자비에 벨린, 실비 룰렛과 Pr Walid Habre의 전체 팀을 따뜻하게 인정, "실험 수술 Dpt", 그들의 놀라운 기술 지원에 대한.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Drugs
Enrofloxacine Baytril 10%Bayer항생제
FentanylBischel진통제를 위한
Ketalar 50mg/mlPfizer케타민 마취를 위한
LidohexBichsel눈을 위한 윤활 젤
OpsiteSmith 및 조카66004978스프레이 가능한 드레싱
포비돈 요오드 10%, 베타딘문디파마항감염제
프로포폴 2%브라운3538710마취용
라피도카인 2%신테티카국소 마취
링거-아세테이트프레제니우스 카비부피 보상
롬푼 2%바이엘마취용 자일라진
Sevoflurane 5%Abbvie마취용
멸균 식염수Sintetica
TemgesicReckitt Benckiser부프레노르핀 염산염, 진통제
Thiopental InresaOspediala마취용
Xylocaine 10% 스프레이Astra Zeneca삽관용
NameCompany카탈로그 번호Comments
Equipment
Fresenius Vial pilot CImexmed주입 펌프
가열 패드하버드 장치
흡입 지배적 인 50Medela
흡입 튜브 OptimusPromedical80342.2
수술 모터Schick 치과큐브골수 구멍 드릴링
환기Maquet Servo1
NameCompany카탈로그 번호 코멘트
Material
Cylinders and capsBoutyplast맞춤형구성: PEEK (폴리 에테르 에테르 케톤)
수동 자체 유지 샤프트GlobalDACT1K
자체 유지 샤프트용 모바일 핸들GlobalDMTM
자체 드릴링 나사GlobalDVA1.2KL4티타늄 grade5, ISO 5832-3
NameCompany카탈로그 번호코멘트
>Surgical tray
Entrocale tube Shiley 직경 2,5mmCovidien86233삽관용
기관내관, Shiley 직경: 4,9mm, Covidien: 107-35G: 삽관용
Ethicon prolene 4-0Ehticon8581H비흡수성 봉합
겸자Marcel BlancBD027R145mm
삽관용 삽관 카테터쿡 의료가이드
바늘 홀더Marcel 블랑BM008R
바늘 BD Microlance3Becton Dickinson300300/30462226G; 18G
PeriostealHU-FriedyP9X
라운드 외과 bursPatterson78000직경 0.8mm, 골수 구멍 드릴링
메스Swann-Mortonn° 10 및 N° 15
가위Marcel Blanc00657180mm
주사기 OmnifixBraun4616057V5ml, 10ml 및 50ml
Venflon G22Braun42690985-01귀 iv 라인용 Vasofix 안전
사

참고문헌

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