2단계 PCR 및 차세대 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 사용한 미생물 분석

요약

여기에 설명된 16S rRNA 메타게놈 시퀀싱 및 자유롭게 사용할 수 있는 도구를 사용하여 분석하는 미생물군유전체 프로파일링을 위한 간소화된 표준 작동 절차입니다. 이 프로토콜은 미생물군유전체 분야를 새로운 연구자뿐만 아니라 더 높은 해상도에서 박테리아 프로파일링을 달성하기 위한 방법에 대한 업데이트를 요구하는 연구자들에게 도움이 될 것입니다.

초록

인간의 창 자 음식 대사 등 생리 기능을 지 워 하는 박테리아의 수조에 의해 식민지화, 에너지 수확, 그리고 면역 체계의 규칙. 건강한 장내 미생물군유전체의 교란은 다발성 경화증(MS)을 포함한 염증성 질환의 발병에 역할을 하는 것으로 제안되었다. 환경 및 유전 적 요인은 미생물군유전체의 조성에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 질병 표현형과 연결된 미생물 군사회의 확인은 건강과 질병에 있는 미생물군유전체의 역할을 정의하는 쪽으로 첫번째 단계가 되었습니다. 세균 성 커뮤니티 프로파일링을 위한 16S rRNA 메타지놈 시퀀싱의 사용은 미생물군유전체 연구를 발전시키는 데 도움이 되었습니다. 그것의 넓은 사용에도 불구하고, 16S rRNA 기지를 둔 분류학 프로파일링 분석을 위한 균일한 프로토콜은 없습니다. 또 다른 한계는 작은 시퀀싱 읽기와 같은 기술적 어려움으로 인한 분류학적 할당의 낮은 해상도뿐만 아니라 역방향(R2) 읽기의 낮은 품질로 인해 최종 분석에서 만 전달(R1)의 사용이 읽힌다. 주어진 생물 표본에서 세균의 다양성을 특성화하기 위해 고해상도로 단순화 된 방법이 필요합니다. 고해상도에서 더 이상 읽기를 순서대로 정렬할 수 있는 시퀀싱 기술의 발전은 이러한 과제를 극복하는 데 도움이 되었습니다. 현재시퀀싱 기술은 R 기반 분열 Amplicon Denoising 알고리즘-2(DADA2)와 같은 공개적으로 이용 가능한 메타지노믹 분석 파이프라인과 결합되어 다다2가 속에서 서열을 할당할 수 있기 때문에 고해상도에서 미생물 프로파일링을 진행하는 데 도움이 되었습니다. 종 수준. 여기서 설명된 것은 16S rRNA 유전자의 V3-V4 영역의 2단계 증폭을 이용하여 세균 프로파일링을 수행하기 위한 가이드이며, 이어서 자유롭게 이용 가능한 분석 도구(즉, DADA2, Phyloseq 및 METAGENassist)를 사용하여 분석한다. 이 간단하고 완전한 워크플로우가 미생물군유전체 프로파일링 연구에 관심이 있는 연구자들을 위한 훌륭한 도구가 될 것으로 믿습니다.

서론

미생물은 특정 환경에 서식하는 미생물(박테리아, 바이러스, 고고학, 박테리오파지 및 곰팡이)의 집합체를 말하며, 미생물군유전체는 상주 미생물의 집단 게놈을 의미한다. 박테리아는 인간과 마우스에 있는 가장 풍부한 세균의 한개이기 때문에, 이 연구 결과는 세균성 프로파일링에만 집중됩니다. 인간의 창 자 박테리아와 세균 균의 수백의 수조에 의해^{식민지화 1.} 정상적인 장내 미생물은 기능 조절(즉, 그대로 장 장벽 유지, 식품 대사, 에너지 항상성, 병원성 유기체에 의한 식민지화 억제) 및 면역 반응의 조절)^2,3,4,5. 창자 미생물의 조성 섭동(gut dysbiosis)은 위장장애^6,비만^7,8,뇌졸중^9,암^10,위장장애 등 다수의 인간 질환과 관련이 있다. 당뇨병

프로토콜

이 프로토콜은 아이오와 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 배설물 샘플 수집 및 취급

1. 70% 에탄올로 디바이더 박스(재료 표, 보충 그림 1참조)를 살균합니다.
2. 샘플 ID 및 처리 그룹(해당하는 경우)과 함께 미세원심분리튜브(마우스당 1개)를 사전 라벨을 붙인다.
3. 생쥐를 멸균된 칸막이 상자에 놓고 최대 1시간 동안 정상적으로 배설할 수 있도록 하십시오.
4. 멸균 집게를 사용하여 미리 표지된 1.5mL 미세원심지 튜브에 배설물 펠릿을 모으고 튜브를 단단히 닫습니다. 각 마우스에서 수집 한 후 집게를 살균하십시오.
5. 배설물 펠릿을 함유한 미세원심분리튜브를 추가 처리될 때까지 -80°C 냉동고에 놓습니다.
   참고: 그들은 한 번에 여러 마우스 (최대 12)에서 배설물 샘플의 동시 수집을 허용하기 때문에 디바이더 상자는 유리하다.

2. DNA 추출

1. 냉동고에서 배설물 샘플(마우스 또는 인간)을 제거하고 실온(RT)에서 해동합니다.
   참고:

결과

MHC 클래스 II 분자(인간HLA)는 적응형 면역 반응의 중심적인 플레이어이며 MS^24,25,26에대한 경향과의 강한 연관성을 나타내고, HLA 클래스 II 분자가 있다고 가설하였다. 장 내 미생물 구성에 영향을 미칠 것 이다. 따라서, MHC 클래스 II 유전자(AE.KO) 또는 발현하는 인간 HLA-DQ8 유전자(HLA-DQ8)가 결여된 마우스는 장내 미생물 군을 형성하는 데 있어 HLA 클래스 II 분자의 중요성을 이해하는 데 활용되었다.

배설물 샘플을 AE.KO(n=16) 및 HLA-DQ8(n=12) 형질전환 마우스로부터 수집하였고, 세균 DNA를 추출하고, 16S rRNA 유전자의 V3-V4 영역을 증폭시켰다. 앰플리톤 크기(550 bp)는 1.5% 아가로즈겔(도 2.......

토론

기재된 프로토콜은 많은 수의 생물표본으로부터 16S rRNA 메타게놈 시퀀싱을 사용하여 미생물군유전체 프로파일링을 수행하기 쉬운 단계로 간단합니다. 차세대 염기서열 분석은 특히 인간 및 전임상 질환 모델^31,32에서미생물 생태학 연구를 변화시켰다. 이 기술의 주요 장점은 높은 처리량 수준과 저렴한 비용^32에서주어진 생물 표본에서 복잡한 미생물 조성물 (배양 및 비 배분 미생물)을 성공적으로 분석 할 수있는 능력입니다. 그러나, 몇몇 요인 (즉, 배치 효력, 16S rRNA 유전자를 위한 프라이머의 선택, 및 서열 데이터 분석)는 이 기술의 광범위한 사용에 있는 중요한 장애물남아 있습니다.

고급 16S rRNA 기반 MiSeq 시퀀싱 기술(2x300bp)^33은 1,500개의 뉴클레오티드 길이의.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.5mL 천연 마이크로 센트리거지 튜브	미국, Scientific	1615-5500	배설물
수집 3M 핸드 어플리케이터 스퀴지 PA1-G	3M, MN, US		PCR 플레이트의 적절한 밀봉을 위한 스퀴거
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter, IN, USA	A63880	PCR 정제, NGS 클린업, PCR 클린업
Agilent DNA 1000 시약	Agilent Technologies, CA, USA	5067-1504	DNA 정량화 및 품질 관리
Bioanalyzer DNA 1000 chip	Agilent Technologies, CA, USA	5067-1504	DNA 정량화 및 품질 관리
Index Adopter Replacement Caps	Illumina, Inc., CA, USA	15026762	Index 1 및 2 Adopter 프라이머용 새로운 캡
DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit	MoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA	12855-100	DNA 절연
KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2x)	Kapa Biosystem, MA, USA	KK2602	PCR 레디 믹스 Amplicon PCR1 및 Indexed PCR2
Lewis Divider Boxes	Lewis Bins, WI, US	ND03080	배설
수집 마그네틱 스탠드	New England BioLabs, MA, USA	S1509S	PCR 클린업
MicroAmp Fast Optical 96-Well 반응 플레이트	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA	4346906	PCR 플레이트
마이크로앰프 광학 접착 필름	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, 캘리포니아, 미국	4311971	PCR 플레이트 씰러
마이크로퓨지 20 원심분리기	Beckman Coulter, IN, USA	B30154	DNA 분리에 사용되는 원심분리기
MiSeq 시약 키트(600 사이클)v.3	Illumina, Inc., CA, USA	MS-102-3003	MiSeq 염기서열분석
Nextera XT DNA Library Preparation Kit	Illumina, Inc., CA, USA	FC-131-1001	16S rRNA DNA Library Preparation
Reagent Reservoirs Multichannel Trays	ASI, FL,USA	RS71-1	PCR2 제품
Plate Cetrifuge	Thermo Fisher Scientific, CA, USA	75004393	PCR 시약 혼합 및 Plate
PhiX Control에서 기포 제거	Illumina, Inc., CA, USA	FC-110-3001	MiSeq 염기서열분석 제어
마이크로바이옴 DNA 정제 키트	Thermo Fisher Scientific, CA, USA	A29789	PCR1 제품 정제용
PowerLyzer 24 Homogenizer	Omni International, GA, USA	19-001	DNA 분리용 비드 비터
Qubit dsDNA HS(고감도) 분석 키트	Thermo Fisher Scientific, CA, USA	Q32854	DNA 정량화
TruSeq 인덱스 플레이트 고정 장치	Illumina, Inc., CA, USA	FC-130-1005	인덱스 프라이머 배열용
수직 분배기(대)	Lewis Bins, WI, US	DV-2280	배설물 수집
수직 분배기(소)	Lewis Bins, WI, US,	DV-1780	배설물 수집