수정된 비봉합사 커프 기술을 사용한 뮤린 자궁 경부 대동맥 이식 모델

요약

여기서, 우리는 자궁 경부 뮤린 모델에서 비 봉합술 커프 기술을 사용하여 마우스에서 이종성 대동맥 이식의 프로토콜을 제시한다. 이 모형은 만성 동종 이식 혈관병증 (CAV)의 근본적인 병리를 공부하기 위하여 이용될 수 있고 그것의 대형을 방지하기 위하여 새로운 치료에이전트를 평가하는 것을 도울 수 있습니다.

초록

강력한 면역 억제 프로토콜의 도입으로 급성 거부 에피소드의 예방 및 치료에서 뚜렷한 발전이 가능합니다. 그러나, 이식 된 고체 장기의 장기 결과에 있는 사소한 개선만 지난 십년간 내내 관찰될 수 있었습니다. 이러한 맥락에서, 만성 동종 이식 혈관 병증 (CAV)은 여전히 심장, 신장 및 폐 이식에서 후기 장기 실패의 주요 원인을 나타냅니다.

지금까지 CAV 발달의 근본적인 병인은 불분명하게 남아, 효과적인 처리 전략이 현재 누락되는 이유를 설명하고 근본적인 병리생리학을 공부하기 위하여 관련 실험 적인 모형을 위한 필요를 강조하 CAV 형성. 다음 프로토콜은 변형된 비봉합사 커프 기술을 사용하여 뮤린 이종 자궁 경부 대동맥 이식 모델을 기술한다. 이 기술에서는 흉부 대동맥의 세그먼트가 오른쪽 일반적인 경동맥에 편치됩니다. 비 봉합소 커프 기술을 사용하여 쉽게 배우고 재현 할 수있는 모델을 확립하여 봉합 된 혈관 미세 해부학의 가능한 이질성을 최소화 할 수 있습니다.

서론

지난 6 년간, 고체 기관 이식은 말기 기관 실패의 처리를 위한 배려의 표준에 실험적인 절차에서 발전했습니다^1. 항균제의 개선, 외과 적 기술 및 면역 억제 연대의 발전으로 인해 고체 장기 이식의 초기 성공률은 지난 수십 년 동안 크게 증가했습니다^2.

그러나, 장기 이식 생존율은 동일한 방식으로 유의적으로 개선되지 않았다^3. CAV의 발달은 장기 생존을 제한하는 주요^{요인이다4,5,6}. 이 병리학은 평활근 세포로 구성된 동심 신생 층의 형성을 특징으로하며, 혈관의 점진적 협착과 이식 된 고체 장기의 연속적인 악성 주입을 초래합니다. 심장 이식 수령인에서, CAV 병변은 환자의 75%까지 에서 진단될 수 있습니다 3 이식 후에 년^7.

CAV의 병리생리학은 아직 완전히 이해되지 않았습니다. 수많은 면역학 및 비면역학적 인자와 관련이 있는 것으로 보이며, 후속 내피 활성화 및 기능 장애와 함께 내피 손상을^{초래하는 8.} 지금까지 CAV의 형성 및 잠재적 치료를 연구하기 위해 재현 가능한 작은 동물 모델의 필요성을 강조하면서 CAV의 예방을 위한 인과 적 치료 옵션이 존재하지 않습니다.

뮤린 대동맥 이식 모델의 사용으로, 병변 과 같은 CAV는 이식 후 4 주 볼 수 있습니다. 그 병변은 주로 혈관 평활근 세포로 구성되어 인간의 병리학을 닮습니다. 다양한 형질전환 및 마우스 노크로 인해 이식 관련 병리학에서 마우스 모델을 사용하면 새로운 치료 옵션을 식별하고 발달을 이해할 수있는 독특한 기회를 제공합니다. 그러나 이식된 혈관의 작은 직경으로 인해 마우스 모델의 사용은 일반적으로 긴 학습 곡선 및 초기 높은 합병증 비율^9와관련이 있습니다. 비 봉합사 커프 기술의 도입으로, 이 가장 어려운 작업 부분은 촉진 될 수 있으며 해부학의 직경은^{일정하게 10,11로}유지됩니다.

프로토콜

모든 실험은 독일 동물 복지법(TierSchG)의 지침에 따라 수행되었습니다. (AZ: 55.2-1-54-2532.Vet_02-80-2015).

1. 동물 주택

1. 실험의 경우, 수컷 C57BL/6 및 BALB/c 마우스를 C57BL/6 마우스로 20-25g의 무게를 가진 마우스를 기증자 동물로 사용하십시오.
2. 건강 모니터링을 위한 FELASA 지침에 따라 병원균이 없는 장벽 시설에서 동물과 집을^{구입한다 12.}
3. 농축 중첩 재료와 표준 Makrolon 케이지에 마우스를 유지합니다. 12 시간의 주야간 주기로 물과 펠릿 식품에 대한 광고 리비텀 액세스를 제공합니다.
4. 실온을 22±2°C로 유지하고 상대 습도를 55±5%로 유지합니다.

2. 수령인 준비

1. 첫째, 수령인 동물 (C57BL / 6)을 미다졸람 (5 mg / kg; 5 mg / mL), 메데토 미딘 (0.5 mg / kg; 1 mg / mL) 및 펜타닐 (0.05 mg / kg; 0.05 mg / mL)의 복강 내 주사로 마취하십시오.
   참고 : 마취의 정확한 깊이는 5-10 분 안에 도달해야합니다.
   1. 마취의 깊이를 확인하기 위해 반사 신경을 확인하기 위해 집게로 뒷발을 꼬집습니다.
2. 작은 동물을위한 전기 헤어 클리퍼로 자궁 경부 측면 영역의 모든 머리카락을 잘라 내고 시술 중에 눈이 건조하지 않도록 면봉으로 안과 연고를 바하십시오.
3. 동물을 현미경 아래 의 가열 패드에 supine 위치에 놓고 피부에 민감한 석고 스트립으로 수술대에 다리를 부드럽게 테이프로 채우십시오.
4. 머리를 뒤로 젖게 하고 수술장을 알코올로 여러 번 문지하십시오.
5. 작은 가위로 경막 절개에서 오른쪽 하악하수로 피부를 절개합니다.
6. 혈관 혈통의 양극성 소작을 통해 하악골선의 오른쪽 하엽을 제거하고 미세시저로 후속 절제하십시오.
7. 상부 및 하부의 양극성 소작을 통해 오른쪽 sternocleidomastoid 근육을 제거하고 일반적인 경동맥에 대한 액세스를 얻기 위해 미세 시저로 후속 절제.
8. 일반적인 경동맥을 미세 한 집게로 주변 결합 조직을 분리하여 가능한 한 멀리 경질및 근접으로 동원하십시오.
9. 일반적인 경동맥의 중간 주위의 각 사이의 최소 거리로 두 개의 7-0 실크 합자를 묶고 합자 사이의 미세 한 미세 미세 로 일반적인 경동맥을 트랜스.
10. 커프를 통해 근위, 결찰 끝을 전달하고 작은 동맥 클램프로 고정합니다.
    참고 : 이 절차에 사용된 커프스는 0.610 mm의 외경과 0.0254 mm의 벽 두께를 가진 폴리이미드 튜브의 마이크로매저로 절단되었습니다. 완성 된 커프스는 커프 프로세스에 사용되는 절반 ~ ~ 2mm의 길이를 가지고 있었고, 전체 실린더와 다른 절반은 고정되어 반 실린더가되었습니다.
11. 합자에 가깝게 미세 한 미세 매기로 합자를 제거하고 혈관 벽을 손상시키지 않도록주의하면서 30G 바늘로 헤파린 식염수 (50 IU / mL)로 루멘을 플러시하십시오.
12. 미세 혈관 확장기를 사용하여 오픈 루멘을 해체하고 폴리이미드 튜브 위로 부드럽게 당겨 서커 위에 경동맥 그루터기를 적당히 합니다.
13. 느슨하게 미리 묶인 7-0 실크 루프로 적의 경동맥을 즉시 수정하십시오.
    참고 : 느슨하게 사전 넥타이 4 7-0 실크 루프는 수술 전에 약 1.5 mm의 직경을 통해 커프 스프로시프를 부드럽고 쉽게 만듭니다.
14. 경동맥의 다른 쪽 끝에서 동일한 절차 (2.10-2.13)를 수행하십시오.
15. 수령인 동물을 옆으로 설정하고 대동맥 분절이 이식될 때까지 식염수로 수술장을 보습합니다.

3. 기증자 운영

1. 기증자 마우스(BALB/c)를 수취인 동물과 동일한 방식으로 마취시보합니다.
   1. 충분한 마취를 확인하기 위해 반사 신경을 확인하기 위해 집게로 뒷발을 꼬집습니다.
2. 작은 동물을위한 전기 헤어 클리퍼로 복부와 흉부 부위의 모든 머리카락을 잘라내고 시술 중에 눈이 마르지 않도록 면봉으로 안과 연고를 바하십시오.
3. 동물을 현미경 아래 의 가열 패드에 supine 위치에 놓고 피부에 민감한 석고 스트립으로 수술대에 다리를 부드럽게 테이프로 채우십시오.
4. 알코올로 수술 장을 여러 번 문지하십시오.
5. 작은 가위로 중간 선 복부 개복술을 수행하고 열등한 정맥 (IVC)을 노출하기 위해 약간 위쪽으로 내장을 밀어.
6. 30G 바늘을 사용하여 1 mL의 헤파린식 식염수로 열등한 정맥 (IVC)을 주입하십시오.
7. 작은 가위로 신장 동맥 아래에 복부 대동맥과 IVC를 잘라 기증자 동물을 추방합니다. 느슨하게 혈액을 흡수하기 위해 복부에 압축을 놓습니다.
8. 가위로 갈비뼈의 양측 전환에서 흉부 절제술을 수행하고 수술 용 클램프로 앞쪽 흉벽을 두개골로 기울여 매질에 노출시보입니다.
9. IVC와 식도를 마이크로시저로 다이어프램 바로 위에 자른다.
10. 절단 된 IVC / 식도를 들고 집게로 위로 기울어 심장과 폐를 제거한 다음 등쪽 매개체의 흉부 대흉에 액세스하기 위해 기지에서 미세 토저로 절제하십시오.
11. 주변 조직에서 흉부 대동맥을 주위 결합 조직과 지방을 미세 한 집게로 떼어 내어 주위 조직으로부터 동원하면서 늑간 동맥을 손상시키지 않도록주의하십시오.
12. 양극성 소작 집게로 흉부 대동맥의 모든 가지를 소작하고 마이크로시저를 사용하여 횡격막과 대동맥 아치 사이의 대동맥 세그먼트를 절제합니다.
13. 30G 바늘로 헤파린화 된 식염수로 절제 된 대동맥 부분을 씻어 내고 혈관 벽을 손상시키지 않도록주의하면서 남은 혈액이나 혈전을 제거하고 이식편을 받는 동물에게 옮니다.
    참고: 대동맥 이식편을 이식 중에 받는 사람 오른쪽에 배치합니다. 수용자 동물에서 접목의 다른 끝을 혼동하는 문제가 있는 경우, 말단 주위의 느슨한 합자가 도움이 될 수 있습니다.

4. 이식

1. 기증자 대동맥 의 근위쪽 끝을 미세 한 집게로 적당히 경동맥 위에 밀어 붙이고 느슨하게 미리 묶인 7-0 실크 루프로 즉시 고정하십시오.
2. 접목 길이가 두 커프사이의 거리에 맞을 수 있도록 대동맥 이식의 말단, 자유 끝을 마이크로시저로 다듬습니다.
3. 대반의 다른 쪽 끝에서 4.1 단계를 다른 커프와 반복하여 해부학을 완료합니다.
4. 역행 관류를 허용하기 위해 말위 클램프를 제거합니다.
5. 지혈을 달성 한 후 근위 클램프를 제거하여 해부학을 완료하십시오.
6. 마지막으로, 6-0 연속 봉합사로 상처를 닫습니다.

5. 수술 후 치료

1. 수술 후 처음 6시간 동안 마우스를 면밀히 모니터링한 다음 이식 후 첫 72시간 동안 하루에 여러 번 마우스를 모니터링하여 합병증을 즉시 감지합니다.
2. 수술 후 진통의 경우 이식 된 마우스를 이식 후 직접 피하 (0.05-0.1 mg/kg)로 주입한 다음 72 시간 마다 적절한 장기 진통을 제공합니다.

6. 대동맥 이식 설명

1. 이식된 동물을 미다졸람(5 mg/kg; 5 mg/mL), 메데토미딘(0.5 mg/kg; 1 mg/mL) 및 펜타닐(0.05 mg/kg; 0.05 mg/mL) 이식 후 4주 후에 이식한 동물을 마취시킵니다.
   1. 충분한 마취를 확인하기 위해 반사 신경을 확인하기 위해 집게로 뒷발을 꼬집습니다.
2. 작은 동물을위한 전기 헤어 클리퍼와 복부, 흉부 및 자궁 경부의 모든 머리를 클립.
3. 동물을 현미경 아래 의 가열 패드에 supine 위치에 놓고 피부에 민감한 석고 스트립으로 수술대에 다리를 부드럽게 테이프로 채우십시오.
4. 알코올로 수술 장을 여러 번 문지하십시오.
5. 작은 가위로 중간 선 복부 개복술을 수행하고 열등한 정맥 (IVC)을 노출하기 위해 약간 위쪽으로 내장을 밀어.
6. 30G 바늘을 사용하여 1 mL의 헤파린식 식염수로 열등한 정맥 (IVC)을 주입하십시오.
7. 작은 가위로 신장 동맥 아래에 복부 대동맥과 IVC를 잘라 기증자 동물을 추방합니다. 느슨하게 혈액을 흡수하기 위해 복부에 압축을 놓습니다.
8. 이식 시술 중에 만든 피부 절개에 해당하는 작은 가위로 경막 절개에서 오른쪽 하악하수로 피부 절개를 합니다.
9. 이식된 대동맥 이식편을 말단 및 근위 커프와 함께 식별하고 집게로 주변 조직을 무딘 제거합니다.
10. microscisorsors를 사용하여, 두 개의 커프스 끝과 함께 대동맥 이식편을 내파하기 위해 소맷부리와 대동맥 이식편으로 일반적인 경동맥 말단및 근접을 잘라냅니다.
11. 대동맥 세그먼트를 반으로 자르고 추가 분석을 위해 시편을 보존합니다 (냉동 단면, 파라핀 임베디드 섹션, 스냅 냉동 재료)^13,14.

결과

완전 MHC-미스매치 이식 모델에서, 동심 신생층은 이식 후 4주 후에 볼 수있다(도 2). 이 층은 주로 SM22(성숙한 혈관 평활근 세포에 대한 선택적 마커)에 대한 면역조직학적 염색으로서 혈관 평활근 세포로 구성된다. 앞서 언급한 바와 같이, 이들 혈관 평활근 세포는 만성 동종 이식 혈관병증에서 보이는 병변에 대한 병변에 대한 병리현상이다. 추가 분석을 위해 대동맥 세그먼트는 Elastica van Gieson 염색으로 단면화되고 염색되어야 합니다. 여기서, 신인티마 층은 투니카 매체로부터 투니카 인티마를 분할하는 내부 탄성 멤브레인의 탄성 섬유로 쉽게 분화될 수 있다.

이 모델에서 잠재적인 치료 효과를 평가하기 위해, neointima-media 비뿐만 아니라 광단 단면적 좁히는, 그 단면 샘플^13,

토론

만성 동종 이식 혈관 병증은 심장의 고체 장기 이식 후 후기 이식 손실의 주요 원인이며 신장 및 폐 동종 이식 가능성이^8. 지금까지, CAV의 형성을 방지하기 위해 인과 치료 식이요법이 개발될 수 없었다.

CAV의 병리생리학은 다인성이며 면역학 및 비면역학적 측면을^{수반한다 16.} 이식에 설치류 모형의 사용은 고체 기관 이식에 있는 동종 이식 거부 프로세스의 근본적인 병리생리학이해에서 필수적이고 거부를 방지하는 새로운 치료 접근을 확인하는 것을 도왔습니다¹⁷ . CAV는 혈관 평활근 세포로 구성된 신형성층의 형성을 특징으로 하며, 이는 장기^기능의후속 악화와 함께 이식된 기관의 혈관및 악성화의 연속적인 협착으로 이어지는 7.

기재된 뮤린 대동맥 이식 모델에서, 동심...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Balb-c Mice (H2-d)	Charles River	Strain# 028	기증자 동물
양극성 소작 시스템	ERBE	ICC 50 / 20195-023	양극성 소작
C57BL/6J (H-2b)	Charles River	Strain# 027	수용자 동물
Halsey 바늘 홀더	FST	12501-12	바늘 홀더
Halsted-Mosquito Forceps	AESCULAP	BH111R	곡선 클램프
의료 폴리이 미드 튜빙	Nordson MEDICAL	141-0031	커프 재질
Micro Serrefines	FST	18055-04	마이크로 용기 클립
마이크로 애드슨 집게 (톱니 모양)	FST	11018-12	표준 집게
마이크로 Serrefine 클램프 적용 집게	FST	18057-14	클립 애플리케이터
에스& T 집게 - SuperGrip 팁(각도 45도)	에스& T	00649-11	파인 펜치
S & T Vessel 확장 펜치 - 각도 10° (팁 직경 0.2 mm)	에스& T	00125-11	Vesseldilatator
Schott VisiLED 세트	Schott	MC 1500 / S80-55	광
입체 현미경	ZEISS	SteREO Discovery.V8	현미경
학생 미세 가위 / 수술 용 가위 - Sharp-Blunt	FST	91460-11 / 14001-12	표준 Sissors
Vannas-T ü bingen 스프링 가위 (곡선, 8.5cm)	FST	15004-08	Microsissors (curved)
Vannas-Tü bingen 스프링 가위 (스트레이트, 8.5 cm)	FST	15003-08	Microsissors (스트레이트)