방법 논문

질병 관련 유전자의 발현을 조사하는 도구로 타우 세포 국소화의 변조

DOI:

10.3791/59988

⸱

2019년 12월 20일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biology, BIO@SNS, Scuola Normale Superiore

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

타우는 세포질과 미세관을 결합하는 핵에 모두 존재하는 신경 단백질로 알츠하이머 병 관련 유전자의 변조를 포함한 틀에 얽매이지 않는 기능을 발휘합니다. 여기서, 우리는 세포질 타우에서 오는 간섭을 배제하면서 핵타우의 기능을 조사하는 방법을 설명한다.

초록

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타우는 뉴런에서 발현되는 미세소관 결합 단백질이며, 그 주요 알려진 기능은 세포골격 안정성의 유지와 관련이 있다. 그러나, 최근의 증거는 타우가 DNA 보호, rRNA 전사, 레트로 트랜스포손의 이동성 및 구조 적 조직에 연루된 핵을 포함한 다른 세포 외 구획에도 존재한다는 것을 나타냈다. 핵균. 우리는 최근에 핵 타우가 VGluT1 유전자의 발현에 관여한다는 것을 보여주었습니다, 알츠하이머 병의 초기 단계에서 조미료 방출의 병리학적 증가를 설명할 수 있는 분자 기계장치를 건의하. 최근까지, 표적 유전자의 발현을 조절하는 핵타우의 개입은 세포질 타우의 기여의 배제 또는 다른 그 효과의 배제를 방지하는 기술적 한계로 인해 상대적으로 불확실하고 모호하게 되어 왔다. 핵 타우와 관련이없는 다운 스트림 요인. 이러한 불확실성을 극복하기 위해, 우리는 핵타우 단백질에 의해 특이적인 변조된 표적 유전자의 발현을 연구하는 방법을 개발하였다. 우리는 세포화 신호와 세포분열의 사용을 결합하는 프로토콜을 채택하여 세포질 타우 분자로부터의 간섭을 배제할 수 있게 했습니다. 가장 주목할 만한, 프로토콜은 쉽고 다른 세포 유형 및 세포 조건에서 Tau의 핵 기능을 연구하기 위해 광범위하게 적용 가능한 고전적이고 신뢰할 수있는 방법으로 구성됩니다.

서론

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핵에서 타우 단백질의 기능은 핵산1,2,3,4,5,6과밀접하게 연관되어 있는 것으로 나타났기 때문에 최근 몇 년 동안 상당한 관심을 얻고 있다. 실제로, 최근 게놈 전체 연구는 타우가 생체 내에서 genic 및 intergenic DNA 서열을 결합한다는 것을 보여주었습니다7. 뉴클레올라 조직에서의 역할은8,9,10,11로제안되었다. 더욱이, 타우는 산화 및 고열 스트레스5,10,12,13,돌연변이 타우가 염색체 불안정성 및 이수성 및 이수성14,15,16에연결되는 반면, 산성 및 고열 스트레스로부터 DNA 보호에 관여하는 것으로 제안되었다.

지금까지 핵구획에서 타우의 기능을 연구하는 과제는 세포질 타우의 기여에서 핵타우의 구체적인 기여를 해부하는 어려움으로 인해 거의 해결되지 않았다. 더욱이, 핵 구획에 있는 타우 분자에 기인하는 기능은, 지금까지, 핵 타우 단백질의 직접적인 관여의 명백한 데모가 결여되기 때문에, 단지 상관관계가 있습니다. 실제로, 타우가 레트로트랜스포손의 이동성 또는 rRNA 전사 또는 DNA 보호에 11,12,17,18,19의 관여는 또한 세포질 타우의 기여 또는 핵 타우와 관련이 없는 다른 다운스트림 요인의 효과에 의해 설명될 수 있다.

여기서, 우리는 핵국극화(NLS) 또는 핵수출신호(NES)로 태그된 타우컨스0N4R의 사용과 결합된 핵구획을 분리하는 고전적인 절차를 이용하여 이 문제를 해결할 수 있는 방법을 제공한다. 이 접근법은 세포질 구획에서 타우 분자의 유출로 인해 가능한 유물과 관련된 복잡한 문제를 제거합니다. 더욱이, 타우-NLS 및 타우-NES 구성은 핵 구획에서 타우 분자의 농축 또는 배제를 유도하고, 특정 기능에서 핵 타우 분자의 개입에 대한 긍정적 및 음성 적 제어를 제공한다. 이 프로토콜은 기술적으로 용이하고 타우발현(20,21)을재활성화시키는 암세포와 같은 다른 세포 유형에서 타우의 핵기능을 연구하기 위해 광범위하게 적용가능한 고전적이고 신뢰할 수 있는 방법으로 구성된다. 더욱이, 그것은 다른 구획에 관련되었던 생물학 기능을 해부하기 위하여 세포질 및 핵 둘 다에 존재하는 그밖 단백질에도 적용될 수 있습니다.

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프로토콜

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1. 세포 배양

  1. 배양 SH-SY5Y 세포(인간 신경아세포종 세포주, CRL-2266) 완전한 배지(덜베코의 변형된 이글 배지:영양 혼합물 F12 [DMEM/F-12]를 10% 태아 소 혈청[FBS], 2 mML-글루타민, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신으로 보충하였다. 37 °C 및 5 %CO2에서인큐베이터에서 세포를 유지합니다. 10cm 접시에 세포를 성장하고 수렴 할 때 분할.

2. 세포 분화

  1. SH-SY5Y 세포를 분화하기 위해 도금 다음날, 10 μM 레티노산(RA)을 첨가하여 5일 동안 배지를 완성합니다.
  2. 6일째는 50 ng/mL BDNF, 2 mM L-글루타민으로 보충된 DMEM/F-12를 분화 배지로 대체합니다. FBS 나 항생제를 추가하지 마십시오.
  3. 세포를 분화 배지에서 3일 동안 성장시다.

3. 키메라 구조물 복제

  1. 타우서열 0N4R(383aa)의 3' 말단에서 프레임에 제한 효소 소화에 의해 복제하여 타우-NLS 구성을 생성하여 3xNLS(SV40NLS):5'-CCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
    참고: 타우의 3' 끝에 있는 3xNLS는 XhoI 및 BamHI 제한 사이트를 멀티클로닝 사이트(MCS)로 악용하는 포유류 표현을 위해 pCMV-Tau 플라스미드로 복제됩니다.
  2. NES 서열의 3' 끝 부분의 프레임에서 제한 효소 소화에 의해 복제하여 타우-NES 구성을 생성한다: 5'-AGTGAGCTGCAGAACAAGAGAGAGAGATTGGGT박귀액타카-3'.
    참고: 타우의 3' 끝에 있는 NES는 에코리 및 밤히 제한 사이트를 MCS로 악용하는 포유류 표현을 위해 pCMV-타우 플라스미드로 복제된다.
  3. 3.1 단계 또는 3.2 단계에서 DNA 100 ng로 DH5alpha 대장균 균주를 변형시키고 LB-Agar 플레이트에서 100 mg / mL 암피실린으로 플레이트 세포를 변형시킵니다. 37 °C에서 하룻밤 자라게하십시오.
  4. 단일 식민지를 선택하고 암피실린으로 LB의 5 mL로 세포를 스파이크. 세포가 밤새 교반에서 37 °C에서 성장하게하십시오.
  5. DNA 미니프렙(물자표)을사용하여 플라스미드를 추출하고 시열을 확인하여 시공을 확인하였다.
  6. 암피실린으로 LB-Agar 플레이트에서 확인된 구성물 및 플레이트 셀로 DH5alpha E. 대장균 균주를 변환합니다. 37 °C에서 하룻밤 자라게하십시오.
  7. 단일 식민지를 선택하고 암피실린으로 LB의 5 mL로 세포를 스파이크. 세포가 2 시간 동안 교반에서 37 °C에서 자라게하십시오.
  8. 암피실린을 가진 LB의 200 mL에 단계 3.7에서 세포를 넣습니다. 37 °C에서 하룻밤 자라게하십시오.
  9. 4 °C에서 10 분 동안 3,500 x g에서 세포를 펠렛.
  10. 추출 플라스미드와 DNA 맥시프렙(재료표).

4. 세포 감염

  1. 종자 400,000 세포는 6 웰 플레이트에서 1.1 단계 또는 8 웰 챔버 슬라이드에서 20,000 셀. 플레이트 4개의 샘플: 제어 세포는 빈 벡터로 형질감염되고, 세포는 태그가 지정되지 않은 타우로 형질전환되고, 세포는 타우-NLS로 형질감염되고 세포는 타우-NES로 형질감염된다.
  2. 제조자의 지시에 따라, 8웰 챔버 슬라이드에 대해 각 웰 플레이트또는 200 ng의 DNA를 6웰 플레이트에 사용하여 각 웰에 대한 DNA의 트랜스펙트 400 ng를 파종한 다음날.
    1. RT에서 5분 동안 감소된 혈청 배지의 DNA와 양이온 지질을 250 μL(6-well 플레이트의 경우) 또는 25 μL(8웰 챔버 슬라이드의 경우)으로 별도로 배양합니다. 그런 다음 이를 결합하여 DNA-지질 복합체를 생성하고 20분 동안 배양한다.
    2. 배양 배지를 신선한 완전한 배양 배지의 2 mL(6-웰 플레이트용) 또는 250 μL(8-well 챔버 슬라이드용)으로 교체합니다. DNA-지질 복합체를 세포에 추가하고 밤새 37°C에서 배양한다.
  3. 대안적으로, 양이온성 시약폴리에틸렌민(PEI)을 가진 트랜스펙트 DNA.
    1. DNA 2 μg와 PEI 6 μL을 완전한 배양 배지 200 μL(6웰 플레이트의 각 우물에 대해), DNA 1 μg, PEI 3 μL과 완전한 배양 배지 100 μL(8웰 챔버 슬라이드의 각 우물)과 혼합하십시오. , RT에서 10 분 동안 소용돌이및 배양.
    2. 혼합물을 세포에 첨가하고 도금 부피에 도달하기 위해 8웰 챔버 슬라이드에서 웰 당 6웰 플레이트 또는 150 μL의 완전한 배양 배지에 웰당 1.8 mL의 완전한 배양 배지를 추가한다.
  4. 형질전환 후 다음날 배지를 변경하고 2.2단계에서 설명한 바와 같이 분화 매체를 추가한다.

5. 면역 형광

  1. 배양 배지를 제거하고 1x PBS로 세포를 헹구다. 100% 얼음 차가운 메탄올로 세포를 흔들지 않고 3분 동안 고정시다. 고정 용액을 제거하고 1x PBS로 간략하게 씻으소서.
  2. 실온(RT)에서 5분 동안 1x PBS에서 0.1% 비이온 계면활성제로 투과합니다. 간단히, 1 x PBS로 씻어, 3 번.
  3. 차단 버퍼 (0.1 % 트웬20 및 PBS에서 1 % BSA)로 세포를 인큐베이션하여 궤도 셰이커에서 RT에서 30 분 동안 배양합니다.
  4. 적절한 1차 항체(예를 들어, 마우스 단일클론 항-Tau13 항체)로 배양하여 궤도 셰이커상에서 4°C에서 하룻밤 동안 차단 완충액에서 1:500을 희석하였다. 항체 용액을 제거하고 1x PBS로 간단히 씻으하십시오.
  5. 불소로 공액된 이차 항체(예를 들어, 염소 항마우스 항체가 알렉사 플루어 633에 공액화됨)를 RT에서 1시간 동안 차단 완충액에서 1:500 희석한 이차 항체와 배양하고 1x PBS로 3회 간음하였다.
  6. 핵을 염색하기 위해, DAPI로 배양하여 RT. 워시에서 10분 동안 차단 완충액에서 1:20,000을 1x PBS로 3회 세척하였다. 안티페이드 장착 매체를 사용하여 슬라이드에 덮개를 장착합니다.

6. 웨스턴 블롯

  1. 4.4단계에서 세포 펠릿을 수집하려면, 배지를 제거하고, PBS로 세포를 세척한다. 37°C에서 4분 동안 0.1% 트립신의 500 μL로 배양한다. 완전한 배지 및 재일시 중단 셀의 동일한 볼륨을 추가합니다.
  2. 5 분 동안 500 x g에서 튜브와 원심 분리기에 세포를 수집합니다. 원심 분리의 끝에서 조심스럽게 상한을 제거합니다. PBS 1 mL, 원심 분리기를 5 분 동안 500 x g에 넣고 조심스럽게 상류를 제거하십시오. 세포 펠릿을 얼음에 저장하여 즉시 사용하거나 -80°C에서 동결하여 장기간 보관하십시오.
  3. 총 단백질 추출물의 경우, 용해 완충액 (20 mM Tris-HCl pH 8, 20 mM NaCl, 10 % 글리세롤, 1 % 옥틸플레네옥시 폴리 (에틸렌 옥시)에탄올, 분지(재료 표),10 mM EDTA)로 보충 된 용해 완충액에서 얼음에 30 분 동안 세포 펠릿을 배양하십시오. 펠릿의 풍부에 따르면, 용해 완충제의 50 μL ~ 100 μL을 사용하십시오.
    1. 추출물을 15분 동안 16,000 x g에서 원심분리합니다. 20 μg의 단백질과 4x Laemmli 완충액의 5 μL을 총 부피에서 혼합하고 100 °C에서 5 분 동안 끓여 SDS-PAGE용 단백질 샘플을 준비합니다.
      참고: 샘플은 -20°C에서 보관할 수 있다.
  4. 세포내 분획의 경우, 완전한 배지에서 6.2단계에서 세포를 재중단하고 각 샘플당 1 x 106셀을 수집합니다. 500 x g에서 10 분 동안 원심 분리기를 사용하여 다음 단계에 대한 세포 펠릿을 얻었다.
    1. 세포내 구획을 분리하려면 키트 사양에 따라 분별합니다. 각 분획을 분리하기 위해, 6.4 단계에서 세포 펠렛을 해당 완충액, 원심분리기로 인큐베이션하고 상온자를 수집하고 6.4.1.1-6.4.1.5에 기재된 대로 펠릿에 다음 버퍼를 추가합니다. 세포질 추출 버퍼, 멤브레인 추출 버퍼, 핵 추출 버퍼, 핵 추출 버퍼 5 mM CaCl2 및 3 U/μL 마이크로 코칼 뉴클레아제 및 세포골격 추출 버퍼로 보충된 순서대로 추가합니다.
      참고: 모든 버퍼는 프로테아제 억제제로 보충되어야 합니다. 셀 펠릿의 부피에 따라 버퍼 볼륨을 배율 조정합니다.
      1. 세포분열 분획을 분리하기 위해, 4°C에서 프로테아제 억제제로 보충된 얼음-차가운 세포질 추출 완충액의 100 μL에 세포 펠릿을 배양하고, 10분 동안 부드러운 혼합을 한다. 원심분리기는 4°C에서 500 x g에서 5분 동안 5°C에서 5분 간, 상급을 미리 냉각된 튜브로 옮긴다.
      2. 6.4.1.1 단계에서 펠릿에 프로테아제 억제제로 보충된 얼음-차가운 막 추출 완충액 100 μL을 추가하고, 4°C에서 10분 동안 부드러운 혼합으로 4°C에서 배양하고, 4°C에서 3,000 x g에서 원심분리기를 5분 동안 5분 동안 포근을 수집합니다.
      3. 수용성 핵 분획의 경우, 6.4.1.2 단계 및 와류로부터 펠릿에 프로테아제 억제제를 보충한 50 μL의 핵 추출 버퍼를 추가합니다. 4°C에서 30분 동안 배양하고, 5,000 x g에서 5°C에서 원심분리기를 5분 동안 4°C에서 배양하고, 상한체를 수집한다.
      4. 불용성 핵 분획의 경우, 프로테아제 억제제, CaCl2 및 마이크로코칼 뉴클레아제를 첨가한 50 μL의 핵 추출 버퍼를 6.4.1.3 단계 및 와류로부터 펠릿에 추가합니다. 37°C에서 5분 동안 배양한 다음 다시 소용돌이를 보습니다. RT에서 16,000 x g의 원심분리기를 5분 간 및 상급체를 수집합니다.
      5. 세포골격 분획의 경우, 6.4.1.4 단계 및 와류로부터 펠릿에 프로테아제 억제물로 보충된 50 μL의 세포골격 추출 버퍼를 추가합니다. RT. 원심분리기에서 10 분 동안 튜브를 16,000 x g에서 5 분 동안 인큐베이션하고 상류를 수집하고 펠릿을 버립니다.
        참고: 키트 프로토콜에 표시된 대로 셀 볼륨에 따라 버퍼 볼륨을 확장합니다. 인큐베이션 및 원심 분리 시간 및 온도22,23,24,25,26,27,28,29에대한 자세한 내용은 키트 프로토콜을 참조하십시오. 대안적으로, 세제를 사용하고 이온 강도 및 원심분리 속도를 증가시킴으로써, 세포질, 막 결합, 세포골격 및 핵 분획을 분리하는 임의의 표준방법(30)을 사용한다. 표준 핵 추출 버퍼를 이윤을 이루에 의해 용해성 핵 분획과 용해성 핵 분획을 분리합니다. 샘플은 -20°C에서 보관할 수 있다.
    2. SDS-PAGE의 경우, 6.4.1.1-6.4.1.5 단계에서 얻은 세포 내 분획의 20 μL에 4x Laemmli 완충액 7 μL을 넣고 100 °C에서 5 분 동안 끓입니다.
  5. 아크릴아미드 겔에 시료를 로드하고 120V. 단백질을 250 mA에서 90분 동안 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 전송하는 일정한 전압에서 전기 동거의 작업을 수행합니다.
  6. Ponceau 염색 용액에서 5 분 동안 멤브레인을 배양하여 적절한 단백질 젤 전기 동동및 성공적인 블로팅을 확인하십시오. 배경이 깨끗할 때까지 증류수로 멤브레인을 헹구어 줍니다. 트렌 20(TBST)으로 트리스 완충 식염수로 셰이커에서 10분 동안 계속 세척하여 얼룩을 제거합니다.
  7. 셰이커에서 RT에서 1 시간 동안 차단 용액 (TBST의 5 % 우유)으로 멤브레인을 배양하십시오. TBST로 3회 5회 세척합니다.
  8. 4 °C에서 하룻밤 동안 차단 용액 (TBST에서 1 % 우유)에서 1 차 항체와 멤브레인을 혼성화하십시오. TBST로 3회 5회 세척합니다.
  9. RT에서 1 시간 동안 차단 용액에서 HRP 컨쥬게이트 이차 항체로 멤브레인을 혼성화하십시오.
  10. 화학 발광을 사용하여 단백질 밴드를 검출합니다. ImageJ에 의해 웨스턴 블롯 밴드의 강도를 정량화합니다. 하우스키핑 유전자의 생성물상단백질 발현을 정상화합니다: 핵용해 및 용해성 분획을 위한 히스톤 H2B, 세포질 분획및 총 추출물에 대한 GAPDH.

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결과

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세포질 타우 단백질의 기여를 피하는 유전자 발현에서 핵타우의 영향을 해부하는 데 사용되는 전략은 도 1에도시되어 있다. 간단히, NLS 또는 NES로 태그된 타우 단백질은 각각 핵 구획에서 축적되거나 배제된다. 이러한 불균형의 기능적 효과는 VGluT1 유전자의 생성물로 측정된 유전자 발현의 변화이다.

프로토콜 설명에 따라, SH-SY5Y 세포를 MIToTIC 후 신경유사 세포를 얻기 위해 5일 동안 RA로 처리한 다음 BDNF로 3일 동안 처리하였다(도2). RA 및 BDNF의 부재에서, 미분화 된 SH-SY5Y 세포는 둥근 형태를 가정하고 세포 덩어리를 형성한다. 예상대로, 분화 프로토콜을 시작, 덩어리가 풀고 세포는 신경구를 확산; 분화의 끝에서, 세포...

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토론

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우리는 유전자 발현에 핵 타우 단백질의 영향을 측정하는 방법을 기술한다. 이 프로토콜을 사용하면 세포질 타우의 기여가 강력하게 제한됩니다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 다음과 같습니다: 인간 신경 아세포종 SH-SY5Y 세포의 분화, 핵 구획에서 타우 단백질의 세포 분열 및 국소화.

먼저, 대표적인 결과 섹션에 나타난 바와 같이, RA 및 BDNF를 첨가하여 SH-SY5Y 세포의 분화는 배양에서 뉴런 유사 세포의 양호한 제제를 얻는 데 매우 중요하다. 더 낮은 조밀도가 세포 증식에 영향을 미칠 수 있기 때문에 종자 된 세포의 밀도는 특히 중요합니다. 더욱이, 세포 분획 및 웨스턴 블롯과 같은 많은 수의 세포를 필요로 하는 실험의 경우, BDNF 분화 단계는 말단 분화를 허용하도록 세포 증식을 차단하여 배양내의 세포 수를 제한한다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 대체 분화 프로토콜은 BDNF 대신 RA 또는 NGF만 사용합니다. 그러나, RA 후 BDNF를 첨가하면 더 나은 형태학...

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 스쿠올라 노멀 슈페리어 (SNS14_B_DIPRIMIO 의 보조금에 의해 지원되었다; SNS16_B_DIPRIMIO).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Alexa Fluor 633 염소 안티 마우스 IgGLife TechnologiesA21050IF 1:500
안티 액틴 항체BETHYL LABORATORIEA300-485A안티 토끼 WB 1:10,000
안티 GAPDH 항체Fitzgerald Industries International10R-G109a안티 마우스 WB 1:10,000
안티 H2B 항체Abcamab1790안티 토끼 WB 1:15,000
안티 Tau-13 항체Santa Cruz Biotechnologysc-21796안티 마우스 WB 1:1,000; IF 1:500
안티 튜불린 알파 항체Thermo Fisher ScientificPA5-16891안티 마우스 WB 1:5,000
안티 VGluT1 항체Sigma-AldrichAMAb91041안티 마우스 WB 1:500
BCA 단백질 분석 키트EurocloneEMPO14500
BDNFAlomone LabsB-250
블로팅 등급 차단제Biorad1706404무지방 분유
보빈 혈청 알부민Sigma-AldrichA4503-50g
cOmplete MiniRoche11836170001프로테아제 억제제
Criterion TGX 4-20% 무스테인, 10Biorad5678093
DAPIThermo Fisher Scientific62247
DMEM/F-12GIBCO21331-020
Dulbecco's Modified Eagle의 중간 저당유로 클론ECM0060L
EDTA시그마 - 알드리치0390-100mlpH = 8, 0.5 M
태아 혈청유로 클론EC50182L
글리세롤시그마 - 알드리치G5516-500ml
염소 안티 마우스 IgG - HPR산타 크루즈 생명 공학sc-2005WB 1:1,000
염소 안티 토끼 IgG - HPRSanta Cruz Biotechnologysc-2004WB 1:1,000
IGEPAL CA-630Sigma-AldrichI8896-50mlOctylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol
Immobilon WesternMERCKWBKLS0500
Lab-Tech Chamber slide 8 well glassslide nunc177402
L-glutamineEurocloneECB3000D100X
Lipofectamine 2000 형질주입 시약, Thermo Fisher Scientific12566014 양이온성 지질
메탄올, Sigma-Aldrich, 322415-6X1L
MgCl2Sigma-AldrichM8266-100G
NaClSigma-Aldrich,S3014-1kg
, Opti-MEM, 저혈청, 배지Gibco31985070
PEISigma-Aldrich40,872-7
페니실린/스트렙토마이신Thermo Fisher Scientific1514012210,000 U/mL, 100 mL
인산염 완충 식염수(Dulbecco A)OXOIDBR0014G
PhosStopRoche4906837001phosphatase inhibitor
QIAGEN Plasmid Maxi KitQiagen12163Step 3.10
배양 세포용 레티노산Sigma-AldrichR2625-100mg
세포 이하 단백질 분획 키트Thermo Fisher Scientific78840
지원 니트로셀룰로오스 멤브레인Biorad1620097
TC-Plate 6wellSARSTEDT833,920
TCS SP2 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경LeicaN/A
Triton x-100Sigma-AldrichX100-500ml비이온 계면활성제
Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific154000540.50%
Tween-20Sigma-AldrichP9416-100ml
VECTASHIELD 안티페이드 마운팅 매체Vector LaboratoriesH-1000
Wizard Plus SV Minipreps DNA 정제 시스템프로메가A13303.5
웰 ,, , ,, , 단계

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Padmaraju, V., Indi, S. S., Rao, K. S. J. New evidences on Tau-DNA interactions and relevance to neurodegeneration. Neurochemistry International. 57 (1), 51-57 (2010).
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