시간 경과 구조화 조명 현미경 검사법에 대한 미토콘드리아 핵의 특정 라벨링

Visnja Jevtic; Petra Kindle; Sergiy V. Avilov

doi:10.3791/60003

이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

시간 경과 구조화 조명 현미경 검사법에 대한 미토콘드리아 핵의 특정 라벨링

7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/60003

⸱

2020년 6월 4일

Visnja Jevtic¹ , Petra Kindle¹ , Sergiy V. Avilov¹

¹Imaging Facility, Max Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 시판되는 DNA 젤 얼룩이 있는 미토콘드리아 핵종의 특정 라벨링, 초고해상도 구조조명 현미경(SR-SIM)에 의한 라이브 라벨링 세포의 타임랩스 시리즈 획득, 핵운동의 자동 추적을 설명합니다.

초록

미토콘드리아 핵형성은 단백질로 코팅된 미토콘드리아 DNA 분자에 의해 형성된 소형 입자입니다. 미토콘드리아 DNA는 tRNA, rRNAs 및 몇몇 필수 미토콘드리아 폴리펩티드를 인코딩합니다. 미토콘드리아 핵형성은 핵분열/융합 및 기타 형태학적 변화를 겪는 동적 미토콘드리아 네트워크 내에서 분열및 분배됩니다. 고해상도 라이브 형광 현미경 검사법은 핵신의 위치와 움직임을 특성화하는 간단한 기술입니다. 이 기술을 위해, 핵형성은 그들의 단백질 분대, 즉 전사 인자 a (TFAM)의 형광 태그를 통해 일반적으로 표지됩니다. 그러나 이 전략은 아티팩트(TFAM에 대해 보고됨)를 유발할 수 있는 형광 단백질 태그가 지정된 구성물의 과발현이 필요하며 많은 경우에 실현 가능하지 않습니다. 유기 DNA 결합 염료는 이러한 단점을 가지고 있지 않습니다. 그러나, 그(것)들은 항상 핵과 미토콘드리아 DNA 둘 다의 얼룩을 보여주기, 따라서 미토콘드리아 핵형성에 특이성이 결여됩니다. 이러한 염료의 물리 화학적 특성을 고려하여 핵산 젤 얼룩(SYBR Gold)을 선택하고 살아있는 세포에서 미토콘드리아 핵세포의 우대 라벨링을 달성했습니다. 염료의 특성, 특히 DNA에 결합시 높은 밝기는 초고해상도 구조 조명 이미지의 타임 시리즈를 사용하여 미토콘드리아 핵운동의 후속 정량화를 허용합니다.

서론

원형 16.5 kbp DNA 분자는 미토콘드리아의 유전 물질을 구성하며, 미토콘드리아 산화 인산화 복합체에 필요한 22 tRNAs, 2 rRNAs 및 13개의 폴리펩티드를 인코딩합니다. 미토콘드리아 DNA는 미토콘드리아 전사 인자 a(TFAM) 및 여러 다른 단백질에 결합하여 미토콘드리아 핵형성^1,^,^2,^,^3,^,^4. 미토콘드리아 핵형성은 세포 주기 상, 스트레스 및 기타 요인에 따라 형태학적^{리모델링,}핵분열 또는 융합^동안 미토콘드리아^{네트워크의}성분 들 간에 이동 및 재분배(Pernas et al.^7). 또한, 미토콘드리아 핵소자의 움직임은, 전신 성 홍반성 루푸스 질환^8에 연루되어 다른 질병에 역할을 할 수 있다. 형광 현미경 검사법은 세포기관의 살아있는 세포 연구를 위한 간단한 기술입니다, 그러나 기술은 미토콘드리아 핵형성의 크기보다는 더 큰 >200 nm의 해결책을 가지고 있습니....