Method Article

원형 RT-PCR 기반 전략을 사용하여 옥수수 미토콘드리아의 기본 및 처리된 성적증명서의 차별 및 매핑

DOI:

10.3791/60019

⸱

July 29th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources, South China Agricultural University, 2Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Molecular Breeding, College of Agriculture, South China Agricultural University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 원형 RT-PCR, 정량적 RT-PCR, RNA 5' 폴리포스파타제 처리 및 북부 블롯을 결합하여 원형 RT-PCR 기반 전략을 제시합니다. 이 프로토콜은 불안정한 5' 삼인산염의 영향을 최소화하기 위한 정규화 단계를 포함하며, 옥수수 미토콘드리아에 안정적으로 축적된 1차 및 처리된 전사체를 차별하고 매핑하는 데 적합하다.

Abstract

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식물 미토콘드리아에서, 몇몇 정상 상태 전사체는 전사 개시 (1 차 적인 전사체)에서 파생된 5' 삼인산염이 있고, 그 외는 5' 단인산염 생성 후 전사 (처리된 전사)를 포함합니다. 성적 증명서의 두 가지 유형을 구별하기 위해, 몇 가지 전략이 개발되었으며, 그들 대부분은 5 '삼인산염의 존재 / 부재에 따라 달라집니다. 그러나, 1 차 5'termini에 있는 삼인산염은 불안정하고, 녹취록의 2개의 모형의 명확한 차별을 방해합니다. 옥수수 미토콘드리아에 안정적으로 축적된 1차 및 처리된 전사체를 체계적으로 차별화하고 매핑하기 위해 cRT-PCR, RNA 5' 폴리포슈파타제 처리, 정량적 을 결합하여 원형 RT-PCR(cRT-PCR) 기반 전략을 개발했습니다. RT-PCR(RT-qPCR) 및 북부 블롯. 개선으로, 이 전략은 불안정한 5' 삼인산염의 영향을 최소화하기 위한 RNA 정규화 단계를 포함한다.

이 프로토콜에서 농축 된 미토콘드리아 RNA는 RNA 5 '폴리포스파타제에 의해 전처리되어 5'삼중산염을 모노포스페이트로 변환합니다. 순환화 및 역전사 후, 5' 폴리포스파타스 처리 및 비처리 RNA로부터 유래된 2개의 cDNA는 5' 말단을 처리하고 5' 폴리포스파타제에 민감하지 않은 옥수수 26S 성숙한 rRNA에 의해 정규화된다. 정규화 후, 1차 및 처리된 전사체는 처리된 RNA로부터 수득된 cRT-PCR 및 RT-qPCR 제품을 비교하여 차별된다. 전사체 테르미니는 cRT-PCR 제품의 클로닝 및 시퀀싱에 의해 결정된 다음, 북부 블롯에 의해 검증된다.

이 전략을 사용 하 여, 옥수수 미토 콘 드리 온에서 가장 꾸준한 상태 성적 증명서 결정 되었습니다. 일부 미토콘드리아 유전자의 복잡한 전사체 패턴으로 인해, 몇몇 정상 상태 전사체는 북부 얼룩에서 검출되었지만 분화 및/또는 매핑되지 않았습니다. 우리는 이 전략이 다른 식물 미토콘드리아또는 석고에 있는 정상 상태 전사체를 차별하고 지도로 지도하기에 적당한지 확실하지 않습니다.

Introduction

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식물 미토콘드리아에서, 많은 성숙및 전구체 RNA는 다중 이소형태로 축적되고, 정상 상태 전사체는 그들의 5' 끝에있는 차이에 기초하여 2개의 단으로 분할될 수 있습니다 1,2,3, 4. 1 차적인 전사는 전사 개시에서 파생되는 5' 삼인산염 끝이 있습니다. 대조적으로, 처리된 전사체는 전사 후 처리에 의해 생성된 5' 단인산염을 갖는다. 2가지 유형의 전사체의 차별 및 매핑은 전사 및 전사 말기 성숙의 근본적인 분자 메커니즘을 해명하는 데 중요하다.

식물 미토콘드리아에서 1 차적인 및 가공된 전사체를 구별하기 위하여는, 4개의 중요한 전략이 개발되었습니다. 첫 번째 전략은 5'삼인산염을 모노포스페이트로 변환하고 RNA 리가제에 의해 원형화될 수 있도록 담배 산 열포스파타제(TAP)로 미토콘드리아 RNA를 미리 치료하는 것입니다. TAP 처리 및 비처리 RNA 샘플의 전사체 풍부는 cDNA 말단(RACE) 또는 원형 RT-PCR(cRT-PCR)의 신속한 증폭에 의해 비교된 후 2,<....

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Protocol

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1. 프라이머 디자인

  1. PCR 프라이머 설계 소프트웨어(표오브 머티리얼)를이용하여 역전사(RT)를 위한 유전자 특이적 프라이머를 프라이머설계(17)의일반적인 규칙에 기초한다.
    참고: RT 프라이머는 표적 전사체에 매우 특이적이며, 이들은 일반적으로 5' 코딩 서열(성숙한 mRNA 및 전구체 RNA) 또는 예상된 5' 말단(18S 및 26S rRNA)의 ~500-600 nt 다운스트림에 고정된다.
  2. cRT-PCR에 의해 원형 전사체를 증폭하기 위해 서로 다른 프라이머 쌍을 설계합니다.
    참고: 쌍이 짝이 된 발산 프라이머는 원형 전사체의 5'-3' 접합을 측면에 있으며, 그들의 위치는 분석된 표적 전사체들 사이에서 다양합니다(그림 S1). 일부 성적 증명서에는 긴 UTR이 있습니다. 예를 들어 nad2 -1 5' UTR 및 rps4-1 3' UTR은 각각 1,985 및 1,826/1,834 nt입니다. 두 프라이머가 코딩 영역에 고정되어 있는 경우 대상 전사체를 증폭하기가 어렵습니다. 대조적으로, 일부 UTR은 짧습....

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Results

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미토콘드리아 RNA 원형화 효율 추정

이전 연구에서, 총 및 미토콘드리아 RNA는 모두 애기장대에서 미토콘드리아 전사체 종단의 cRT-PCR 매핑에 사용되었고(애기장대탈리아나),두 가지 유형의 RNA는 유사한 매핑 결과를12로주었다. 처음에, 우리는 또한 옥수수에 있는 미토콘드리아 전사체 termini의 cRT-PCR 매핑을 위한 총 RNA를 이용했습니다. 많은 시험 후에, 우리는 표적 성적 증명서가 검출하기 어렵다는 것을 것을을 발견했습니다. 개선으로, 우리는 옥수수 개발 커널에서 미토콘드리아 RNA를 풍부하게하고, 그것은 가능한 PCR의 한 라운드에서 원형 대상 전사체의 증폭을 했다.

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Discussion

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이전 연구에서, 애기장대의 세포 현탁물 배양으로부터의 총 및 미토콘드리아 RNA는 cRT-PCR에 의해 미토콘드리아 전사체 종기를 매핑하는데 사용되었고, 유사한 결과를12로얻었다. 그러나, 농축된 미토콘드리아 RNA만이 많은 다른 연구에서 미토콘드리아 전사체 termini를 맵메이상으로 사용하였으며 1, 2,3,9. 우리는 미토콘드리아 RNA의 농축이 옥수수에서 미토콘드리아 전사체 종단의 cRT-PCR 매핑을 위한 중요한 단계라는 것을 것을을 발견했습니다. 이 농축 후, 원형화된 미토콘드리아 RNA의 비율은 0.3%에서 3.7%에서 ~30%로 극적으로 증가한다(도3 및

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Disclosures

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저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (교부금 번호 31600250, Y.Z.), 광저우 시의 과학 기술 프로젝트 (보조금 번호 201804020015, H.N.), 중국 농업 연구 시스템 (보조금 없음)에 의해 지원되었다. CARS-04-PS09, H.N.).

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
아세트산알라딘, 중국A1128801x TAE 완충액 제조
Applied Biosystems 2720 Thermal CyclerThermo Fisher Scientific, 미국4359659 PCR 증폭을 위한 열 순환기
Ascorbic acidSigma-aldrich, 미국V900134추출 완충액 제조
Biowest AgaroseBiowest, Spain9012-36-6PCR을 분해하려면 제품 및 RNA
소 혈청 알부민Sigma-aldrich, USAA1933추출 완충액 제조
Bromophenol blueSigma-aldrich, USAB8026아가로 젤 전기 영동 및 북부 블롯
DEPCSigma-aldrich, 미국V900882RNase
DIG 북부 스타터 키트Roche의비활성화12039672910DIG-RNA 라벨링 및 북부 얼룩용. 이 키트에는 DIG 및 T7 RNA 중합효소를 사용한 RNA의 전사 라벨링, 혼성화 및 화학발광 검출을 위한 시약이 포함되어 있습니다.
EDTASigma-aldrich, 미국V900106추출 버퍼 및 1x TAE 버퍼 EGTA
Sigma-aldrich, 미국E3889세척 버퍼 준비
겔 문서화 시스템Bio-Rad, 미국Gel Doc XR+아가로스 젤
글리세롤Sigma-aldrich, 미국G5516아가로스 젤 전기영동을 위한 로딩 버퍼 준비
GoldView II (5,000x)솔라바이오,. 중국G8142DNA 염색
Hybond-N +, 나일론 멤브레인Amersham Biosciences, 미국RPN119노던 블롯
이미지 랩바이오 라드, 미국이미지 랩 3.0이미지 젤 및 PCR 제품의 풍부함을 비교합니다.
KH2PO4Sigma-aldrich, 미국V900041추출 완충액
KOHAladdin의중국 P112284추출 완충액
L-cysteineSigma-aldrich, 미국V900399추출 완충액
MillexMillipore의미국 SLHP033RB멸균 추출 및 여과에 의한 세척 완충액
MiraclothCalbiochem, 미국475855-1R분쇄 커널 조직 여과용
MOPSSigma-aldrich, 미국V900306Northern blot
NanoDrop ThermoFisher Scientific, USA2000CRNA 농도 및 순도 분석용
NaOHSigma-aldrich, 미국V900797 세척 완충액
pEASY-Blunt 단순 클로닝 벡터TransGen Biotech, 중국CB111젤 회수 밴드의 클로닝. 여기에는 삽입 부위의 몇 bps 상류에 T7 프로모터가 포함되어 있습니다.
Phanta max super-fidelity DNA polymeraseVazyme, 중국P505DNA 중합효소
폴리비닐피롤리돈 40Sigma-aldrich, 미국V900008추출 완충액 제조용
Primer Premier 6.24PREMIER Biosoft, USAPrimer Premier 6.24역전사 및 PCR 증폭을 위한 프라이머 설계
PrimeScript II 역전사효소Takara, Japan2690첫 번째 가닥 cDNA
PureLink RNA Mini kitThermo Fisher Scientific, 미국12183025RNA purificaion
RNA 5' 폴리포스파타제Epicentre, 미국RP8092H5' 트리포스페이트를 모노포스
RNase 억제제로New England Biolabs, UKM0314RNA 자가 결찰 및 5' 폴리포스파타제 치료 반응의 구성 요소로, RNase의 활성을 억제하는 데 사용됩니다.
아세트산 나트륨Sigma-aldrich, 미국V900212북부 블롯 용 러닝 버퍼 준비
염화나트륨Sigma-aldrich, 미국V90005820x SSC
SsoFas evaGreen supermixesBio-Rad, 미국1725202RT-qPCR
T4 RNA Ligase 1New England Biolabs, UKM0437RNA 원형 화
용 Tetrasodium 피로인산시그마-알드리치, 미국221368추출 완충액
TIANgel midi 정제 키트Tiangen Biotech, 중국DP209DNA 단편을 정제하기 위해
1x TAE 완충액
TRIzol 시약을Invitrogen, 미국15596026미토콘디랄 RNA를 추출하기 위해.
범용 DNA 정제 키트Tiangen Biotech, 중국DP214제한 효소 분해 반응에서 선형화 된 플라 미드를 복구하기 위해
Xylene cyanol FFSigma-aldrich, USAX4126아가로 오스 젤 전기 영동을위한 로딩 버퍼 준비
용 제조를 위해 의 제조를 위해 제조를 위해 용 의 제조 PCR 증폭을 위한 페이트 변환 용염 의 제조를 위해 아가로스 젤 트리스 알라딘, 중국 T110601에서 제조하기 위해

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, Y., et al. Major contribution of transcription initiation to 5'-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize. RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).
  2. Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L.

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Circular RT PCRRNA 5 PolyphosphataseMitochondrial RNA ExtractionQuantitative RT PCRNorthern BlotMaize MitochondrionTermini MappingPrimary Processed TranscriptsRNA NormalizationDivergent Primers

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