여기에서, 우리는 간격 접합 connexin 43를 중단하고 견인및 세포간 응력의 관측을 통해 내피 생체 역학에 있는 후속 충격을 측정하기 위하여 역학 기지를 둔 프로토콜을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
내피 세포는 세포 간 응력과 견인력을 생성하기 위해 설립되었지만, 내피 간 스트레스와 견인 생성에서 역할 갭 접합이 작용한다는 것은 현재 알려져 없습니다. 따라서, 우리는 여기에 갭 접합 코넥신 (Cx43)의 영향을 조사하는 역학 기반 프로토콜을 제시 (Cx43) 알려진 Cx43 억제제 2,5 디하이드록시 찰콘 (chalcone)에 동천 내피 단층을 노출시킴으로써 내피 생체 역학에 있다 이 억제제가 견인력과 세포간 응력에 미치는 영향을 측정합니다. 우리는 대조군과 비교할 때 높은 chalcone 복용량 (2 μg/mL)에서 견인력과 세포 간 응력 모두의 감소를 보여주는 대표적인 결과를 제시합니다. 이 프로토콜은 적절한 억제제가 사용된다는 가정하에 Cx43뿐만 아니라 다른 갭 접합에도 적용될 수 있습니다. 우리는 이 프로토콜이 심혈관 및 메카생물학 연구 분야에서 유용할 것이라고 믿습니다.
서론
물리적 인 힘의 효과및 세포 및 조직 생리학 및 병리학에 대한 기계적 특성의 연구를 참조하는 분야는 기계생물학1로알려져 있다. 메카노생물학에서 활용된 몇 가지 유용한 기술은 단층 스트레스 현미경 검사법 및 견인력 현미경입니다. 견인력 현미경법은 세포 기판 인터페이스에서 생성된 견인력을 계산할 수 있게 해주며, 단층 응력 현미경은 단일층 내의 인접 세포 간에 생성된 세포간 응력의 계산을 허용합니다2 ,3,4,5,6. 이전 방법에서 산출된 결과는 세포 유래 기계적 응력이 세포 프로세스의 호스트의 운명을 결정하는 중요한 역할을 한다는 것을건의했습니다 3,4,5. 예를 들어, 외부 기계적 힘에 노출되면 집단으로 이동하는 셀 그룹이 형태를 변경하고 모양을 편광하여 적용된 힘의 방향을 따라 정렬하고 이동하....
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프로토콜
1. 폴리아크릴아미드 (PA) 젤 만들기
-
페트리 접시의 준비
- 200 mL의 초순수와 80 μL 아세트산 및 50 μL의 3-(트리메톡시실릴) 프로필 메타크릴레이트를 혼합하여 바인드 실란 용액을 준비합니다. 바인드 시레인은 하이드로겔 부착을 위해 유리 바닥 페트리 접시 표면을 기능화하는 데 사용되는 용액이다.
- 바인드 시란 용액을 교반판에 적어도 1시간 동안 저어줍니다.
- 페트리 접시의 중심을 바인드 실란 용액으로 45분 동안 처리합니다.
- 바인드 스틸란 용액을 제거하고 페트리 접시를 초순수 2x-3x로 헹구세요.
- 페트리 접시 표면을 말려 실온에서 보관하여 나중에 사용할 수 있습니다.
-
하이드로겔 용액의 준비
- 표 1에따라 초순수, 40% 아크릴아미드 및 2% 비스-아크릴아미드를 15 mL 원심분리기 튜브에 섞는다.
- 하이드로겔 용액에 80 μL의 형광 비드를 추가합니다.
- 튜브를 부드럽게 흔들어 구슬을 젤 용액과 섞습니다.
- 원심분리기 튜브의 튜브 캡을 가볍게 조이고 진공 챔버에 놓습....
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결과
대조군 이미지, 0.2 μg/mL, 및 2 μg/mL 단층 처리된 단층은 찰콘 처리 30분 전에 촬영하였다(그림1A-C)및 2시간 후 의 찰콘 처리(도1D-F). 세포-유도 비드 변위(μm)는 HUVEC 단층 대조층 대조층 대조군과 비교했을 때 저용량 chalcone 및 고용량chalcone 조건 모두에서 감소하는 것으로 관찰되었다(그림2E,F). chalcone 처리 이전에, rms 견인은 모든 조건에 대해 약 51±8Pa(도 3A-C)였다. 갈콘 처리 후.......
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토론
우리 그룹뿐만 아니라 다른 사람뿐만 아니라,성공적으로시험관 7,15,18,27에서 다양한 병리학 및 생리 적 세포 과정에서 세포 접합의 영향을 조사하기 위해 TFM과MSM을사용하고있다 . 예를 들어, Hardin 등은 세포간 스트레스 전달가이드 내피 세포에서의 파라셀룰러 갭 형성을 시사하는 매우 통찰력 있는 연구를제시15. 우리가 여기 보고하는 Cx43 관련 변경사항을 Hardin 등에서 보고한 변경사항과 관련시킬 수 있지만, 이 프로토콜에서 파라셀룰러 갭 형성을 구체적으로 다루지는 않습니다. 여기에서, 우리는 특히 간격 접합 Cx43를 표적으로 하고 내피 생체 역학에 그것의 영향을 조사하기 위하여 역학 기지를 둔 프로토콜을 제출했습니다.
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 작품은 중앙 플로리다 대학 창업 기금과 국립 심장, 폐, 그리고 수상 K25HL132098에서 건강의 국립 연구소의 혈액 연구소에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 18mm 커버슬립 | ThermoFisher | 18CIR-1 | 폴리아크릴아미드 겔을 평평하게 하는 데 필수 |
| 2% 비스-아크릴아미드 | BIO-RAD | 1610143 | 폴리아크릴아미드 겔의 구성 요소 |
| 2′,5′-Dihydroxychalcone | SIGMA | IDF00046 | Cx43 구조를 방해하려면 |
| 3-(트리메톡시실릴)프로필 메타크릴레이트 | SIGMA | 2530-85-0 | 아세트산 및 초순수 |
| 40 % 아크릴 아미드 | BIO-RAD | 1610140 | 폴리 아크릴 아미드 젤 |
| 세트 | Fisher-Sceintific | 64-19-7 | |
| Alexa Fluro 488 염소 안티 마우스 IgG를 | ThermoFisher | 카탈로그 # A-11001 | 2차 항체 |
| 과황산 암모늄 | BIO-RAD | 1610700 | 폴리아크릴아미드 겔 중합제 |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | SIGMA | 9048-46-8 | 블로킹 용액 소 |
| 타입 I 아텔로-콜라겐 용액, 3 mg/mL, 100 mL | Advance Biomatrix | 5005-100ML | 세포 외 매트릭스 |
| 로 사용코닝 세포 배양 인산염 완충 식염수 (1x) | Fisher-Sceintific | 21040CV | 세포 배양에 필요한 완충 식염수 |
| 디메틸 설폭사이드, Fisher BioReagents | Fisher-Sceintific | 67-68-5 | 칼콘을 용해하고 원액을 만들기 위해 |
| DAPI가 포함된 Fluoromount-G | ThermoFisher | 00-4959-52 | DAPI |
| 염색에 사용되는 면역 억제용 장착 매체형광 마이크로스피어 카르복실레이트 변성 비드 | ThermoFisher | F8812 | 0.5 미크론 카르복실레이트 변성 비드(빨간색), 2% 고체 |
| HEPES 완충 용액 1 M | SIGMA | 7365-45-9 | LVES에 필수 |
| ThermoFisher | A1460801 | 필수 HUEVC 배지 200 보충제 | |
| 매체 200 ThermoFisher | M200500 | HUVEC 세포 배양을 | |
| 위한 필수 배지마우스 monoclonal Cx43 항체 (CX - 1B1) | ThermoFisher | Catalog #13-8300 | Cx43 |
| Petri dish (35 mm dia) | CellVis | D35-20-1.5H | 20 mm center well |
| Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg | Proteochem | 102568-43-4 | polyacrylamide gel surface surface를 기능화하는 데 필수 |
| SYLGARD 184 실리콘 엘라스토머 키트 | DOW corning | 2646340 | 만드는 경화제가 함유 된 실리콘 엘라스토머 |
| 1610801 폴리 아크릴 아미드 겔 중합제 | |||
| Triton-X 100 | SIGMA | 9002-93-1 | 세포를 투과시키기 위해 |
| Trypsin -EDTA | ThermoFisher | 25300054 | 세포를 분리하는 데 사용됩니다 |
참고문헌
- Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. Mechanobiology and developmental control. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).
- Schwarz, U. S., Soine, J. R. Traction force microscopy on soft elastic substrate....
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