여기에 제시된 것은 줄기세포 유래 바이러스 항원(Ag)-특이적 T 림프구의 입양세포 전달(ACT)을 이용하여 마우스에서 B형 간염 바이러스(HBV) 복제의 효과적인 억제를 위한 프로토콜이다. 이 절차는 HBV 감염의 잠재적인 ACT 기지를 둔 면역 요법을 위해 적응될 수 있습니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
B형 간염 바이러스 (HBV) 감염은 글로벌 건강 문제입니다. 전 세계적으로 3억 5천만 명 이상이 영향을 받은 HBV 감염은 간암의 주요 원인으로 남아 있습니다. 이것은 특히 개발도상국에서 주요 관심사입니다. HBV에 대하여 효과적인 반응을 탑재하는 면역 계통의 실패는 만성 감염으로 이끌어 냅니다. HBV 백신이 존재하고 새로운 항 바이러스 의약품이 생성되고 있지만, 바이러스 저수지 세포의 박멸은 주요 건강 주제로 남아 있습니다. 여기서 기재된 바이러스 항원(Ag)-특이적CD8+세포독성 T 림프구(CTL)의 생성을 위한 방법은 유도된 만능 줄기 세포(iPSCs)(즉, iPSC-CTL)로부터 유래되며, 이는 HBV 복제를 억제하는 능력을 갖는다. HBV 복제는 HBV 발현 플라스미드, pAAV/HBV1.2의 유체역학적 주입을 통해 마우스에서 효율적으로 유도되며, 간으로 유도된다. 이어서, HBV 표면 Ag 특이적 마우스 iPSC-CTL은 입양적으로 전달되어 간 및 혈액에서의 HBV 복제를 크게 억제할 뿐만 아니라 간세포에서 HBV 표면 Ag 발현을 방지한다. 이 방법은 유체역학적 주입 후 마우스에서 HBV 복제를 입증하고 줄기 세포 유래 바이러스 Ag-특이적 CTLs가 HBV 복제를 억제할 수 있음을 보여준다. 이 프로토콜은 HBV 면역 요법에 유용한 방법을 제공한다.
서론
급성 감염 에 이어, 적응 면역 체계 (즉, 체액성 및 세포 면역)는 급성 HBV 관련 간염의 대부분을 제어합니다. 아직도, HBV 풍토성 지구에 있는 사람들의 수는 바이러스를 제거하고 그 후에 만성 개별로 변환할 수 없습니다. 전 세계 만성 환자(>2억 5천만 명)의 25% 이상이 진행성 간 질환을 일으켜 간경변 및/또는 간세포암종(HCC)을 초래합니다1. 그 결과, 고집이 세게 감염된 세포의 박멸은 유효한 백신2가 있고 수많은 항바이러스 약이 개발되고 있더라도 일반적인 건강 문제 남아 있습니다. HBV 감염을 위한 표준 처리는 IFN-α, 뉴클레오시드, 및 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 이 에이전트는 직접적인 항 바이러스 활성 및 면역 조절 용량. 그럼에도 불구하고, HBe 항원(Ag)+담체의 혈청 변환(Ab) 및 혈청 HBV 데옥시리보핵산(DNA)의 손실은 치료된 환자의 약 20%에서 개별적으로 나타나며, 바이러스의 전체 면역학 적 대조군 BBsAg의 박탈에 의해 확인은 더 이상 5 %3입니다. 또한 치료에 대한 반응은 종종 내구성이 없습니다. 재조합 HBs Ag를 가진 예방 백신 접종은 감염 예방에 매우 효과적이지만 치료적 HBs Ag ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
모든 동물 실험은 텍사스 A&M 대학 동물 관리 위원회(IACUC; #2018-0006)의 승인을 받았으며, 실험실 동물 관리 협회의 평가 및 인증 가이드라인에 따라 수행됩니다. 생쥐는 생후 6-9주 동안 사용된다.
1. iPSCs에서 바이러스 성 Ag 특이적 CD8+ T 세포의 생성 (iPSC-CD8+ T 세포)
- 레트로바이러스 구조의 창조
참고: TCR α 및 β 유전자는 2A 자가 절기 서열과 연결됩니다. 레트로바이러스 벡터 MSCV-IRES-DsRed(MiDR)는 DsRed+ 23입니다.- 서브 클론 HBs183-191 (FLLTRILTI)-특이적 A2 제한 인간-뮤린 하이브리드 TCR(s183 TCR) 유전자(Vα34 및 Vβ28)를 MiDR 내로 생성하여 s183 MiDR 구문(도1A)25.
- 레트로바이러스 전이
참고 : 플래티넘-E (Plat-E)....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
여기에 도시된 바와 같이, HBV 바이러스 성 Ag 특이적 iPSC-CD8+ T 세포는 시험관 내 배양 시스템에 의해 생성된다. 이러한 바이러스 성 Ag 특이적 iPSC-CD8+ T 세포의 ACT 후 실질적으로 뮤린 모델에서 HBV 복제를 억제한다(보충파일 1). 마우스 iPSC는 인간 마우스 하이브리드 HBV TCR 유전자를 코딩하는 MIDR 레트로바이러스 구조체(HBs183-191-specific,s183)로 변환된 다음, 유전자 변환된 iPSC는 노치 리간드를 발현하는 OP9-DL1/DL4 세포와 공동 배양된다(DL1 및 DL4 모두). rFlt3L 및 rIL-7이 있는 분자. 시험관내 공동 배양의 28일째에, iPSC 유래 세포는 실질적으로 CD3 및 Ag 특이적 TCR(T 세포 마커)을 발현한다. CD3+CD8+ 집단의 유세포 분석에서는 HBV TCR 전치가 바이러스 성 s183 특이적
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이 프로토콜은 뮤린 모델에서 HBV 복제를 억제하기 위해 ACT로서 사용하기 위한 바이러스 성 Ag 특이적 iPSC-CTL을 생성하는 방법을 제시한다. 만성 HBV 감염에서, 바이러스 게놈은 간세포의 수명 내내 지속될 수 있는 안정적인 미니 염색체, 공유 폐쇄된 원형 DNA(cccDNA)를 형성한다. 바이러스성 미니 염색체의 정리를 표적으로 하는 것은 만성 HBV 감염의 치료 귀착될 수 있습니다. 현재 항바이러스 요법은 바이러스 역전사를 표적으로 하지만 cccDNA에 의해 구동되는 HBV 복제에 대한 면역학적 제어를 거의 확립하지 않습니다. HBV 특이적 CD8+ CTL은 감염된 간세포의 살해를 중재하고 cccDNA의 클리어런스를 가속화할 수 있다. 그럼에도 불구하고, HBV 특이적 CTL은 만성 HBV 감염을 가진 환자에서 삭제, 기능 장애, 또는 고갈에 굴복한다. HBV 특이적 CTL을 가진 ACT는 만성 HBV 감염28,
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
저자는 HBs183-91 (s183)에 대한 cDNA를 제공하는 토론토 종합 병원 연구소에서 박사 아담 J Gehring 감사 (FLLTRILTI)- 특정 A2 제한 인간 - 뮤린 하이브리드 TCR 유전자, 및 제공에 대한 국립 대만 대학에서 박사 페이 - 저 첸 pAAV/HBV 1.2 구문. 이 작품은 J. S에 건강 보조금 R01AI12180, R01CA221867 및 R21AI109239의 국립 연구소에 의해 지원됩니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| HHD 마우스 | Institut Pasteur, Paris, France | H-2 class I knockout, HLA-A2.1-transgenic (HHD) 마우스 | |
| iPS-MEF-Ng-20D-17 | RIKEN Cell Bank | APS0001 | |
| SNL76/7 | ATCC | SCRC-1049 | |
| OP9 | ATCC | CRL-2749 | |
| pAAV/HBV1.2 plasmid | Dr. Pei-Jer Chen (대만 국립 대만 대학 병원) | HBV DNA 구성 | |
| HBs183-91(s183) (FLLTRILTI) 특이적 TCR 유전자 | Dr. Adam J Gehring (Toronto General Hospital Research Institute, Toronto, Canada) | FLLTRILTI 특이적 A2 제한 인간-쥐 하이브리드 TCR 유전자(Vα 34 및 Vβ 28) | |
| OVA257– 264-specific TCR genes | Dr. Dario A. Vignali (University of Pittsburgh, PA) | SIINFEKL 특이적 H-2Kb-restricted TCR 유전자 | |
| Anti-CD3 (17A2) 항체 | Biolegend | 100236 | |
| Anti-CD44 (IM7) 항체 | BD Pharmingen | 103012 | |
| Anti-CD4 (GK1.5) 항체 | Biolegend | 100408 | |
| Anti-CD8 (53-6.7) 항체 | Biolegend | ||
| 안티 IFN-&감마; (XMG1.2) 항체 | Biolegend | 505810 | |
| Anti-TNF-a (MP6-XT22) 항체 | Biolegend | 506306 | |
| α-MEM | Invitrogen | A10490-01 | |
| Anti-HBs 항체 | Thermo Fisher | MA5-13059 | |
| ACK 용해 완충액 | Lonza | 10-548E | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651 | |
| DMEM | Invitrogen | ABCD1234 | |
| FBS | Hyclone | SH3007.01 | |
| FACSAria Fusion 세포 분류기 | BD | 656700 | |
| 젤라틴 | MilliporeSigma | G9391 | |
| GeneJammer | Agilent | 204130 | |
| HLA-A201-HBs183-91-PE 펜타머 | Proimmune | F027-4A - 27 | |
| HRP 안티 마우스 2차 항체 | Invitrogen | A27025 | |
| mFlt-3L | Peprotech | 250-31L | |
| mIL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| Nuclease S7 | Roche | 10107921001 | |
| Paraformaldehyde | MilliporeSigma | P6148-500G | 주의: 알레르기성, 발암성, 독성 |
| 투과화 완충액 | Biolegend | 421002 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | 107689 | |
| ProLong™ DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| QIAamp MinElute 바이러스 스핀 키트 | Qiagen | 57704 |
참고문헌
- Scaglione, S. J., Lok, A. S. Effectiveness of hepatitis B treatment in clinical practice. Gastroenterology. 142 (6), 1360-1368 (2012).
- Osiowy, C. From infancy and beyond... ensuring a lifetime of hepatitis B virus (HBV) vaccine....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
