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방법 논문

줄기 세포 유래 바이러스 Ag 특이적 T 림프구는 마우스에서 HBV 복제를 억제

6.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/60043

⸱

2019년 9월 25일

 ,  ,  , 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M University Health Science Center, 2Department of Ophthalmology, Harvard Medical School

이 논문에서

요약

여기에 제시된 것은 줄기세포 유래 바이러스 항원(Ag)-특이적 T 림프구의 입양세포 전달(ACT)을 이용하여 마우스에서 B형 간염 바이러스(HBV) 복제의 효과적인 억제를 위한 프로토콜이다. 이 절차는 HBV 감염의 잠재적인 ACT 기지를 둔 면역 요법을 위해 적응될 수 있습니다.

초록

B형 간염 바이러스 (HBV) 감염은 글로벌 건강 문제입니다. 전 세계적으로 3억 5천만 명 이상이 영향을 받은 HBV 감염은 간암의 주요 원인으로 남아 있습니다. 이것은 특히 개발도상국에서 주요 관심사입니다. HBV에 대하여 효과적인 반응을 탑재하는 면역 계통의 실패는 만성 감염으로 이끌어 냅니다. HBV 백신이 존재하고 새로운 항 바이러스 의약품이 생성되고 있지만, 바이러스 저수지 세포의 박멸은 주요 건강 주제로 남아 있습니다. 여기서 기재된 바이러스 항원(Ag)-특이적CD8+세포독성 T 림프구(CTL)의 생성을 위한 방법은 유도된 만능 줄기 세포(iPSCs)(즉, iPSC-CTL)로부터 유래되며, 이는 HBV 복제를 억제하는 능력을 갖는다. HBV 복제는 HBV 발현 플라스미드, pAAV/HBV1.2의 유체역학적 주입을 통해 마우스에서 효율적으로 유도되며, 간으로 유도된다. 이어서, HBV 표면 Ag 특이적 마우스 iPSC-CTL은 입양적으로 전달되어 간 및 혈액에서의 HBV 복제를 크게 억제할 뿐만 아니라 간세포에서 HBV 표면 Ag 발현을 방지한다. 이 방법은 유체역학적 주입 후 마우스에서 HBV 복제를 입증하고 줄기 세포 유래 바이러스 Ag-특이적 CTLs가 HBV 복제를 억제할 수 있음을 보여준다. 이 프로토콜은 HBV 면역 요법에 유용한 방법을 제공한다.

서론

급성 감염 에 이어, 적응 면역 체계 (즉, 체액성 및 세포 면역)는 급성 HBV 관련 간염의 대부분을 제어합니다. 아직도, HBV 풍토성 지구에 있는 사람들의 수는 바이러스를 제거하고 그 후에 만성 개별로 변환할 수 없습니다. 전 세계 만성 환자(>2억 5천만 명)의 25% 이상이 진행성 간 질환을 일으켜 간경변 및/또는 간세포암종(HCC)을 초래합니다1. 그 결과, 고집이 세게 감염된 세포의 박멸은 유효한 백신2가 있고 수많은 항바이러스 약이 개발되고 있더라도 일반적인 건강 문제 남아 있습니다. HBV 감염을 위한 표준 처리는 IFN-α, 뉴클레오시드, 및 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 이 에이전트는 직접적인 항 바이러스 활성 및 면역 조절 용량. 그럼에도 불구하고, HBe 항원(Ag)+담체의 혈청 변환(Ab) 및 혈청 HBV 데옥시리보핵산(DNA)의 손실은 치료된 환자의 약 20%에서 개별적으로 나타나며, 바이러스의 전체 면역학 적 대조군 BBsAg의 박탈에 의해 확인은 더 이상 5 %3입니다. 또한 치료에 대한 반응은 종종 내구성이 없습니다. 재조합 HBs Ag를 가진 예방 백신 접종은 감염 예방에 매우 효과적이지만 치료적 HBs Ag 예방 접종은 효과적이지 않습니다. 명확 하 게, T 세포 매개 면역 반응 HBV 감염 및 간 손상 제어에 중요 한 역; 그러나, 만성 간염 환자에서, HBV 반응성 T 세포는 수시로 삭제됩니다, 역기능, 또는 소모된4,5,6. 따라서, 지속적인 HBV 감염을 가진 개인에서, 항 바이러스 요법, 면역 조절 사이토 카인, 또는 치료 예방 접종을 통해 HBV 특이적 면역 (즉, T 세포 기반 면역)을 회복하려는 시도는 성공하지 못했습니다.

HBV Ag 특이적 T 세포의 입양 세포 전달(ACT)은 결국 남은 간세포 wih HBV7,8을박멸하도록 지시된 효율적인 치료법이다. HBV 감염 마우스내의 HBV 특이적 CTLs의 ACT는 간세포에서 과도, 경증 간염 및 HBV 리보핵산(RNA) 전사체의 극적인 하락을 유발하는 것으로 나타났다. 이러한 연구에서 CTL은 HBV 유전자의 전사를 억제하지 는 않았지만 HBV 전사체9의분해를 향상시켰습니다. HBV 특이적 CTL은 바이러스 감염을 방지하고 HBV10,11의클리어런스를 중재하는 데 중요합니다. ACT 기반 요법의 경우, 생체 내 재정착을 위한 높은 반응성을 가진 HBV 특이적 T 세포의 시험관 내 확장은 이상적인 방법12,13,14; 그럼에도 불구하고, 현재의 접근법은 잠재적인 치료를 위해 환자에게서 HBV 특이적 T 세포의 적절한 수량 및 자질을 생성, 분리 및 성장시키는 능력에 관하여 제한됩니다.

임상 시험은 HBV 바이러스 감염 간세포에 특정엔지니어링 T 세포를 통해 세포 기반 치료의 안전성, 실용성 및 장래 치료 활성을 제시하지만, 불리한 효과에 대한 걱정이 있습니다. T 세포 수용체(TCR)15,16,비특이적 TCR17 및 키메라 Ag 수용체에 의한 오프-타겟 오프 독성에 의한 교차 반응성으로 인해 자가면역 반응에서 발생(CAR) 18세 , 건강한 조직19개. 현재, 생체 내에서 단기 지속성만을 가지는 유전자 변형 T 세포는 일반적으로 중간 또는 이후의 이펙터 T 세포이다. 현재까지 다능성 줄기세포(PSC)는 순진한 단일형 Ag-특이적T세포(20,21,22,23)의높은 숫자를 생성할 수 있는 유일한 공급원이다. 유도된 PSCs (iPSCs)는 몇몇 전사 인자의 유전자 전달의 사용을 통해 환자의 체세포에서 단순히 변환됩니다. 그 결과, iPSCs는 배아 줄기 세포(ESCs)24와유사한 특성을 갖는다. 자기 갱신하는 무한한 능력에 대한 유연성과 가능성으로 인해, 조직 교체 이외에, iPSC 기반 치료는 재생 의학에서 널리 적용될 수 있다. 게다가, 근본적인 iPSCs연대는 현재 세포 기지를 둔 치료를 실질적으로 향상할 수 있습니다.

이 방법의 전반적인 목표는 ACT 기반 면역 요법을 위한 iPSC(즉, iPSC-CTL)로부터 다량의 HBV 특이적 CTL을 생성하는 것이다. 대체 기술에 비해 장점은 HBV 특이적 iPSC-CTL이 단일 유형 TCR 및 순진한 표현형을 가지고 있다는 것입니다. HBV 특이적 iPSC-CTL의 ACT는 간에서 기능성CD8+ T 세포의 이동을 증가시키고 투여된 마우스의 간 및 혈액 모두에서 HBV 복제를 감소시킨다는 것이 입증되었다. 이 방법은 HBV 면역 요법을 위한 바이러스 Ag 특이적 iPSC-CTL의 잠재적사용을 밝히고 바이러스 면역요법을 위한 다른 바이러스 성 Ag 특이적 iPSC-T 세포를 생성하도록 적응될 수 있다.

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프로토콜

모든 동물 실험은 텍사스 A&M 대학 동물 관리 위원회(IACUC; #2018-0006)의 승인을 받았으며, 실험실 동물 관리 협회의 평가 및 인증 가이드라인에 따라 수행됩니다. 생쥐는 생후 6-9주 동안 사용된다.

1. iPSCs에서 바이러스 성 Ag 특이적 CD8+ T 세포의 생성 (iPSC-CD8+ T 세포)

  1. 레트로바이러스 구조의 창조
    참고: TCR α 및 β 유전자는 2A 자가 절기 서열과 연결됩니다. 레트로바이러스 벡터 MSCV-IRES-DsRed(MiDR)는 DsRed+ 23입니다.
    1. 서브 클론 HBs183-191 (FLLTRILTI)-특이적 A2 제한 인간-뮤린 하이브리드 TCR(s183 TCR) 유전자(Vα34 및 Vβ28)를 MiDR 내로 생성하여 s183 MiDR 구문(도1A)25.
  2. 레트로바이러스 전이
    참고 : 플래티넘-E (Plat-E) 세포는 레트로 바이러스 (운반 s183 TCR 유전자)를 포장하는 데 사용되며, 이는 레트로 바이러스 성 전션에 사용됩니다. Plat-E 세포는 293T 세포의 근간이 되는 효과적인 레트로바이러스 패키징 세포이며, 이는 개그, 폴 및 에코트로픽 을 포함하는 레트로바이러스 구조 단백질을 발현하기 위해 EF1α 프로모터를 통해 독특한 패키징 구성을 통해 개발되었다.
    1. 100 mm 배양 접시상에, 종자 3 x 106 Plat-E 세포를 DMEM 배양 배지의 8 mL에서 10% 태아 송아지 혈청(FCS)을 37°C에서 인큐베이터에서 5%CO2,1일 전에 형질감염 전에 함유한다.
    2. 0일째에, s183 MiDR 생성물을 DNA 형질감염 시약25를사용하여 Plat-E 세포내로 트랜스펙트한다.
    3. 1일째, 종자 1 x 106 iPSCs(GFP+)를젤라틴 사전 코팅 배양 플레이트에 넣는다.
    4. 2-3일, 1,6-디브로모펙산용액(25)의 존재 하에서 s183 TCR을 사용하여 iPSCs를 트랜스듀싱하기 위해 Plat-E 세포 배양으로부터 레트로바이러스 함유 상상을 수집한다.
    5. 4일째에, s183 TCR 유전자 변환 iPSCs, 원심분리기 400 x g에서 5분 동안 및 종자 3× 105 iPSCs를 3 x 106 조사된 SNL76/7(irSNL76/7) 피더셀25로미리 코팅하였다.
    6. 합류의 5 또는 6 일째에, 세포를 트립시니화하고, 400 x g에서 5 분 동안 원심 분리기를 하고 세포 선별을 처리합니다. 고속 세포 선별기를 사용하여 살아있는 세포에 게이팅, 정렬 GFP 및 DsRED 이중 양성 세포 (s183 TCR 유전자 변환 iPSCs). 단계 1.2.5와 유사하게, 향후 사용을 위해 irSNL76/7 피더 셀에 정렬된 세포를 공동배양25.
  3. HBV 특이적 iPSC-CD8+ T 세포의 분화
    참고: OP9-DL1/DL4 기질 세포는 노치 리간드 DL1 및 DL4를 모두 과발현하고, iPSCs와 함께 iPSC를 공동 배양하여 노치 시그널링 매개 T 셀 분화를 촉진할 수있다(26).
    1. 20% 태아 소 혈청(FBS)을 함유하는 α-최소 필수 배지(MEM) 배지에서 OP9-DL1-DL4 세포 단층에서 s183 TCR 유전자-트랜스듀싱 된 iPSCs(s183/iPSCs)를성장시27. 배양물에서 뮤린 Flt3 리간드(mFlt-3L; 최종 농도 =5 ng/mL)를 포함한다.
    2. 0일째에, 종자 0.5-1.0 x 105 S183/iPSCs를 OP9-DL1-DL4 세포로 이전에 재배한 10cm 배양 접시에. OP9-DL1-DL4 셀이 80%-90% 동률 상태인지 확인합니다.
    3. 5일째에, 10 mL의 인산완충식염수(PBS)로 iPSC를 헹구고, PBS를 흡인하고, 이를 0.25% 트립신의 4 mL에 첨가하고, 37°C 인큐베이터에서 10분 동안 인큐베이터에 인큐베이터를 추가한 후, iPSC 매체의 보충 8 mL을 추가하여 트리피통을 종료한다. 15-30 °C에서 5 분 동안 400 x g에서 세포및 원심 분리기를 포함하는 모든 소화 용액을 축적합니다.
    4. iPSC 매체의 10 mL에서 상부 및 재중단 세포를 흡인한다. 세포 현탁액을 새로운 10 cm 페트리 플레이트로 옮기고 37°C에서 30분 동안 인큐베이터에 인큐베이터로 인큐베이터한다.
    5. 30분 후, 부동 세포를 포함하는 iPSC 미디어를 수집한다. 70 μm 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 통과시키고 세포 번호를 계산합니다.
    6. 종자 5 x 105 배양 접시에서 이전에 성장한 OP9-DL1-DL4 세포는 단계 1.3.1에 기재된 바와 같이 80%-90% 동시성의 상태를 갖는다.
      참고: T 세포 분화를 위해, 각 2-3일, iPSC 유래 세포는 OP9-DL1-DL4 세포의 신선한 층으로 다시 시드할 필요가 있다.
  4. 평가
    1. 차별화iPSCs의 형태학적 변화
      1. 다양한 날에 현미경으로 세포를 관찰하십시오.
        참고: 5일째까지, 콜로니는 중추와 같은 특성을 가지며, 인간의 진피 섬유아세포와 체외에서 지속적인 성장을 닮은 고전적인 스핀들 모양의 형태를 나타낸다. 8일째가 되면 작은 둥근 세포 클러스터가 나타나기 시작합니다.
    2. 유세포측정에 의한 iPSCs 차별화 분석
      1. 상술한 바와 같이, iPSC 유래 세포를 분석하는 다양한 날에25일(도 1B,C).
    3. 차별화된 iPSCs의 기능 분석
      1. 공동 배양의 28 일째에, 부동 세포를 수확을 통해 배양에서 iPSC-CD8+ T 세포를 수집하고, 0.25 % 트립신으로 남은 세포를 트립시노이즈하고, iPSC 배지의 8 mL에서 다시 중단하고, 15-30 °C에서 400 x g에서 5 분 동안 원심 분리, 미디어를 제거하고, 10 mL의 미디어에서 셀을 다시 일시 중단합니다.
      2. 다시 부유 세포를 37°C 인큐베이터에 신선한 10 cm 접시에 30분 동안 보관하고 부동 세포를 조립한다. 그런 다음 차가운 PBS로 세포를 한 번 헹구고 있습니다.
      3. H-2 클래스I 녹아웃의 비장으로부터 3 x 106 T 세포 고갈 비장(CD4-CD8-)을 배양하고, HLA-A2.1-형질전환(HHD) 마우스를 5 μM s183 펩티드(FLLTRILTI)를 4°C에서 200 μL에서 30분 동안 300°C로 배양하였다.
      4. s183 펩티드로 펄스 된 비장 세포와 iPSC-CD8+ T 세포의 혼합물을 생산 (T 세포 : 비장 세포 = 1:4; 0.75 x 106 T 세포를 사용). CO2 인큐베이터에서 37°C에서 세포의 혼합물을 40시간 동안 배양한다. 마지막 7 시간 동안, 희석 된 brefeldin A 의 4 μL을 배양 (1x 배양 배지에서 희석 될 1,000x의 최종 농도)을 추가하여 세포 활성화 중에 수송 과정을 차단합니다.
      5. 앞서 설명한 바와 같이 세포를 염색하고 세포내 IFN-γ의 유동 세포분석 분석을 수행한다(도2).

2. HBV 플라스미드의 유체 역학 전달을 통한 HBV 복제 유도

참고: pAAV/HBV1.2 구문은 앞서9. HBV 1.2 완전한 DNA는 벡터 pAAV에 통합된다.

  1. 꼬리 정맥을 통해 HBV 플라스미드의 유체 역학 전달
    1. 꼬리 정맥을 팽창시키기 위해 케이지에서 5 분 동안 열 램프를 사용하여 HHD 마우스를 가열합니다.
    2. 동물을 제지하여 억류하고 70 % 에탄올 스프레이로 마우스 꼬리를 청소하십시오.
    3. 간으로 플라스미드의 전달.
    4. 측정 척도를 사용하여 마우스 체중을 측정합니다.
    5. HBV 플라스미드의 10 μg를 체질량 PBS의 8% 상당으로 희석한다(예를 들어, 20 g 마우스의 경우 1.6 mL). 희석된 플라스미드를 26 G × 1°12 "(0.45 × 12 mm) 피하 주사바늘로 3 mL 주사기에 적재하였다.
    6. 꼬리의 중간 3 분의 1에 있는 두 개의 측면 꼬리 정맥 중 하나를 찾아 바늘을 양쪽 정맥에 놓습니다. 3- 5s 내의 꼬리 정맥을 통해 HBV 플라스미드를 함유하는 주사를 투여한다.
  2. 감염된 마우스의 혈액 혈청에서 혈혈의 정량화
    참고: HBV 복제는 마우스 세럼에서 3-35일째부터 발생합니다. DNA 복제는 7일째에 정점에 이르고 점차적으로 감소합니다. HBV DNA는 35일까지 혈청에서 삭제되지 않습니다.
    1. 감염된 마우스에서 혈액 혈청의 수집
      1. 각 마우스로부터 3, 5, 7 및 10일 후 감염 후 1.5 mL 의 미세원심지 튜브에서 약 0.1 mL의 혈액을 수집한 다음, 실온(RT)에서 20분 동안 배양한다.
      2. 샘플을 4°C에서 15분 동안 6,000 x g에서 원심분리하고 원심분리 후 혈청 상류를 수집한다.
    2. 제조업체의 권고에 따라 시판되는 DNA 추출 키트를 사용하여 혈액 혈청에서 DNA를 정화합니다. 간략하게, 실리카 계 열에서 세포를 용해시키고, 용출 컬럼에 100% 에탄올을 첨가하고, 6000 x g에서 원심분리하여 DNA를 추출하여 1분 동안 RNase-free 물 50 μL에서 DNA를 엘루트한다.
    3. 실시간 PCR 분석을 위해 용출에서 100 ng의 HBV DNA를 사용하십시오. 다음 프라이머 및 프로브를 사용: 앞으로 5' TAGGAGGCTGTAGGATAATGG 3'; 리버스 5' GCACAGCTTGGAGGTGT 3'; 프로브 5' TCACCTCTGCCTAATC 3'.
      1. 표준 곡선에 플라스미드(pAAV/HBV1.2)를 함유하는 HBV 게놈을 사용하고 총 부피 10 μL(그림3)에서실시간 PCR을 수행합니다.
    4. 표 1에나타낸 바와 같이 총 부피 10 μL로 PCR 반응을 설정한다.
    5. 표 2에표시된 대로 열전자전거에서 PCR 프로그램을 설정합니다. 프로그래밍된 온도 전이 속도는 변성/어닐링을 위한 20°C/s, 확장의 경우 5°C/s입니다. 실시간 PCR 모니터링을 위해 각 주기에 대한 어닐링 단계의 끝에서 형광을 측정합니다.

3. 바이러스 성 Ag 특이적 iPSC-CD8+ T 세포의 ACT에 의한 HBV 복제 감소

  1. 입양 세포 전달 (ACT)
    1. 섹션 1.3에 기재된 바와 같이 8일 동안 mFlt-3L 및 mIL-7의 존재 시 OP9-DL1-DL4 기질 세포상에서 s183/iPSCs(1.3.7)를 분화한다.
    2. 22일째에 트립신을 가진 10cm 플레이트에서 iPSC-CD8+ T 세포를 수집한 다음, 신선한 매체 10 mL에서 각 10cm 플레이트를 세척하고 다시 놓습니다. 세포를 신선한 10cm 플레이트에 넣고 섹션 1.3에서와 같이 30 분 동안 인큐베이터로 돌아갑니다. 30 분 후, 부동 세포를 수집합니다.
    3. 70 μm 나일론 여과기를 사용하여 세포를 통과하여 세포 클러스터를 제거하고 셀 수를 계산합니다. 차가운 PBS 용액에서 세포를 1.5 x 107 셀 /mL의 농도로 조정하고 70 μm 나일론 스트레이너를 사용하여 필요한 경우 세포 클러스터를 다시 제거하기 위해 세포를 통과시십시오. ACT가 될 때까지 얼음에 세포를 보관하십시오.
    4. 꼬리 정맥을 통해 4-6 주 된 HHD 마우스에 200 μL 세포 현탁액 (3 x 106 세포)을 주입합니다.
  2. HBV 복제 유도
    1. 세포 전달 후 14일째에, 섹션 2.1에 기재된 바와 같이 꼬리 정맥을 통해 HBV 플라스미드의 유체역학적 전달을 수행한다.
  3. 감염된 간에서 바이러스 단백질 검출
    1. 3일, 5일, 7일, 14일, 및 21일 감염 후 마우스를 희생한다. 안락사의 경우 각 케이지에서 첫 번째 단계에서 1-2 L의 이산화탄소(CO2)를사용하십시오. 동물이 의식 상실을 일으키면CO2 유량을 약 4-5 L/min.CO2 흡입을 사용하여 마우스 안락사를 수행합니다.
    2. 가위와 집게를 사용하여 복막의 표면 피부를 절단하고 약간 복강을 안감 내부 피부를 밝히기 위해 다시 간을 드래그하여 간을 분리. 감염된 마우스의 간 샘플(길이 x 너비 x 높이 = 0.5 cm x 0.5 cm X 0.3 cm)을 수집하고 절단하여 삽입 카세트에 쉽게 맞고 4-24시간 동안 10% 중성 완충포민으로 차단한다.
    3. 간 샘플을 decalcify2.5 M 포름산을 사용; 자일렌을 3분 간 헹구고, 100% 에탄올로 2x 헹구고, 95% 에탄올로 2x 헹구고, 탈이온화(DI) 물로 2분 간을 헹구고, 1mm 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA)에서 간 시료를 분해합니다. 20 분 동안 하위 끓는 온도 (90 °C)에서 처리합니다.
    4. 고정 된 간 조직을 30 분 동안 식히고 4 분 동안 1 x PBS로 조직을 헹구고 파라핀에 조직을 포함시면됩니다. 물을 대체하기 위해 에탄올의 농도가 증가하는 일련의 조직을 탈수한 다음 자일렌 침지물에 담급합니다. 침투 된 조직을 왁스 블록에 포함시킴. 얼룩을 위해 수직 및 수평 단면을 고르게 만드십시오. 슬라이딩 마이크로토메로 4 μm 섹션을 준비합니다.
    5. 자일렌과 에탄올을 사용하여 탈파화 및 재수화를 통해 섹션을 통과한 다음 섹션의 면역 형광 염색을 수행합니다.
    6. HBV 표면 Ag 특이적 항체의 200 μL로 단면을 염색합니다(차단 용액에서 1:100 희석). 75% -100 % 가습 챔버에서 RT에서 2 시간 동안 항체로 섹션을 배양하고 5 분 동안 1 x PBS에서 5 x를 씻습니다.
    7. 4',6-디아미디노-2-페닐린들올레(DAPI)를 함유한 안티 페이드 시약을 사용하여 핵 염색을 하여 슬라이드에 대항하십시오. 희석된 DAPI 염색 용액(1x PBS에 300 nM)의 약 300 μL로 커버슬립을 추가하고 커버슬립 전체를 확인합니다. 형광 현미경으로 검사 할 때까지 4 °C에서 어둠 속에서 슬라이드를 유지합니다.
  4. 감염된 마우스의 염증성 세포 침투
    1. 3.3.1단계에서 기재된 바와 같이 마우스를 희생한다. 간을 수집하고 단계 3.3.4에 설명 된 대로 섹션을 합니다.
    2. 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 섹션을 염색하여 염증세포가 간으로 침투하는 것을 평가합니다.
    3. 형광 현미경하에서 추가 분석이 될 때까지 4 °C에서 어둠 속에서 슬라이드를 저장합니다.
    4. 형광 현미경으로 슬라이드를 시각화하여 염증 세포가 간으로 침투하는 것을 감지합니다(그림4).
  5. 감염된 간에서 HBV DNA 검출
    1. 바이러스 DNA의 격리.
    2. 마우스를 안락사시키고 섹션 3.3에 따라 간 샘플을 수집한다.
    3. 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 노닌데트 P-40(NP-40) 용해 완충제(50 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, 1% NP-40)에서 간 조직을 리세.
    4. 16,000 x g에서 잠시 원심분리기를 사용하여 핵 및 세포 파편을 제거합니다.
    5. 세포질 용해액을 마이크로코칼 뉴클레아제(nuclease S7; 150 단위/mL)로 배양하고 37°C에서 CaCl2(5 mM)를 90분 동안 배양하여 핵산을 외부뉴클레오캡시드(NIC)로 분해합니다.
    6. 10 mM EDTA를 첨가하여 뉴클레아제 S7을 비활성화한다.
    7. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)으로 뉴클레오캡시드를 침전시키고, 0.5 % 나트륨 도데실 황산염 (SDS)을 방해하고, 37 °C에서 0.6 mg / mL 단백질 분해제 K (PK)로 소화합니다.
    8. 페놀 클로로폼 추출 및 에탄올 침전으로 바이러스 성 핵산을 회수한다.
    9. 추출된 바이러스 DNA를 1.2% 아가로즈 겔에서 해결하고32개의 P 표지된 HBV DNA 프로브를 사용하여 표준 남부 얼룩 분석을 통해 검출합니다.

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결과

여기에 도시된 바와 같이, HBV 바이러스 성 Ag 특이적 iPSC-CD8+ T 세포는 시험관 내 배양 시스템에 의해 생성된다. 이러한 바이러스 성 Ag 특이적 iPSC-CD8+ T 세포의 ACT 후 실질적으로 뮤린 모델에서 HBV 복제를 억제한다(보충파일 1). 마우스 iPSC는 인간 마우스 하이브리드 HBV TCR 유전자를 코딩하는 MIDR 레트로바이러스 구조체(HBs183-191-specific,s183)로 변환된 다음, 유전자 변환된 iPSC는 노치 리간드를 발현하는 OP9-DL1/DL4 세포와 공동 배양된다(DL1 및 DL4 모두). rFlt3L 및 rIL-7이 있는 분자. 시험관내 공동 배양의 28일째에, iPSC 유래 세포는 실질적으로 CD3 및 Ag 특이적 TCR(T 세포 마커)을 발현한다. CD3+CD8+ 집단의 유세포 분석에서는 HBV TCR 전치가 바이러스 성 s183 특이적

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토론

이 프로토콜은 뮤린 모델에서 HBV 복제를 억제하기 위해 ACT로서 사용하기 위한 바이러스 성 Ag 특이적 iPSC-CTL을 생성하는 방법을 제시한다. 만성 HBV 감염에서, 바이러스 게놈은 간세포의 수명 내내 지속될 수 있는 안정적인 미니 염색체, 공유 폐쇄된 원형 DNA(cccDNA)를 형성한다. 바이러스성 미니 염색체의 정리를 표적으로 하는 것은 만성 HBV 감염의 치료 귀착될 수 있습니다. 현재 항바이러스 요법은 바이러스 역전사를 표적으로 하지만 cccDNA에 의해 구동되는 HBV 복제에 대한 면역학적 제어를 거의 확립하지 않습니다. HBV 특이적 CD8+ CTL은 감염된 간세포의 살해를 중재하고 cccDNA의 클리어런스를 가속화할 수 있다. 그럼에도 불구하고, HBV 특이적 CTL은 만성 HBV 감염을 가진 환자에서 삭제, 기능 장애, 또는 고갈에 굴복한다. HBV 특이적 CTL을 가진 ACT는 만성 HBV 감염28,

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

저자는 HBs183-91 (s183)에 대한 cDNA를 제공하는 토론토 종합 병원 연구소에서 박사 아담 J Gehring 감사 (FLLTRILTI)- 특정 A2 제한 인간 - 뮤린 하이브리드 TCR 유전자, 및 제공에 대한 국립 대만 대학에서 박사 페이 - 저 첸 pAAV/HBV 1.2 구문. 이 작품은 J. S에 건강 보조금 R01AI12180, R01CA221867 및 R21AI109239의 국립 연구소에 의해 지원됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
HHD 마우스Institut Pasteur, Paris, FranceH-2 class I knockout, HLA-A2.1-transgenic (HHD) 마우스
iPS-MEF-Ng-20D-17RIKEN Cell BankAPS0001
SNL76/7ATCCSCRC-1049
OP9ATCCCRL-2749
pAAV/HBV1.2 plasmidDr. Pei-Jer Chen (대만 국립 대만 대학 병원)HBV DNA 구성
HBs183-91(s183) (FLLTRILTI) 특이적 TCR 유전자Dr. Adam J Gehring (Toronto General Hospital Research Institute, Toronto, Canada)FLLTRILTI 특이적 A2 제한 인간-쥐 하이브리드 TCR 유전자(Vα 34 및 Vβ 28)
OVA257– 264-specific TCR genesDr. Dario A. Vignali (University of Pittsburgh, PA)SIINFEKL 특이적 H-2Kb-restricted TCR 유전자
Anti-CD3 (17A2) 항체Biolegend100236
Anti-CD44 (IM7) 항체BD Pharmingen103012
Anti-CD4 (GK1.5) 항체Biolegend100408
Anti-CD8 (53-6.7) 항체Biolegend
안티 IFN-&감마; (XMG1.2) 항체Biolegend505810
Anti-TNF-a (MP6-XT22) 항체Biolegend506306
α-MEMInvitrogenA10490-01
Anti-HBs 항체Thermo FisherMA5-13059
ACK 용해 완충액Lonza10-548E
Brefeldin ASigmaB7651
DMEMInvitrogenABCD1234
FBSHycloneSH3007.01
FACSAria Fusion 세포 분류기BD656700
젤라틴MilliporeSigmaG9391
GeneJammerAgilent204130
HLA-A201-HBs183-91-PE 펜타머ProimmuneF027-4A - 27
HRP 안티 마우스 2차 항체InvitrogenA27025
mFlt-3LPeprotech250-31L
mIL-7Peprotech217-17
Nuclease S7Roche10107921001
ParaformaldehydeMilliporeSigmaP6148-500G주의: 알레르기성, 발암성, 독성
투과화 완충액Biolegend421002
PolybreneMilliporeSigma107689
ProLong™ DAPIInvitrogenP36931
QIAamp MinElute 바이러스 스핀 키트Qiagen57704
100732이 포함된 골드 안티페이드 마운트,,

참고문헌

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