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방법 논문

포도당-6-인산염 이사머라제(G6PI)-유도 RA 마우스에서 iNKT 세포의 입양 면역 요법

6.5K 조회수

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DOI:

10.3791/60048

⸱

2020년 1월 31일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Medical School of Hebei University, 2Key Laboratory of Pathogenesis Mechanism and Control of Inflammatory-Autoimmune Diseases in Hebei Province

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 G6PI 혼합 펩티드를 사용하여 CD4+ T 세포 및 사이토카인에서 인간 류마티스 관절염에 가까운 류마티스 관절염 모델을 구성합니다. 고순도 불변 성 천연 킬러 T 세포 (주로 iNKT2) 특정 표현형 및 기능을 가진 채택 면역 요법에 대한 생체 내 유도 및 체외 정제에 의해 수득되었다.

초록

류마치스성 관절염 (RA)는 복잡한 만성 선동적인 자기 면역 질병입니다. 질병의 병인은 불변 자연 살인자 T (iNKT) 세포와 관련이 있습니다. 활성 RA를 가진 환자는 Th1의 더 적은 iNKT 세포, 불완전한 세포 기능 및 과도한 편광을 제시합니다. 본 연구에서, RA 동물 모델은 hGPI325-339 및 hGPI469-483 펩티드의 혼합물을 사용하여 확립되었다. iNKT 세포는 생체 내 유도 및 체외 정제에 의해 수득되었고, 이어서 입양 면역 요법을 위해 RA 마우스내로 주입하였다. 생체 내 이미징 시스템(IVIS) 추적은 iNKT 세포가 주로 비장과 간에서 분포되었다는 것을 밝혔다. 세포 치료 후 12일째에, 질병 진행이 현저히 둔화되고, 임상 증상이 완화되었고, 흉선내 iNKT1 세포의 풍부도가 증가하고, 흉선에서 iNKT1의 비율이 감소하고, TNF-α, IFN-γ 및 IL-6의 수준이 감소하였다. 혈청이 감소했습니다. iNKT 세포의 입양 면역 요법은 면역 세포의 균형을 회복시키고 신체의 과도한 염증을 교정했습니다.

서론

류마치스성 관절염 (RA)는 0.5-1% 부각1,2를가진 만성, 진보적인 침략을 특징으로 하는 자기 면역 질병입니다. 기본 병인은 자가 반응성 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 비정상적인 증식에 기인하며, CD4+IFN-γ+ 및 CD4+IL-17A+ T 세포의 비율의 증가에 의해 나타나며, CD4+IL-4+ 및 CD4 + CD25+FoxP3+T 세포의 감소 된 수에 기인한다. 따라서 염증성 사이토카인의 분비가 증가하고 과도한 염증 반응이 신체의 면역 계통의 기본 균형과 내성 기능을 파괴합니다. 더욱이, 조인을 관통하는 도우미 T 림프구(Th) 1 세포는 염증 반응 및 관절 손상을 악화시다. 따라서 과도한 염증 반응의 억제와 면역 내성 및 면역 균형의 회복은 RA3,4의치료에 핵심이다.

iNKT 세포는 NK 세포 및 T 세포 기능 및 특성을 모두 갖는다. iNKT 세포는 제한된 TCR β 사슬 레퍼토리5를 가진 뚜렷한 불변 T 세포 수용체(TCR) α 사슬을 항원 제시 세포의 표면에 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I 분자 CD1에 의해 제시된 글리콜리파이드 항원을 인식한다. 미츠오 외6은 RA를 포함한 많은 자가면역 질환에서 다수의 iNKT 세포 및 기능적 결함을 검출하였다. Aurore등. 7은 iNKT 세포가 자가면역 내성을 유지하는 데 긍정적인 영향을 미치고 iNKT 세포의 수와 기능이 회복되면 질병이 완화된다는 것을 입증했다. 또한, Miellot-Gafsou 외8 iNKT 세포는 질병을 폐지할 뿐만 아니라 질병의 진행을 증가시키는 것을 발견하였다. 이러한 모순된 결과는 iNKT 세포가 이기종 T 세포이며, 상이한 서브세트의 기능이 역전될 수 있음을 시사한다. RA의 임상 연구에서, iNKT 세포의 빈도는 질병 활성의 점수와 상관관계가있다 9. 결과는 또한 RA 환자에서 iNKT의 빈도가 감소하였고, CD4+IFN-γ+ T 세포 서브세트의 수가 증가하고, 염증성 사이토카인 IFN-γ 및 TNF-α의 분비 수준이 10,11증가함을 확인하였다. 또한, 샤리프 외12형 당뇨병(T1D)을 조사하고 iNKT 세포의 선택적 주입이 염증성 사이토카인 IL-4의 발현을 업테비제, 면역 내성을 유지하고, 제1형 당뇨병의 발병을 방지한 것으로 나타났다. 따라서, 특정 iNKT 세포의 채택 주입 또는 iNKT 세포의 표적화 활성화는 RA 환자에서 iNKT 세포의 수준을 증가시켜, 이는 RA 치료에서 돌파구가 될 수 있다.

세포 면역 요법은 현재 큰 관심사이며 암 치료에 널리 사용되어 왔습니다. 그러나, iNKT 세포는 희소하고 이기종 면역 조절 세포(총 PBMC 수의 0.3%에불과)(13)로잠재적임상 적용을 제한한다. 이들 세포는 주로 3개의 소집단으로 나뉜다: 1) iNKT1 세포, 이는 골수성 백혈병 아연 핑거 단백질(PLZF) 및 T-박스 전사 인자(T-bet)의 높은 발현을 갖는다; 2) PLZF 및 GATA 결합 단백질 3(GATA3)의 중간 발현을 가진 iNKT2 세포; 3) PLZF 및 레티노이드 관련 고아 핵 수용체(ROR)-γt의 발현이 낮은 iNKT17 세포는 IFN-γ, IL-4 및 IL-1714를분비한다. 활성화된 iNKT 세포는 iNKT세포(15)의상이한 면역조절 효과를 결정하는 Th1, Th2 및 Th17 유사 사이토카인을 분비한다. iNKT 세포의 다양한 하위 집단의 특정 활성화의 면역 조절 및 면역 치료 효과는 상이하다. 따라서, 신체의 면역 반응을 조절하는 항염증 기능을 가진 iNKT 세포(주로 iNKT2)의 특정 표현형의 선택은 RA에서의 면역 불균형 및 면역 장애를 교정할 수 있다.

이상적인 동물 모델의 확립은 RA 병인의 치료 및 연구에 큰 의미가 있다. 현재, 가장 일반적으로 사용되고 성숙한 동물 모델은 콜라겐 유도 관절염, 보조 관절염, 자이모산 유도 관절염, 및 다당류 유도 관절염 을 포함한다16–17. 그러나 인간 RA의 모든 기능을 완전히 시뮬레이션할 수 있는 모델은 없습니다. 타입 II 콜라겐 유도 관절염 (CIA)는 고전적인 관절염 모델입니다. CIA는 이 질병 모델의 항체 의존성을 반영하는 타입 II 콜라겐 특이적 단일클론 항체를 가진 마우스의 면역화에 의해 유도된다. Benurs 등은 글루코스-6-인산염 이소머라아제(G6PI)에 대한 전신 면역 반응을 가진 모델을 기술하였는데, 이는 영향을 받기 쉬운 마우스 균주18,19에서말초 대칭 다발성 관절염을 유도한다. 이 모델에서 관절염의 발달은 T 세포, B 세포 및 선천성 면역18,19,20에달려 있습니다. 호리코시21은 G6PI 폴리펩티드 단편을 가진 DBA/1 마우스의 면역화로 인한 RA 모델이 CIA 모델보다CD4+ T 세포 및 사이토카인(즉, IL-6 및 TNF-α)의 관점에서 인간 RA와 더 유사하다는 것을 발견하였다. TCR 인식 부위에 대한 자극 효과를 높이기 위해, G6PI(hGPI325-339 및 hGPI469-483)의 혼합 폴리펩티드 단편을 사용하여 RA 마우스 모델을 구성하기 위해 DBA/1 마우스를 면역화하였다. hGPI325-339 및 hGPI469-483이 I-A q 제한 T 세포 반응에 대한 면역 지배적이기 때문에 이러한 접근법의 성공률은 높을 수 있다. 따라서, 이 모델은 RA 환자22에서CD4+ T 세포 및 iNKT 세포 결함의 과확산을 시뮬레이션할 수 있다. RA 면역 병리학의 기초 연구는 우리의 추가 심층적인 조사를 위한 기초를 놓았습니다.

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프로토콜

모든 실험 마우스(총 150마리)는 건강한 수컷 DBA/1 마우스, 6-8주 령(20.0±1.5 g)으로, 특정 병원균이 없는(SPF) 환경에서 사육하였다. 모델링 하기 전에 특별한 처리가 없습니다. 실험은 건강한 대조군(15마우스), 모델 대조군(15마우스), 세포치료군(55마우스)으로 나누었다. 이 연구는 허베이 대학의 동물 복지 및 윤리위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 질병 모델 구축

  1. RA 동물 모델 복제
    1. hG6PI 325-339 및 hG6PI 469-483 파편 모두 1.75 mg의 무게를 측정하고 4 °C의 5.25 mL의 삼중 증류수에 용해시면 됩니다.
    2. 50°C 수조에 완전한 Freund의 보조제(CFA)를 녹이고, 5.25 mL를 다른 10mL 원심분리기 튜브에 넣고 식힙니다.
    3. 두 개의 유리 주사기가 연결된 인공 유화 장치에 hG6PI 용액과 CFA 용액의 혼합물을 넣습니다.
    4. 주사기를 분당 10-20x의 일정한 속도와 주파수로 밀어 혼합 펩타이드 용액과 CFA 용액을 완전히 유화합니다. 얼음 욕조에서 작업을 수행하고 분산하지 않고 유화 완료 후 10 분 동안 물에 에멀젼 방울을 유지합니다.
    5. 유화 hG6PIs 150 μL을 마우스의 꼬리 뿌리에 피하로 주입합니다.
    6. hG6PI 주입 후 0 시간 및 48 시간에서 복강 내 로 200 mg의 인후 염 독소를 주입하십시오.
  2. RA 모델의 실험 검증
    1. 버니어 캘리퍼스(하루 2회)로 마우스 발의 두께를 측정합니다.
    2. 발의 발적정도를 관찰하고 표시한다. 다음 점수 기준을 사용: 1) 가벼운 붓기와 발가락; 2) 맑은 빨간 붓기와 도르섬 페디스와 발 패드; 3) 빨간 붓기와 발목.
    3. 1% 나트륨 펜토바르비탈 (50 mg/kg 체중)의 복강 내 주입에 의해 깊은 마취하에 마우스를 안락사시키고 HE 염색을 위해 발을 제거한 후 14일 후에.
    4. 제조자의 프로토콜에 따라 상업적세포측정 비드 어레이(CBA)를 사용하여 혈청 IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, TNF-α 및 IFN-γ의 분비 수준을 결정한다.

2. 입양 세포 치료로 iNKT 세포 획득

  1. iNKT 세포의 지향성 유도
    1. α-GalCer (체중 0.1 mg/kg)로 정상 마우스를 복강 내 주사하십시오.
  2. iNKT 세포의 격리
    1. 모델링 후 3 일, 마취를 위해 1 % 펜토 바르 비탈 (체중 50 mg / kg)으로 마우스를 복강 내 주사하십시오. 적당하게 마취된 마우스는 발가락 핀치에 대한 뒷발 철수 반응을 나타내지 않는다.
    2. α-GalCer로 복강 내 주사 후 DBA/1 마우스의 비장을 분리합니다. 200 메쉬 체로 비장을 절단하고 분쇄하여 단일 셀 현탁액을 준비합니다.
    3. 전지 현탁액을 PBS로 세척하고 원심분리기를 200 x g에서 5분 동안 세척하고 상한액을 폐기합니다. 반복.
    4. 전혈 및 조직 희석 액의 1 mL로 세포를 다시 중단하십시오. 3 mL의 마우스 림프구 분리 매체를 추가한 다음 실온에서 300 x g에서 20 분 동안 세포를 원심 분리합니다.
    5. 유백색 림프구층(즉, 위쪽에서 두 번째 층)을 수집하고, PBS로 2배 씻고, 자동 셀 카운터로 계산합니다.
  3. iNKT 세포 정제를 위한 자기 활성화 세포 선별(MACS) 양성 선택 전략
    참고: CD1d 테트라머의 전처리를 위해 α-Galcer 1 mg/mL을 200 μg/mL로 200 μg/mL로 트웬-20 및 NaCl의 0.9%로 희석하고, 생성된 용액의 5 μL을 CD1d 테트라머 용액의 100 μL에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 12시간 동안 배양하고 사용하기 위해 4°C에서 두었다. TCR β를 탈이온수로 80배 희석시켰다. 다른 모든 항체는 스톡 용액으로서 사용되었다.
    1. 4 °C PBS의 100 μL로 107 개의 세포를 다시 중단하고 α-GalCer로드 CD1d Tetramer-PE 10 μL을 추가하고 어둠 속에서 15 분 동안 4 °C에서 배양하십시오.
    2. 세포를 PBS로 2x 세척하고 PBS의 80 μL에서 다시 중단하십시오.
    3. 20 μL의 안티 PE-마이크로 비드를 추가하고 어둠 속에서 20 분 동안 4 °C에서 배양하십시오.
    4. PBS로 2x 세척하고 PBS 500 μL로 세포를 다시 일시 중단합니다.
    5. MACS 선별기의 자기장에 선별 컬럼을 놓고 PBS 500 μL로 헹구습니다.
    6. 2.3.4단계에서 셀 서스펜션을 정렬 컬럼에 추가하고 흐름을 수집하고 PBS 버퍼로 3x 헹구습니다.
    7. 자기장을 제거하고 정렬 열에서 셀을 수집합니다. 이 시점에서, 선별 컬럼에 1 mL의 PBS 버퍼를 추가하고, 표지된 세포를 수집 튜브로 구동하고 정제된 iNKT 세포를 얻기 위해 일정한 압력으로 플런저를 빠르게 밀어넣습니다. 자동화된 셀 카운터로 계산합니다.
  4. iNKT 세포 표현형의 식별
    1. 각각 2.2.5 단계와 2.3.7 단계에서 1 x 106 셀을 취하고 PBS의 50 μL에서 다시 일시 중단하십시오.
    2. 항체 배양: 음성 대조군 튜브에 항체를 첨가하지 말고, α-GalCer-PE-CD1d 테트라머의 0.5 μL 또는 단일 양성 대조군 튜브에 FITC-TCR β의 10 μL을 추가한다. α-GalCer-PE-CD1d 테트라머 0.5 μL과 샘플 튜브에 FITC-TCR β 10 μL을 추가합니다. 어둠 속에서 30 분 동안 4 °C에서 배양하십시오.
    3. PBS에서 세포를 씻은 다음 200 x g에서 원심 분리기를 5 분 동안 씻습니다.
    4. 상한체를 버리고, Foxp3 Foxation/Permeabilization 작업 용액 1 mL을 추가하고, 어둠 속에서 4 °C에서 45 분 동안 세포를 배양하십시오.
    5. 1 mL의 투과 버퍼 작동 용액을 추가하고 실온에서 500 x g의 세포를 5 분 동안 원심 분리합니다.
    6. 상급제는 버리십시오. 알렉사 플루어 647 마우스 안티 PLZF 1 μL을 추가하고 PerCP-Cy 5.5 마우스 안티 T-bet (또는 PerCP-Cy 5.5 마우스 안티 ROR...)의 1 μL을 어둠 속에서 실온에서 30 분 동안 추가하십시오.
    7. 청소를 위한 2mL의 퍼메빌화 버퍼 작동 솔루션을 추가합니다.
    8. 상급자를 버리고, PBS의 500 μL에서 세포를 다시 중단하고, 유세포 측정에 의해 측정한다.
  5. iNKT 세포의 기능적 식별
    1. 단계 2.3.7에서 3 x 106 iNKT 세포를 가져 와서 RPMI-1640 불완전한 배지 (즉, 혈청없이)의 1.5 mL로 12 개의 웰 플레이트에서 다시 중단하십시오.
    2. 포르볼 에스테르 (PMA, 50 ng/mL) 및 이오노마이신 칼슘 (IO, 1 μg / mL)을 추가하고CO2 인큐베이터에 24 시간 동안 놓습니다.
    3. 제조자의 프로토콜에 따라 상용 CBA 분석기를 사용하여 상층세포를 수집하고 IL-2, IL-17A, TNF-α, IL-6, IL-4, IFN-γ 및 IL-10의 분비 수준을 검출한다.
  6. RA 마우스에 있는 iNKT 세포의 이동 통로에 실험적인 연구 결과
    1. DMSO에서 DiR 염료(2.5 mg/mL)를 용해시.
    2. RPMI-1640 불완전한 배지로 6개의 웰 플레이트에 iNKT 세포를 다시 일시 중단합니다. 밀도는 1 × 106 셀 / mL입니다.
    3. DiR (5 μg / mL) 용액을 추가하고CO2 인큐베이터에 25 분 동안 배양하십시오.
    4. PBS로 세척하고 DiR 표지된 iNKT 세포(DiR-iNKT)를 얻기 위해 세포(3 x 10 6/300 μL)를 다시 중단한다.
    5. 1% 나트륨 펜토바르비탈 (50 mg/kg 체중)을 복강 내 로 주입하여 마우스를 마취시다. 적당하게 마취된 마우스는 발가락 핀치에 뒷발 철수를 보여주지 않습니다. 이미징을 위해 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 마우스 눈에 수의 연고를 적용하십시오.
    6. DIR-iNKT 세포를 8일 동안 RA 모델로 꼬리 정맥에 마우스당 3 x 106을 주입합니다. 마우스 사후 주입에서 iNKT 세포를 0분, 10분, 30분, 60분, 및 0일째(3시간 이후), 1, 3, 6, 12, 26, 34, 38, 및 42일 동안 생체내 이미징 시스템(IVIS)을 사용하여 모니터링한다. 사용된 여기 파장은 748 nm였고, 방출 파장이 780 nm였고, 노출 시간은 자동이었다.
    7. 각 마우스를 각 관찰 후 별도의 케이지에 놓고 흉골 의 힘을 유지합니다. 마취에서 회복 될 때까지 관찰하십시오.

3. iNKT 세포를 가진 RA 마우스의 입양 면역 요법의 평가

  1. RA 마우스를 위한 iNKT 세포 입양 면역 요법
    1. 꼬리 정맥을 통해 마우스 당 3 x 106 세포 iNKT 세포를 주입합니다. 무작위로 8일 전에 모델링된 15마리의 마우스를 선택하고 꼬리 정맥 주입에 의해 단계 2.3.7로부터 DiR 라벨링 없이 iNKT 세포를 얻었다.
  2. iNKT 세포에 대한 입양 면역 요법의 효능을 평가합니다.
    1. 마우스의 발의 두께를 측정하고, 발목 관절의 팽윤을 정량화하고, 단계 1.2.1-1.2.2에 기재된 바와 같이 iNKT 세포를 주입한 후 체계적으로 점수를 매겨 보세요.
    2. 1.2.3단계에서 기재된 바와 같이 마우스 관절의 염증성 세포 침투 및 관절 변화를 관찰한다.
    3. 단계 1.2.4에 기재된 바와 같이 IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, TNF-α 및 IFN-γ의 분비 수준을 결정한다.
  3. iNKT 셀 및 하위 집합의 빈도를 확인합니다.
    1. 마우스 흉선분리및 단일 세포 현탁액을 준비한다.
    2. 림프구를 림프구 분리 액으로 분리하십시오.
    3. 단계 2.4에 기재된 바와 같이 iNKT 세포 주파수 및 하위 군 주파수를 결정한다.
  4. 통계 분석
    참고: 모든 데이터는 평균 ± SD값으로 제시되고 P< 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
    1. 분산(ANOVA)의 일자 분석을 사용합니다. 분산이 충족되면 LSD 테스트를 사용하여 추가 비교를 수행합니다.
    2. 분산이 균일하지 않은 경우 비매개 테스트를 사용합니다. 추가 비교를 위해 크루스칼-월리스 H 테스트를 사용 하 여31.

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결과

관절염 지수 점수 및 발 두께 모델링 후 증가. 대조군과 비교하여, RA 모델 그룹의 발가락은 모델링 후 6일 동안 점진적인 악화와 함께 붉은 부종을 보이기 시작했다. 14 일, 발목 관절의 붉은 붓기가 절정에 이르렀고 점진적인 완화가 뒤따랐습니다. 발의 두께도 비슷하게변경되었습니다(P < 0.05)(그림1).

염증성 세포 침투는 모델링 후 현저하게 증가했습니다. 병리학적 결과는 RA 모델 마우스의 발목 활액 조직에서 염증 세포의 침투 정도가 상이한 단계에서 상이한 것으로 나타났다. 피크 염증은 14 일 포스트 모델링(그림 2)에발생했습니다.

염증성 사이토카인이 증가하고 항 염증 성 사이토 카인이 혈청에서 감소했습니다. RA 모델 그룹에서, 염증성 사이토카인(TNF-α, IFN-γ 및 IL-6)의 혈청 ...

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토론

iNKT 세포는 선천적이고 적응성 면역을 연결하는 특별한 T 세포이며 주로 CD4++/ CD8+ 흉선 세포에서 개발됩니다. iNKT 세포는 다양한 면역 조절 기능을 가지며 상이한 사이토카인2 3의직접 접촉 및 분비에 의해 다른 면역 세포와 상호작용하며, 수지상세포(DC), 대식세포, 호중구, B세포, T세포 및 NK세포 분화 및개발24에영향을 미친다. α-GalCer는 스폰지에서 추출된 고전적인 iNKT 세포 특이적 활성제입니다. 여러 연구에 따르면 비장 iNKT 세포 주파수는 α-GalCer의 단일 복강 주사 후 3일25일동안 피크에 도달한다는 것을 나타냅니다. 우리의 실험 결과는 주로 항염증성 사이토카인 IL-4 및 IL-10을 분비...

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공개 사항

저자는 자금 이나 이해 의 충돌을 선언 하지 않습니다.

감사의 글

우리의 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (NSFC) (81771755), 허베이성의 대학 및 대학의 과학 기술 핵심 연구 프로젝트 (ZD2017009) 및 허베이 대학의 의학 실험 센터의 동물 연구소에 의해 지원되었다. 우리는 그들의 지원에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Alexa Fluor 647 마우스 Anti-PLZFBD563490America
Anti-PE MicroBeadsMiltenyi130-048-801
독일 컬럼MiltenyiMS독일
극저온 원심분리기BeckmanAllegra® X-15RAmerica
DiR써모 피셔 사이언티픽D12731아메리카
임베딩 센터Tianjin Aviation Electromechanical Co., Ltd.BMJ-1중국
FITC 햄스터 안티 마우스 TCR β 사슬BD553170America
유세포 분석기BDAccuri C6America
Freund의 완전한 보조제SigmaF5881America
hGPI325-339 (IWYINCFGCETHAML)Karebay Biochem18062202
중국 hGPI469-483 (EGNRPTNSIVFTKLT)Karebay Biochem18062203중국
In Vivo 이미징 시스템PerkinElmer캘리퍼스 IVIS 루미나 II미국
아이오노마이신 칼슘케이맨10004974미국
KRN7000AdipoGenAG-CN2-0013미국
마우스 CD1d 테트라머-PEMBLTS-MCD-1일본
마우스 percollSolarbioP8620중국
광학 현미경올림푸스 올림푸스-II일본
PerCP-CyTM5.5 마우스 안티 ROR-ϒ tBD562683America
PerCP-CyTM5.5 마우스 안티 T-betBD561316America
백일해 독소SigmaP7208America
phorbol 에스테르Cayman10008014America
적혈구 용해 완충액BD555899America
RPMI-1640Biological Industries01-100-1ACS이스라엘
Th1/Th2/Th17 사이토카인 키트BD560485미국
초박절본 라이카라이카 EM UC6독일

참고문헌

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