여기서 제시된 것은 성체 제브라피쉬 텔렌세팔론에서 플라스미드 DNA 전달 및 에펜디모글리아 세포 라벨링을 위한 전기개공 방법이다. 이 프로토콜은 개별 ependymoglial 세포를 구상하고 추적하는 빠르고 효율적인 방법이며 광범위한 유전 조작에 전기 증시인을 적용할 수있는 새로운 가능성을 열어줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
전기 개출은 세포막에 일시적인 기공을 생성하고 투과성을 증가시켜 다른 분자가 세포에 도입 될 수 있도록 하는 형질전환 방법입니다. 이 논문에서, 전기 천공은 성인 얼룩말 말살기의 심실 영역을 일렬로 세워 ependymoglial 세포에 플라스미드를 소개하는 데 사용됩니다. 이들 세포의 일부분은 줄기 세포 특성을 보여주고 제브라피시 뇌에서 새로운 뉴런을 생성한다. 그러므로, 그들의 행동을 공부하는 것은 신경 발생과 재생에 있는 그들의 역할을 결정하기 위하여 필수적입니다. 전기 개공을 통해 플라스미드를 도입하면 단일 에펜디모글리아 셀의 장기 라벨링 및 추적이 가능합니다. 또한 Cre recombinase 또는 Cas9와 같은 플라스미드는 단일 ependymoglial 세포로 전달될 수 있어 유전자 재조합 또는 유전자 편집을 가능하게 하고 제어된 천연 에서 세포의 자율 적인 유전자 기능을 평가할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 환경. 마지막으로, 이 상세한, 단계별 전기 천공 프로토콜은 다수의 단일 ependymoglial 세포에 플라스미드의 성공적인 도입을 얻기 위해 사용된다.
서론
Zebrafish는 찔린 상처 부상 후 뇌 재생을 검사하는 우수한 동물 모델입니다. 포유류에 비해, 진화 사다리에, 제브라피시와 같은 덜 진화 된 종은 일반적으로 구성 신경 발생의 높은 비율을 보여주고 성인 신경 줄기 세포 거주의 넓은 영역, 전반에 걸쳐 새로운 뉴런의 일정한 생성으로 이어지는 성인 생활에서 대부분의 뇌 영역. 이 기능은 포유류 1에 비해 제브라피시의 상당히 높은 재생 능력과 상관 관계가 나타납니다1,제브라피쉬는 효율적으로 연구대부분의뇌 손상 모델에서 새로운 뉴런을 생성하는 놀라운 잠재력을 가지고2, 3,4,5,6,7,8. 여기에서, 얼룩말 말살론은 성인기에 있는 눈에 띄는 신경 발생을 가진 두뇌 지역이기 때문에, 공부됩니다. 이러한 성인 신경발생 영역은 성인 포유류뇌의신경발생 ....
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프로토콜
이 프로토콜에 사용된 모든 동물은 표준 축산 조건하에서 보관되었으며, EU 및 상부 바이에른 정부의 취급 지침 및 규정에 따라 실험이 수행되었습니다(AZ 55.2-1-54-2532-0916).
1. 전기 포공용 플라스미드 혼합물 의 준비
- 멸균수에 관심 있는 플라스미드를 희석하고 빠른 녹색 얼룩 스톡 용액 [1 mg/mL]을 추가합니다. 플라스미드의 최종 농도가 1 μg/μL인지 확인하십시오.
- 일단 준비되면, 위아래로 여러 번 또는 손가락으로 두드리는 하여 플라스미드 용액을 섞는다. 사용 전까지 실온(RT)에 보관하십시오.
참고: 동일한 세포에 두 플라스미드의 공동 전기화를 위해, 혼합물에 사용되는 각 개별 플라스미드의 농도가 80%-90% 공동 전기화 효율을 얻기 위해 1:1의 몰 비율로 0.8 ng/μL 이상인지 확인한다.
2. 주입 및 전기 증식 절차 준비
- 바늘 당기기의 주입에 필요한 유리 모세혈관(외경 1mm, 내경 0.58mm)을 준비한다.
- 올바른 양의 플라스미드를 주입하려면(위 참조) 68.5°C의 온도에서 두 개의 가볍고 두 개의 무거운 무게로 모세관을 당깁니다(풀러....
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결과
기재된 전기천공 방법은 플라스미드 DNA를 에펜디모글리아 세포내로 전달할 수 있으며, 이는 얼룩말 말살기 및 등쪽 에펜디알 세포층 바로 아래에 표면적으로 위치한다(도1A).
전기 천공의 결과가 양성인 경우, 표지된 단일 에펜디모글리아 세포(도 2A, B의적혈구)는 다른 에펜디모글리아 세포 들 사이에서 관찰될 수 있다(도 2A, B에서백색). 전기 천공 과정의 효율에 따라, 더 높은(도 2A)이하(도 2B)회교 신경통 세포의 수가 표지될 수 있다. 그럼에도 불구하고 이 프로토콜은 이전에 게시된20개보다더 .......
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토론
이러한 전기 개공 프로토콜은 개별 에펜디모글리아 세포를 라벨링하는 신뢰할 수 있는 생체 내 방법이다. 프로토콜은 뉴런 또는 올리고엔드로시트와 같은 다른 세포 유형에 라벨을 붙이기 위해 추가적인 적응이 필요할 수 있다. 성공적인 라벨링을 달성하기 위해, 다른 프로모터를 함유하는 플라스미드를 사용할 수 있다. 치킨 베타 액틴 프로모터, eF1alpha, CMV 및 유비퀴틴 프로모터는 이전에 에펜디모글리아 및 그들의자손(23)에서상이한 트랜스유전자의 발현을 유도하는 데 사용되어 왔다. 그러나, 이식 유전자 발현의 상이한 역학은 계정으로 취해야 하는 관찰되었다. 예를 들어, CMV 프로모터 구동 이식유전자 발현은 매우 빠르며(24시간 후에 발현이 보일 수 있음), eF1alpha는 더 오래 걸린다. 라벨링 외에도, 전기천공 프로토콜은 Cre 재조합 또는 CRISPR Cas9 기술22를사용하여 유전자 편집의 빠르고 간단한 플랫폼으로서 사용될 수 있다. .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
원고의 편집제임스 콥티에 특별한 감사. 우리는 또한 SFB 870및 SPP "Olfaction의 통합 분석"과 SPP 1738 "신경계 발달, 가소성 및 질병에서 비 코딩 RNA의 새로운 역할", SPP1757에 의해 독일 연구 재단 (DFG)에서 JN에 자금을 감사하게 인정합니다. " Glial 이질성", 시스템 신경학에 대한 뮌헨 클러스터의 프레임 워크 내에서 우수 전략 (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198).
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Reagent/Material | |||
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258-25G | 플라스미드 착색용 |
| MS222 | Sigma-Aldrich | A5040-25G | MS222는 RT(최대 2주)로 보관해야 하며 광 초음파 젤로부터 보호해야 합니다 |
| . SignaGel, Parker laboratories INC. | 15-60 | 전극 젤 | |
| <강한>장비 | |||
| 공기 펌프 | TetraTec APS 50, 10l-60l | 애완동물 가게에서 구입할 수 있습니다. | |
| BTX 핀셋 전극 | 플래티넘 핀셋, BTX 하버드 장치 | 45-0486 | 1mm 직경 |
| 전기천공법 장치 | BTX ECM830 구형파 전기천공법 시스템, BTX 하버드 장치 | 45-0662 | |
| 주입 장치 | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | |
| Standard Wall Borosillicate 유리 모세관 | Warner Instruments | 64-0766 | 모델 번호: G100-4 |
| 마이크로로더 팁 | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micro-knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 조이스틱 마이크로매니퓰레이터 | Narishige Japan | MN - 151 | |
| 바늘 홀더 | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | 바늘 홀더는 주입 장치 |
| 바늘 당기는 장치와 | Narishige Japan | 모델 번호: PC-10 | PC-10은 2017년 Narishige에 의해 중단되었으며 PC-100 |
| Petri 접시 | Greiner Bio-One International | 633161 |
참고문헌
- Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).
- Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J.
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재인쇄 및 허가
