이 프로토콜은 DNA/DOTAP 혼합물을 1일 된 제노푸스 라에비스 배아의 안구에 미세 주입하는 방법과 지각 중뇌에서 광학 축색 아버를 발현하는 개별 녹색 형광 단백질(GFP)을 이미지화하고 재구성하는 방법을 설명하는 것을 목표로 합니다. 그대로, 살아있는 제노푸스 올챙이.
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방법 논문
제노푸스 laevis 배아에서 눈부안으로 DNA의 미세 주입 및 GFP의 이미징 그대로 광학 축색 아버를 표현, 살아있는 제노푸스 올챙이
이 논문에서
요약
초록
수생 개구리 제노푸스 laevis의 올챙이의 주요 시각적 투영은 신경 연결의 발달을 통제하는 기계장치를 공부하기위한 훌륭한 모델 시스템 역할을합니다. 레티노-tectal 투영의 설치 도중, 광학 축색은 눈에서 확장하고 그들의 표적 조직, 광학 tectum에 도달하기 위하여 두뇌의 별개의 지구를 통해서 탐색합니다. 일단 광학 축새가 tectum에 들어가면, 그(것)들은 tectum에 있는 표적 interneurons로 만들 수 있는 시냅스 연결의 수를 증가하기 위하여 기능하는 말단 아버를 정교하게 합니다. 여기서, 우리는 제노푸스 배아에서 녹색 형광 단백질(GFP)을 코딩하는 DNA를 발현하는 방법, 및 이득-기능 상실 유전자 구성, 광뉴런(망막 신경절 세포)을 발현하는 방법을 설명한다. 우리는 외인성 유전자가 광학 뉴런의 단 하나 또는 작은 수에서 표현되는 그래야 1 일 오래된 태아의 안구에 결합된 DNA/lipofection 시약을 마이크로 주입하는 방법을 설명합니다. GFP와 유전자를 태그하거나 GFP 플라스미드와 공동 주입함으로써, 변형 된 분자 신호를 가진 개별 광학 뉴런의 말단 축삭 아버는 며칠 후 살아있는 제노푸스 올챙이, 그리고 그들의 형태에 따라 그대로 뇌에서 직접 이미지화 될 수 있습니다. 정량화될 수 있습니다. 이 프로토콜은 생체 내에서 광학 축색 아버라이드의 개발을 뒷받침하는 세포 자율 분자 메커니즘의 결정을 가능하게 합니다.
서론
신경계의 발달 도중, 시냅스 전 신경의 축세포는 그들의 표적 지역에 도달하기 위하여 두뇌의 다양한 지구를 통해서 탐색합니다. 축 삭 그들의 대상 조직을 침공 하는 때, 그들은 synaptic 대상 뉴런시 연결을 설정. 뉴런의 많은 모형에서, 축세포는 말단 가지 또는 아버1의정교하게 네트워크를 정교하게 하여 만들 수 있는 시냅스 연결의 수 그리고 공간 넓이 증가합니다. 수생 개구리 제노푸스 laevis의 올챙이의 레티노 tectal 투영은 말단 축삭 수목화 및 시냅스 연결성2,3,4의 근본적인 메커니즘을 검사하기위한 강력한 척추 동물 모델입니다. . 정상 및 변경된 분자 신호로 광학 축색 아버를 발현하는 개별 GFP는 그대로 관찰할 수 있으며, 살아있는 제노푸스 올챙이5,6,7,8. GFP를 단독으로 또는 소수의 광학 뉴런에서 ....
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프로토콜
여기에 설명된 모든 방법은 투로 대학 캘리포니아의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다 (프로토콜 # TUCA003TE01X).
1. X. 래비스 배아 획득
- 인간 융모성 생식샘 자극호르몬(HCG)으로 프라이밍된 수컷 과 암컷 성개구리 쌍의 자연적인 짝짓기로 X. laevis 배아를 얻거나, HCG로 프라이밍된 여성 성인 개구리에서 흘린 난자의 체외 수정에 의해, 또는 직접 주문함으로써(표의 표 재료)를참조하십시오.
-
실온에서 2% 시스테인 용액으로 수득된 데젤리 배아(표 오브 머티리얼)16.
- 큰 페트리 접시에 50-100 개의 배아를 수집합니다. 플라스틱 이송 파이펫을 디캔팅하거나 사용하여 배아가 들어있는 용액을 제거합니다. 2% 시스테인 용액 의 25 mL를 추가 (0.5 g 시스테인 25 mL ddH2O, pH 8.0) 배아를 포함하는 접시에.
- 배아의 젤리 코트가 떨어지고 배아가 접시의 중앙에 덩어리로 수집 될 때까지 시스테인 용액에 배아를 포함하는 페트리 접시를 부드럽게 소용돌이 (....
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결과
이 문서에 설명된 프로토콜은 GFP를 발현하는 주입된 제노푸스 배아의 30-60%의 성공률을 산출합니다(단독으로 또는 추가 DNA 구성과 함께) 1~10개의 광학 축색아수목. 도 3에서,우리는 우리의 최근 출판 된 연구7에서그대로 제노푸스 올챙이에서 제어 및 돌연변이 광학 축색 아버를 표현하는 GFP의 대표적인 공초점 이미지를 보여줍니다. 이 연구를 위해, 우리는 APC (APCNTERM 및 APCβ-cat)의 두 개의 도메인 돌연변이체를 pCS2 플라스미드로 복제하고, 이 플라스미드를 pCS2-GFP 라벨링 플라스미드와 함께 1일 된 제노푸스 배아의 안구에 공동 주입하였다. 그림 4는 가지 수, 총 아버 분기 길이 및 분기의 평균 길이를 포함하여 대조군 및 APC 돌연변이 축색 아버의 재구성에 대한 몇 가지 정량적 측정 결과를 보여.......
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토론
이 기사에서는 단일 또는 소수의 광학 뉴런에서 외인성 DNA 구조를 표현하는 방법과 개구리 X의 살아있는 올챙이에서 정상 적이고 변경 된 분자 신호로 광학 축색 아버를 표현하는 개별 GFP를 이미지화하는 방법을 보여줍니다. . 라에비스. 우리는 또한 생체 내에서 캡처 한 이미지에서 광학 축색 아버를 표현하는 GFP의 형태를 재구성하고 정량화하는 방법에 대해설명합니다. 소수의 광학 뉴런에서 외인성 DNA 플라스미드를 발현하기 위해, 우리는 크리스틴 홀트의 실험실에서 처음 개발된 기술을 사용하여 DNA/지질 검사 시약 혼합물을 1일 된 제노푸스 배아의 아이버드 프리모르디아에 마이크로주사하여 광학을 연구했습니다. 젊은 올챙이9,10,19,20,
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
우리는 우리의 연구를 지원하기위한 정골 의학의 투로 대학 캘리포니아 대학 감사합니다. 우리는 우리 실험실에서이 미세 주입 기술을 구현하는 데 도움을 준 실험실 (에스더 우, 그레고리 펭, 진 태건 진, 존 림)의 이전 학생들을 인정합니다. 제노푸스 배아의 이 DNA 미세 주사/지질 검사 기술이 처음 개발된 크리스틴 홀트 박사에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 3.5" 마이크로피펫 | Drummond Scientific | 3-000-203 - G/X | |
| μ-manager 소프트웨어(버전 1.4) | Vale Lab | ||
| www.micro-manager.org CCD 카메라 | Scion Corporation | CFW-1312 M | |
| Chorulon(인간 융모성 성선 자극 호르몬) | AtoZ Vet Supply | N/A | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 168149-100G | |
| DOTAP | Sigma-Aldrich | 11202375001 | |
| Dumont Forceps #5 | Fine Science Tools | 11250-10 | |
| Eclipse E800 epifluoresence microscope | Nikon | Objectives: Nikon Plan Apo 20x/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75 | |
| GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10) | GIMP | ||
| Illustrator (2017 Creative Cloud) | Adobe | ||
| ImageJ (버전 1.46r) | NIH | ||
| Microfil | World Precision Instruments | MF 34G-5 | |
| Micromanipulator with universal adaptor and support base Drummond | Scientific | 3-000-024-R | |
| 3-000-025-SB | |||
| 3-000-024-A | |||
| 마이크로피펫 풀러 | 셔터 기기 | P-30 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| 전동 z-스테이지 | 응용 과학 기기 | MFC-2000 | |
| Nanoject II 인젝터 | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| PowerPoint(버전 15.31) | Microsoft | ||
| Xenopus laevis 배아 | Nasco | LM00490 |
참고문헌
- Gibson, D. A., Ma, L. Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system. Development. 138 (2), 183-195 (2011).
- Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: d....
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재인쇄 및 허가
