방법 논문

압력 근엽을 이용한 뮤린 생식 계통의 양축 기저톤 및 수동 테스트

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DOI:

10.3791/60125

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2019년 8월 13일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Tulane University

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 뮤린 질 및 자궁 경부에 대한 압력 근사진 테스트를 수행하기 위해 시판되는 압력 근경 시스템을 활용했습니다. 칼슘유무와 관계없이 매질, 평활근 세포(SMC) 기저톤 및 수동 세포외 매트릭스(ECM)의 기여도를 추정된 생리적 조건 하에서 장기용으로 분리하였다.

초록

여성 생식 기관, 특히 질과 자궁 경부는 다양한 세포 구성 요소와독특한 세포 외 매트릭스 (ECM)로 구성됩니다. 평활근 세포는 질 및 자궁 경부 벽 내의 수축 기능을 나타낸다. 생화학적 환경과 기관 벽의 기계적 팽창에 따라 평활근 세포는 수축 상태를 변경합니다. 기준선 생리적 조건 하에서 평활근 세포의 기여는 기저 톤으로 분류된다. 보다 구체적으로, 기저 톤은 호르몬 및 신경 자극이 없는 평활근 세포의 기준선 부분 수축이다. 또한, ECM은 기관 벽에 대한 구조적 지원을 제공하고 생화학 적 단서를위한 저장소로서의 기능을 제공합니다. 이 생화확적인 단서는 성장을 선동하고 항상성을 유지하는 것과 같은 각종 기관 기능에 생명입니다. 각 기관의 ECM은 주로 콜라겐 섬유 (주로 콜라겐 유형 I, III 및 V), 탄성 섬유 및 글리코사미노 글리칸 / 프로테오글리칸으로 구성됩니다. ECM의 구성 및 조직은 각 기관의 기계적 특성을 지시합니다. ECM 조성에 있는 변경은 골반 기관 탈출 또는 조기 자궁 경관 개조와 같은 생식 병리의 발달로 이끌어 낼 수 있습니다. 더욱이, ECM 미세 구조 및 강성에 있는 변경은 평활근 세포 활동 및 표현형을 바꿀 수 있습니다, 따라서 수축력의 손실의 결과로.

이 작품에서, 보고된 프로토콜은 발식에 있는 나이의 4-6 달에 비임신 한 뮤린 질 및 자궁 경부의 기저 톤 및 수동 기계적 특성을 평가하기 위하여 이용됩니다. 장기를 시판되는 압력 근사에 장착하고 압력 직경 및 힘 길이 테스트를 모두 수행했습니다. 생식 기관의 기계적 특성분석을 위한 샘플 데이터 및 데이터 분석 기술이 포함되어 있다. 이러한 정보는 수학적 모델을 구축하고 여성의 건강 병리학에 대한 치료 적 개입을 합리적으로 설계하는 데 유용 할 수 있습니다.

서론

질 벽은 4 개의 층, 상피, 라미나 프로피아, 근육질 및 출현으로 구성됩니다. 상피는 주로 상피 세포로 구성됩니다. 라미나 프로프리아는 다량의 탄성 및 섬유질 콜라겐 섬유를 가지고 있습니다. 근육질은 또한 엘라스틴과 콜라겐 섬유로 구성되지만 평활근 세포의 양이 증가합니다. 출현은 엘라스틴, 콜라겐 및 섬유아세포로 구성되어 있으며, 이전 층에 비해 농도가 감소합니다. 평활근 세포는 장기의 수축성질에서 역할을 하기 때문에 생체역학적으로 동기를 부여받은 연구 그룹에 관심이 있습니다. 이와 같이, 평활근 세포 면적 분획 및 조직을 정량화하는 것은 기계적 기능을 이해하는 데 핵심이다. 이전 조사는 질 벽 내의 평활근 함량이 주로 둘레및 세로 축으로 구성되어 있음을 시사한다. 조직학적 분석에 따르면 평활근 면적 분율은 벽 1의 근위 및 말단 모두에대해 약 35%입니다.

자궁경부는 콜라겐구조가 높고, 최근까지 는 평활근 세포함량이2,3로생각되었다. 최근 연구는, 그러나, 평활근 세포가 자궁 경부에 있는 더중대한 풍부하고 역할을 가질 수 있다는 것을 건의했습니다 4,5. 자궁 경부는 평활근 세포의 구배를 나타낸다. 내부 OS는 외부 OS가 10 %를 포함하는 50-60 % 평활근 세포를 포함합니다. 그러나 마우스 연구는 자궁경부를 10-15% 평활근 세포와 85-90% 섬유결합조직으로 구성하여 지역적차이에 대한 언급없이 6,7,8로구성된다. 마우스 모형이 자주 보고된 인간 모형과 다르다는 것을 감안할 때, 마우스 자궁 경부에 관하여 추가 조사가 필요합니다.

이 프로토콜의 목적은 뮤린 질 및 자궁 경부의 기계적 특성을 해명하는 것이었습니다. 이것은 네이티브 세포 매트릭스 상호 작용 및 기관 기하학을 유지하면서 원주 및 축 방향에서 기계적 특성을 동시에 평가할 수 있는 압력 myograph 장치를 사용하여 달성되었습니다. 장기는 두 개의 사용자 정의 캐뉼러에 장착하고 실크 6-0 봉합사로 고정되었습니다. 압력 직경 시험은 컴플라이언스 및 탄젠트 모듈리 9를 결정하기위해 추정된 생리축 스트레치 를 중심으로 수행되었다. 힘 길이 시험은 추정된 축 스트레칭을 확인하고 기계적 성질이 생리적인 범위에서 정량화되었는지 확인하기 위하여 실시되었습니다. 실험 프로토콜은 발식에 있는 나이의 4-6 달에 비임신 한 뮤린 질 및 자궁 경부에 수행되었다.

프로토콜은 기저 톤과 수동 테스트의 두 가지 주요 기계 테스트 섹션으로 나뉩니다. 기저톤은 외부 국소, 호르몬 및 신경 자극(10)의 부재에도 평활근 세포의 기준선 부분수축으로 정의된다. 질과 자궁 경부의 이 기준선 수축성 성질은 압력 myograph 시스템에 의해 측정되는 특징적인 기계적 행동을 산출합니다. 수동 속성은 수축의 기준선 상태를 유지 하는 세포 간 칼슘을 제거 하 여 평가, 평활근 세포의 이완의 결과. 수동 상태에서 콜라겐과 엘라스틴 섬유는 장기의 기계적 특성에 대한 지배적 인 기여를 제공합니다.

뮤린 모델은 여성의 생식 건강에 있는 병리학을 공부하기 위하여 광범위하게 이용됩니다. 마우스는 생식 시스템11,12,13,14내에서 ECM 과 기계적 특성 사이의 진화하는 관계를 정량화하기 위한 몇 가지 이점을 제공한다. 이러한 장점은 짧고 잘 특성화 된 에스트로스 사이클, 상대적으로 저렴한 비용, 취급의 용이성 및 상대적으로 짧은 임신 시간15를포함한다. 부가적으로, 실험실 마우스의 게놈은 잘 매핑되고 유전자 변형 마우스는 기계론적가설을 테스트하는 귀중한 도구16,17,18.

시판되는 압력 myograph 시스템은 다양한 조직 및 기관의 기계적 반응을 정량화하기 위해 광범위하게 사용됩니다. 압력 근막 시스템에서 분석된 몇몇 주목할 만한 구조물은 탄성 동맥19,20,21,22,정맥 및 조직 공학된 혈관 이식편23,24, 식도25,대장26. 압력 근사진 기술은 기본 세포-ECM 상호 작용 및 생체 내 기하학을 유지하면서 축 방향 및 원주 방향에서 의 특성을 동시에 평가할 수 있게 합니다. 연조직 및 장기 역학에서 근엽 시스템을 광범위하게 사용했음에도 불구하고, 압력 근엽 기술을 활용한 프로토콜은 이전에 질과 자궁 경부를 위해 개발되지 않았습니다. 질 및 자궁 경부의 기계적 성질에 대한 사전 조사는27,28을단축으로 평가했다. 이 기관은, 그러나, 바디 29,30내의 다축 하중을 경험하고, 따라서 그들의 이축 기계적인 반응을 정량화하는 것이 중요합니다.

더욱이, 최근의 연구는 평활근 세포가 연조직 병리학5,28,31,32에서잠재적인 역할을 할 수 있음을 시사한다. 이것은 네이티브 세포 매트릭스 상호 작용을 보존하기 때문에 압력 myograph 기술을 활용하는 또 다른 매력을 제공하므로 평활근 세포가 생리및 병리생리학적으로 재생되는 기여의 묘사를 허용합니다. 조건. 본 명세서에서, 우리는 기저톤 및 수동 조건 모두에서 질 및 자궁경부의 다축 기계적 특성을 정량화하는 프로토콜을 제안한다.

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프로토콜

Nulliparous 4-6 개월 여성 C57BL6J 마우스 (29.4 ± 6.8 그램) 이 연구에 사용 되었다. 모든 절차는 툴레인 대학의 연구소 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다. 납품 후에, 마우스는 안락사 의 앞에 1 주일 동안 적응하고 표준 조건 (12 시간 빛/어두운 주기)에서 수용되었습니다.

1. 에스트로스에서 마우스 희생

  1. 에스트로스 주기 결정: 에스트로스 사이클은 이전 연구15,33,34에따라 시각적 평가에 의해 모니터링되었다. 에스트로스 주기는 프로에스트루스, 에스트루스, 메스트루스, 다이스트러스의 네 단계로 구성됩니다. proestrus 단계 도중 성기는 부어, 분홍색, 촉촉하고, 주름됩니다. estrus 단계는 주름이 있지만 덜 부어, 분홍색, 촉촉한. Metestrus 및 diestrus는 둘 다 더 팽윤및 주름을 전시하는 것으로 보고되고, 분홍색 색조에 결여되고, 건조34,35.
  2. estrus에서 실험 수행: 마우스가 발식에 있는 동안 모든 기계적 테스트를 수행하였고, 이는 시각화하기 가장 쉽고 일관되고 반복 가능한 타임포인트를 제공하기 때문에 수행되었습니다.
  3. 기저 톤 테스트를 받는 마우스의 경우 기요틴을 통해 안락사시하십시오. 수동 조건 하에서만 시험된 마우스의 경우, 이산화탄소(CO2) 흡입을 사용하여 안락사한다. 기요틴은 CO2 가스가 평활근 세포의 수축 특성을 변화시키기 때문에 생식기관의 평활근 세포의 기능을 보존하는 역할을 한다36,37,38, 39,40,41,42. 세포 사멸의 기회를 최소화하기 위해 30 분 이내에 해부를 수행하는 것이 필수적입니다.

2. 생식 계통 해부

  1. 설정: 흡수 패드를 워크스테이션에 놓고 페트리 접시와 주사기를 4°C 행크의 균형 잡힌 염분 용액(HBSS) 용액으로 채웁니다. 지방 조직 처리를 위해 와이프를 사용하십시오. 마우스 복부 쪽을 위로 올려 놓고 발과 꼬리를 테이프로 놓습니다. 현미경 조명을 켜고 마이크로 가위, 가위, 직선 핀셋 2 쌍 및 곡선 핀셋 2 쌍을 설정합니다.
  2. 각진 핀셋과 가위를 사용하여 복부 주위의 피부를 들어 올리고 음모 뼈 위의 복부 기저에서 절개를합니다. 절개는 복근 벽에 구멍을 뚫지 않을 정도로 얕아야합니다. 가위를 계속 사용하여 흉곽쪽으로 우월하게 자르고 복부 근육을 깊숙이 통과하십시오.
  3. 구부러진 핀셋과 마이크로 가위로 지방을 가볍게 당겨 표면지방을 제거합니다. 지방 조직은 반짝이는 외관으로 이질적으로 빛을 반사합니다. 제거된 모든 지방과 티슈를 닦아냅니다. 자궁 뿔과 음모 뼈를 모두 식별합니다.
  4. 질 벽과 음모 뼈 사이에 닫힌 가위를 놓습니다. 조심스럽게 음모 뼈 (음모 심직)의 중간을 잘라. 절단 된 음모 뼈의 양쪽 끝에 곡선 핀셋을 놓습니다. 생식 기관에 더 잘 접근 할 수 있도록 양쪽 절단 끝을 측면으로 당깁니다.
  5. 질 벽에서 방광과 요도를 제거하십시오. 이것은 직선 핀셋과 마이크로 가위를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 직선 핀셋으로 방광을 잡고 긴장을 만들고 무딘 해부 기술을 사용하여 주변 조직을 질에서 분리합니다. 방광과 요도가 해부되면 베이스를 자르고 신체 구멍에서 제거하십시오.
  6. 생식 계통을 확인하십시오: 자궁 경적은 자궁 경부에서 분기합니다. 자궁 경부는 기하학과 강성의 차이로 인해 질에서 확인 될 수 있습니다. 자궁 경부의 외경은 질 보다는 더 작습니다. 자궁 경부는 질보다 뻣뻣하고 비드의 것과 유사한 느낌(그림 1).
  7. 잉크와 캘리퍼를 사용하여 장기를 따라 3mm 도트를 표시합니다. 자궁 관에 난소 의 밑에 시작하고 자궁 경부에 도달하기 위하여 열등하게 점을 표시합니다. 중심 자궁 경부 점을 사용하여 질 내로 내려가는 도트 경로를 시작합니다.
  8. 잉크가 건조하고 주변 지방 조직, 결합 조직 및 결장에서 생식 기관을 분리할 수 있도록 하십시오. 질 내적에 가깝게 질을 청소하십시오. 가위를 사용 하 여 질 내티를 잘라.
    참고 : 이 과정에서 장기가 건조 할 수 있습니다. 이것이 우려되는 경우, 4°C HBSS로 채워진 주사기를 사용하여 장기에 수분을 추가할 수 있습니다.
  9. 자궁 뿔을 난소보다 즉시 열등하게 자릅니다. 결합 조직이 제거되고 장기가 반동함에 따라 장기는 포스트 이식 길이에서 철회됩니다. 4°C HBSS로 채워진 페트리 접시에 해부된 생식 기관을 놓습니다. 이러한 길이 변화는 생체 내 예상 길이(섹션 5)를 계산하는 데 사용될 수 있다.
    참고 : 우리는 해부 및 통조림 동안이 온도에서 HBSS를 사용하는 것이 평활근 세포 생존에 영향을 미치지 않는다는 것을 확인했습니다. 그러나 7.4의 pH를 유지하는 것은 평활근 세포의 생존력을 유지하는 데 필수적입니다. 이 온도에서 HBSS는 pH 수준이 7.4입니다.
  10. 4°C HBSS에서 15분의 평형 기간을 보낸 후 캘리퍼스를 사용하여 점 사이의 공간을 측정합니다. 각 거리의 측정값을 스프레드시트에 기록합니다. 이 값은 생체 내 스트레치 비율(원래 길이/이식 길이)을 계산하는 데 사용됩니다.
  11. 마우스 의 내부를 향한 과잉 조직과 복부 영역에 버려진 조직을 포함하는 와이프를 설정하고 4 °C HBSS에 닦아. 마우스와 여분의 조직을 호일에 싸서 -20°C에 보관할 냉동고 안전 백에 놓습니다. 질상에 대한 수동적인 기계적 거동은 1회 동결해동주기(43)후 유의적으로 다른 것으로 나타났다. 시험된 모든 장기는 안락사 직후 또는 동결 해동 주기 후에 사용되었다.

3. 캐너링

  1. 장기 유형에 대한 적절한 캐뉼라 크기를 결정합니다. 일반적인 C57BL6J 마우스에서 질은 직경이 3.75 mm이고 리벳이 있는 캐뉼라를 사용합니다. 자궁 경부는 질 말단의 경우 3.75 mm이고 자궁 말단의 직경은 0.75 mm인 캐뉼라를 사용합니다(그림2)0.75 mm 캐뉼라는 부드럽습니다.
    참고: 위에 표시된 직경 크기는 전형적인 nulliparous 4-6 달 C57BL6 마우스, C57BL6 x 129SvEv 및 7-9 개월 숙성된 비상마우스에 사용됩니다. 그러나, 탈출 또는 임신과 같은 특정 상황은 더 큰 크기의 캐뉼라를 요구할 수 있습니다.
  2. 각 기관과 함께, 캐널레이션 장치의 힘 변환기 부분에 자궁 경부 측을 장착. 기관의 반대쪽 끝 (질 또는 자궁)을 장치의 마이크로 미터 부분에 장착하십시오. 양 끝을 봉합사로 조입니다.
  3. 질과 자궁 경부 간의 수축도의 두께 및 정도의 차이로 인해 다양한 기술이 가장 효과적인 혼조를 수행하는 데 활용될 수 있습니다. 질의 경우 캐뉼라의 2nd 및 3rd 리벳 사이에 2 개의 봉합사를 "X"방식으로 놓습니다. 자궁 경부를 통조인 때, 캐뉼라는 리벳되지 않으므로 장기는 자궁 끝에 3 개의 수평 봉합사와 외부 OS에 4 개의 봉합사로 캐뉼라 뒤쪽에 가장 잘 배치됩니다. 두 장기의 경우 최대 길이는 봉합사 사이에 7mm 이하여야 합니다(그림 3).

4. 압력 근위학 설정

  1. 압력 근중계 시스템을 설정하기 위해, 테스트 시스템의 전원을 공급하고 200 mL의 HBSS로 저수지 병을 채웁니다(그림 4). 열을 "켜기"로 돌리고 저수지 병의 HBSS가 가열되도록 하십시오. 다음으로 현미경을 켜고 컴퓨터 프로그램을 엽니다. 압수 기관, 압력 인터페이스, 유량계 판독값 및 시퀀서 함수 도구의이미지가 모두 표시되는지 확인합니다(그림 5).

5. 기저 톤 기계 테스트

참고 : 자궁 경부는 테스트의 시작 단계에서 단계적 특성을 나타냈다. 그러나, 이것은 사전 컨디셔닝 후 감소. 기저 톤 테스트는 DMT 장치의 분지에서 Krebs 링거 버퍼 (KRB)를 사용하여 수행됩니다. 완충액은 95% O2 및 5% CO2로 포약된다. 기저톤 부분이 완료된 후, 무칼슘 이없는 KRB가 활용됩니다.

  1. 언로드된 형상 찾기: 벽이 장력에 있지 않도록 오르간을 늘입니다. 질의 경우 질 벽의 홈을 관찰하십시오. 자궁 경부의 경우, 중앙 자궁 경부 마크 위와 아래에있는 잉크 점 바로 아래에 잘라. 이것은 6mm44의소자 길이로 자궁 경부에 대한 반복 가능한 방법을 고안한다. 캘리퍼로 봉합사에서 봉합사까지의 길이 측정
  2. 언로드 압력 찾기(UP): 압력을 0mmHg 단위로 1mmHg 단위로 늘립니다. 장기가 더 이상 붕괴되지 않는 압력을 결정합니다. 이는 프로그램 모니터에 제시된 바와 같이 주어진 압력에서 외지에서 가장 큰 점프로 결정될 수 있다. 압력과 외경을 기록 한 후, 기관이 붕괴되지 않고 힘이 제로되는 첫 번째 점으로이것을 주목하십시오.
  3. 생체 내 스트레치 추정: 생체 내에서 측정된 길이를 포스트 이식 후 발현 길이로 나누어 생체 내 스트레치 추정을 계산합니다.
    figure-protocol-1
  4. 압력 직경 사전 컨디셔닝: 압력을 0 mmHg로 설정하고 길이를figure-protocol-2생체 내 길이와 그라데이션을 1.5 mmHg/s로 설정합니다. 30초 보류 기간으로 압력을 0 mmHg로 합니다. 총 5사이클을 반복한 후 컴퓨터 프로그램에서 중지를 누르고 파일을 저장합니다.
  5. 생체 내 스트레칭 실험 찾기: 하역된 압력에서 생체 내 길이로 추정되는 장기를 조정하고 시작을누릅니다. 언로드된 압력에서 최대 압력에 이르는 압력 값에 대한압력 대 힘 값을 평가합니다(표 1). 컴퓨터 프로그램에서 중지 버튼을 누르고 파일을 저장합니다.
    참고: 측정된 스트레치 값은 그 단위로 계산됩니다. 이것은 음모 심포지엄을 탈구 한 후에만 측정 할 수 있다는 한계를 동반합니다. 결과적으로 자연 테더링이 손실되어 길이가 변경될 수 있습니다. 이론적 스트레칭, 그러나, 장기는 에너지를 보존하기 위해 생리적 압력에 노출 될 때 힘에 최소한의변화를 경험할 것이라는 이전에 도입 된 이론에 기초45. 프로토콜에서, 생체 내 스트레치 측정은 생리적 압력 범위에 노출될 때 힘의 최소한의 변화가 있는 것을 여기서 실험적으로 식별된 길이를 사용하여 계산된 스트레치 값이 될 것이다.
  6. 압력 직경 사전 컨디셔닝: 압력을 0 mmHg로 설정하고, 실험용 길이를 1.5 mmHg/s로 설정하고, 1.5 mmHg/s의 기울기를 최대 압력 + UP로 압력을 가하는 시퀀스를 실행하고, 30초 동안 유지하며, 광고와 함께 0mmHg로 다시 ditional 30 초 보류 기간. 총 5 주기 동안 이 것을 반복한 후 프로그램 인터페이스의 중지 버튼을 누르고 파일을 저장합니다.
    참고: 5.4는 압력이 증가함에 따라 보다 일관된 축력 판독을 달성하는 데 필수적입니다. 이 단계는 종종 시각적 단서에 따라 과소 평가되는 생체 내 스트레칭에서 올바른 을 찾는 데 도움이됩니다. 5.6은 히스테리시스를 최소화하고 기관의 일관되고 반복 가능하며 수학적으로 해석 가능한 반응을 달성하기 위한 예방 조치의 역할을 합니다.
  7. 힘 길이 사전 조절: 입구 및 출구 압력 모두에 대해 최대 압력 1/3 + UP를 입력합니다. 생체 내 길이의 -2 %로 장기를 조정하고 시작을누릅니다. 길이를 생체 내 길이 +2%로 조정한 다음 10 μm/s에서 -2%로 다시 내려가십시오. 총 5사이클동안 축 확장을 반복합니다. 컴퓨터 프로그램에서 중지를 누르고 파일을 저장합니다.
  8. 평형: 결정된 생체 내 길이의 오르간과 함께 최대 압력 + UP의 1/3에서 입구 및 출구 압력을 모두 설정합니다. 10 분 동안 장기를 평형화하십시오. 그라데이션세트를 1.5mmHg/s로 설정하여 두 압력을 모두 0mmHg로 천천히 되돌려 놓습니다.
  9. 언로드된 형상을 다시 평가합니다: 오르간을 생체 내 길이로 설정하고 하역된 압력에 압력을 설정합니다. 힘의 변화가 최소화될 때까지 축 길이를 10 μm/s의 속도로 예상 언로드 된 길이로 줄입니다. 이 해당 길이는 언로드 길이로 알려져 있거나 오르간이 장력이나 압축되지 않은 경우. 힘을 비우기 전에 언로드된 길이, 외부 지름 및 힘 값을 기록합니다.
    참고: 이전에 언로드된 형상은 순전히 정성적인 시각적 단서에 의해 결정되었습니다. 정량적 방법과 사전 컨디셔닝 중에 발생할 수 있는 길이의 가능한 변화를 설명하기 위해 재평가가 필요합니다. 이 형상은 섹션 8에서 사용됩니다.
  10. 초음파 설치: 일반적인 화상 진찰 복부 포장을 사용하여 시험 장치에 있는 기관을 구상하. (그림6). 테스트하기 전에 압력 근사 금속 분지 의 바닥에서 유물을 최소화하십시오. 조직이 여전히 테스트 솔루션에 완전히 잠기고있는 채부터 바닥에서 최대 거리인 높이로 캐뉼라를 조정하십시오. 사용자 정의 홀더는 이미징 중에 수직 위치에서 트랜스듀서를 안정화하기 위해 3D 인쇄됩니다.
  11. 초음파 이미징: 힘 변환기 근처의 캐뉼라를 식별하고 현미경의 단계를 조직의 길이를 따라 이미지화합니다. 테스트 프로세스 전반에 걸쳐 길이를 따라 중간 영역이 추적됩니다(그림6A,C). 이미징 후 일련의 B 모드 프레임으로 구성된 이미지 "Cine store" 루프를 검토하고 가장 큰 외부 직경의 프레임을 식별합니다. 두께 계산은 섹션 8에서 사용됩니다.
  12. 압력 직경 테스트 (-2% 생체 내 길이): 시작 하 고 비보 길이의 -2%가 되도록 장기를 조정 하 고 압력을 0 mmHg및 구배를 1.5 mmHg/s로 설정 합니다. 압력을 0 mmHg에서 최대 압력으로 증가 시요. 20초 간 유지 주기로 압력을 0mmHg로 다시 내려오십시오. 5 주기 동안이 반복합니다.
  13. 압력 직경 테스트(생체 내 길이): 오르간이 생체 내 길이에 맞게 시작하고 조정하고 압력을 0mmHg로 설정하고 그라데이션을 1.5 mmHg/s로 구배를 높입니다. 20초 간 유지 주기로 압력을 0mmHg로 다시 내려오십시오. 5 주기 동안이 반복합니다.
  14. 압력 직경 테스트(생체 내 길이 +2%): 장기를 생체 내 길이 +2%로 조정하고 압력을 0mmHg로 설정하고 그라데이션을 1.5 mmHg/s로 설정합니다. 5 주기 동안이 반복합니다. 세 길이의 압력 데이터는 섹션 8에서 사용됩니다.
  15. 힘 길이 테스트(공칭 압력): 하역된 압력과 장기에 대한 압력을 생체 내 길이의 -2%로 설정합니다. 생체 내 길이의 +2%로 장기를 스트레칭하고 10 μm/s의 속도로 생체 내 길이를 -2%로 되돌아갑니다.
  16. 힘 길이 테스트 (1/3 최대 압력 + UP): 압력을 최대 압력 + UP의 1/3로 설정하고 장기를 생체 내 길이 -2%로 조정합니다. 시작을누른 후, 오르간을 생체 내 길이 +2%로 스트레칭하고 다시 10 μm/s의 속도로 생체 내 길이를 -2%로 늘입니다. 총 3사이클동안 반복한 후 중지를 누르고 데이터를 저장합니다.
  17. 힘 길이 테스트 (2/3 최대 압력 + UP): 압력을 최대 압력 + UP의 2/3로 설정하고 장기를 생체 내 길이 -2%로 조정합니다. 시작을 누르고 생체 내 길이를 +2%로, 다시 10 μm/s의 속도로 생체 내 길이를 -2%로 늘입니다. 총 3사이클동안 반복한 후 중지를 누르고 데이터를 저장합니다.
  18. 힘 길이 테스트 (최대 압력 + UP): 최대 압력 + UP로 압력을 설정하고 생체 내 길이 -2 %로 장기를 조정합니다. 10 μm/s의 속도로, 장기를 생체 내 길이의 +2%로, 다시 생체 내 길이 -2%로 늘이십시오. 총 3사이클동안 반복한 후 데이터를 저장합니다. 모든 힘 데이터는 섹션 8에서 사용됩니다.
  19. KRB 시험 매체를 제거하고 칼슘이 없는 KRB로 세척하십시오. 2 mM EGTA로 보충된 칼슘 프리 KRB 용액으로 미디어를 교체하십시오. 조직을 30 분 동안 배양하십시오. 용액을 제거하고 미디어를 신선한 칼슘이 없는 KRB로 교체하십시오.

6. 수동 기계 테스트

참고: 수동 테스트로 시작하는 경우 1단계에서 시작합니다. 기저 톤 테스트가 6단계에서 수동 개시 전에 수행된 경우. 냉동 조직으로 시작하는 경우, 장기를 캐뉼기 전에 실온에서 30 분 의 평형 기간을 두십시오.

  1. 언로드 된 형상 찾기 : 기관의 벽이 장력에 있지 않도록 장기를 스트레칭하십시오. 봉합사에서 봉합사까지 압응 기관을 측정하고 언로드 된 길이로 기록하십시오.
  2. 언로드 압력 찾기: 시작을누른 후 압력을 0mmHg 단위로 1mmHg 단위로 늘립니다. 이 과정을 거치는 동안 장기가 긴장하지 않는 압력을 결정하십시오. 컴퓨터 프로그램 모니터를 사용하여, 이것은 외경에서 가장 큰 점프에서 결정될 수 있다. 힘을 비우고 나서, 이 압력과 외경을 기록하고 오르간이 붕괴되지 않는 첫 번째 지점으로 기록하십시오.
  3. 생체 내 스트레치 추정: 생체 내에서 측정된 길이를 이식 후 측정된 길이로 나누어 생체 내 스트레치 추정을 계산합니다.
  4. 압력 직경 사전 컨디셔닝: 시작을 누른 후 압력을 0 mmHg로 설정하고, 길이를 생체 내 길이로 설정하고, 그라데이션을 1.5 mmHg/s로 설정하고, 0mmHg에서 최대 압력으로 압력을 최대 압력으로, 다시 0으로 되돌리는 시퀀스를 실행하기 시작합니다. Mmhg. 30초 의 보류 시간으로 5사이클을 통해 이 과정을 반복합니다.
  5. 힘 길이 사전 조건: 오르간을 생체 내 길이로 조정하고 두 압력 모두에 대해 컴퓨터 프로그램에서 언로드 된 압력을 수동으로 입력합니다. 시작을 누른 후 그라데이션을 2mmHg로 설정하고 압력을 최대 값의 1/3으로 설정합니다. 장기를 +2%까지 늘이고 10 μm/s에서 -2% 늘이기 까지 다시 스트레칭하십시오.
  6. 실험생체 내 길이 찾기: 생체 내 길이의 -2%, 생체 내 길이및 생체내 길이의 +2%에서 힘 값을 찾아서 플롯합니다. 0 mmHg에서 최대 압력에 이르는 균일한 간격의 압력에서 힘을 발휘합니다. 실험인 생체내 스트레치는 다양한 압력에 걸쳐 비교적 평평한 라인을 나타내는 스트레치 값이 될 것이다.
  7. 새로운 생체 내 길이에서 압력 직경과 축 사전 컨디셔닝 단계를 반복합니다.
  8. 평형: 오르간을 생체 내 길이로 정한 상태에서 입구 및 출구 압력을 언로드 된 압력으로 설정합니다. 장기를 15 분 동안 다시 평형시키십시오. 15분 후, 입구와 출구 압력을 0mmHg로 천천히 되돌립니다.
  9. 언로드된 구성 다시 평가: 오르간을 언로드된 길이로 가져오고 언로드된 길이를 다시 추정합니다. 압력이 0 mmHg, 언로드 된 압력 및 최대 압력의 1/3인 동안 언로드 길이및 외부 직경을 기록합니다. 언로드 된 압력에서 힘을 제로합니다. 언로드 압력에서의 직경은 생체 내 직경이다.
    참고: 사전 컨디셔닝 후 연약한 생물학적 조직에서 이전에 작은 소성 변형이 관찰되었기 때문에 언로드 된 길이를 다시 추정해야합니다. 이 언로드된 구성은 섹션 8에서 사용되는 구성입니다.
  10. 초음파 : 언로드 된 길이와 압력에서 초음파 B 모드 이미징을 수행합니다.
  11. 압력 직경 테스트: 실험적으로 생체 내 길이와 0 mmHg의 압력에서 결정된 기관의 -2%로 시작을누릅니다. 압력을 0mmHg에서 최대 압력으로, 다시 0mmHg로 늘립니다. 2-0 mmHg 스텝을 20초 동안 잡습니다. 총 5회 반복한 후 인터페이스의 중지 버튼을 누르고 파일을 저장합니다.
    참고: 실험용 생체 내 길이의 +2%에서 반복합니다.
  12. 힘 길이 테스트: 압력을 공칭 압력으로 설정하고 장기를 생체 내 길이의 -2%로 조정합니다. 생체 내 길이의 +2 %까지 장기를 스트레칭하고 다시 10 μm / s의 속도로 생체 내 길이의 -2 %까지 스트레칭하십시오. 총 3회 반복한 후 데이터를 저장합니다. 최대 압력 1/3, 최대 압력 2/3 및 최대 압력에서 이 작업을 반복합니다.
  13. 초음파 이미지 B 모드 이미지에서 언로드 두께를 계산합니다. 이미징 소프트웨어를 사용하여 선을 그려 침투 깊이를 나타냅니다. 눈금을 선의 길이로 설정합니다(즉, 도 6B 및 6D에도시된 바와 같이 2000 μm).
  14. 벽 두께 계산: 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 장기의 내부 및 외부 지름을 추적하고 측정합니다. 그런 다음 지름 사이의 선을 그리고 측정합니다. 총 25개의 교란선을 그립니다. 모든 데이터 포인트를 평균화하고 총 3회 반복합니다.

7. 정리

  1. 압력이 0mmHg이고 꺼져 있는지 확인합니다. 3방향 밸브의 메인 입구와 콘센트를 닫습니다. 캐니어링 장치의 유역에서 남은 유체를 흡인합니다.
  2. 무대에서 장기를 제거하고 저수지 병을 탈이온수로 채웁니다. 주사기를 사용하여 캐뉼라를 물로 헹구고 있습니다. 튜브를 연결하여 캐뉼라를 우회합니다.
  3. 압력과 흐름을 켜고 입구 압력을 200 mmHg로 설정하고 출구 압력을 0 mmHg로 설정하고 그라데이션을 10mmHg /s로 설정하고 흐름을 5 분 동안 실행하십시오. 저수지 병이 비어 있는 동안 시스템을 실행하고 공기가 5분 동안 또는 라인이 건조될 때까지 흐르도록 합니다.

8. 데이터 분석

  1. 압력 직경 테스트의 경우 압력이 최소값에서 최대값까지 증가하기 시작하는 위치에서 데이터를 수집합니다. 힘 길이 테스트의 경우 힘이 감소하지 않도록 할 때까지 최대 최대 피크 바로 아래에서 데이터를 수집합니다.
  2. 각 압력 직경 테스트에 대한 데이터 파일을 열고 평균 압력 탭을 선택합니다. 마지막 곡선의 로딩 영역으로 이동하여 최대 압력으로 0 mmHg를 이동한 다음 데이터를 스프레드시트에 놓습니다. 외부 지름, 입구 압력, 출구 압력, 힘, 온도, pH 및 흐름 탭에서 각 항목을 동일한 문서에 배치하는 동일한 영역을 선택합니다.
  3. 각 힘 길이 테스트에 대한 데이터를 엽니다. 곡선의 로딩 영역(-2%~+2%)로 이동하여 데이터를 스프레드시트로 끌어서 놓습니다. 측정된 다른 변수에 대해 동일한 영역을 선택하고 각 항목을 동일한 스프레드시트에 배치합니다.
  4. 압력 직경 및 힘 길이 테스트의 경우 모든 압력 값에서 UP를 뺍니다.
  5. 평균 압력 직경 데이터는 1mmHg(예: 0+/- 0.5, 1+/-0.5, 2+/-0.5)마다.
  6. 오르간(V)의 언로드된 볼륨을 찾습니다. 수학식 1은 R02가 현미경에 의해 측정된 언로드 된 외부 반경, L은 언로드 길이, H는 초음파에 의해 검출 된 바와 같이 언로드 두께임을 감안할 때 V를찾는 데 이용 될 수 있습니다. 비압축성의 가정은 기관이 변형을 겪으면서 볼륨을 보존한다는 것을 의미합니다.
    참고: 언로드 길이는 봉합사에서 봉합사까지의 캘리퍼로 측정됩니다. 언로드 직경은 현미경, 카메라 및 소프트웨어를 통해 측정되고 반경의계산이 뒤따릅니다(도 5) 언로드 두께는 초음파 이미지로부터 계산됩니다(도 6).
    figure-protocol-3방정식 1
  7. 압축성 가정을 사용하여 언로드된 볼륨, 변형된 외부 반지름()figure-protocol-4figure-protocol-5및 길이()를 사용하여 figure-protocol-6 변형된 내부 반경을 결정합니다.
    figure-protocol-7방정식 2
  8. 방정식 3, 4 및 5를 사용하여 각 응력은 각각 계산합니다. 방정식 3-5에서 P는 내발압으로 정의되고 Ft는 트랜스듀서에 의해 측정된 힘이다.
    figure-protocol-8방정식 3
    figure-protocol-9방정식 4
    figure-protocol-10방정식 5
  9. 압력-지름 관계, 힘-압력 관계, 원주 응력-원주 스트레치 관계 및 축 응력 및 원주 스트레치 값을 플로팅합니다(그림7, 그림8). 중간벽 반지름을 사용하여 스트레치 값을 계산할 수 있습니다. 원주 및 축 응력의 계산은 각각 방정식 6과 7에서 찾을 수 있습니다.
    figure-protocol-11방정식 6
    figure-protocol-12방정식 7
  10. 생리적 압력 범위 근처와 생체 내 스트레치에서 규정 준수를 계산합니다. 하부 압력 결합(LPB)은 평균 측정 압력보다 낮은 1표준 편차입니다. 상부 압력 결합(UPB)은 측정된 평균 압력9보다1표준 편차입니다.
    figure-protocol-13
  11. 탄젠트 모듈리를 계산하여 재료 강성을 정량화합니다. 하부 압력 경계 및 상한 압력에 해당하는 계산된 원주 응력식별합니다. 생체 내 길이에서 식별된 응력 범위 내에서 원주 응력- 원주 스트레치 곡선에 선형 선을 맞춥습니다. 9선의경사를 계산합니다.

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결과

여성 생식 기관의 기계적 특성을 성공적으로 분석하는 것은 적절한 장기 해부, 통조림 및 검사에 달려 있습니다. 어떤 결점없이 질에 자궁 경적을 이식하는 것이 필수적입니다(그림 1). 장기 유형에 따라 캐뉼라 크기가 다를수 있습니다 (그림 2). 실험 중에 장기가 움직일 수 없지만 시술 중에 장기의 벽을 손상시키지 않도록캐밀을 수행해야합니다 (그림 3). 두 단계 중 어느 한 단계의 실패로 인해 선박이 압력을 유지할 수 없게 됩니다. 절차 표준화 테스트는 일관되고 반복 가능한 결과를 얻으려면 프로토콜의 성공에 필수적입니다.

일단 기관이 해부되고 제대로 굴절되면, 압력 근사 계열 시스템에 전원을 공급합니다. 압력 근측정시스템의 설정에는 컨트롤러 유닛, 유량계 및 스테이지가 포함됩니다(그림 4). 압력 myograph 시스템은 기계적 ...

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토론

본 서에 제공된 프로토콜은 뮤린 질 및 자궁 경부의 기계적 성질을 결정하는 방법을 제시한다. 이 프로토콜에서 분석된 기계적 특성에는 장기의 수동 및 기저 톤 조건이 모두 포함됩니다. 수동 및 기저 톤 조건은 기관이 침수되는 생화학 적 환경을 변경하여 유도됩니다. 이 프로토콜을 위해, 기초 시험에 관련시킨 매체는 칼슘을 포함합니다. 기저톤 상태를 테스트하면 여성 생식 기관 내의 평활근 세포 기계적 기여도의 격리를 허용54,55. 수동 기계 테스트를 수행 할 때, 매체는 칼슘을 포함하지 않습니다. 칼슘의 부족은 수축에서 평활근 세포를 억제합니다. 이것은 주로 수동 기계적 특성을 지시하는 콜라겐 및 탄성 섬유와 같은 다른 ECM 성분의 해명을 허용합니다. 생화학적 및 조직학적 분석과 결합될 때, 이러한 결과는 ECM 미세 구조 조성과 기계적 기능 사이의 관계를 해명할 수 있게 합니다. 이것은 여성의 생식 건강과 관련된 병리학의 구...

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감사의 글

이 작품은 NSF 커리어 어워드 보조금 #1751050 의해 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2F 카테터MillarSPR-320자궁경부 압력 측정을 위한 카테터
6-0 봉합정밀 과학 도구18020-60대형 봉합사 타이
CaCl2(무수)VWR97062-590HBSS 농도: 140mg/mL
CaCl2-2H20Fischer 화학물질 BDH9224-1KGbr/> KRB 농도: 3.68g/L
포도당(D-포도당)VWR101172-434HBSS 농도: 1000mg/mL
KRB 농도: 19.8g/L
Dumont #5/45 집게Fine Science Tools11251-35곡선 집게
Dumont SS 집게Fine Science Tools11203-25직선 집게
EclipseNikonE200현미경 이미징에 사용
유량계덴마크어 MyoTechnologies테스트 장치 내161FM
Force Transducer - 110PDanish MyoTechnologies100079력 변환기
ImageJSciJavaImageJ1부피 측정에 사용
기기 케이스Fine Science Tools20830-00해부 도구를 보관하는 케이스
KClFisher Chemical97061-566HBSS 농도: 400 mg/mL
KRB 농도: 3.5 g/L
KH2PO4G-Biosciences71003-454HBSS 농도: 60 mg/
mL MgCl2VWR97064-150
KRB 농도: 1.14 g/L
MgCl2-6H2OVWRBDH9244-500GHBSS 농도: 100 mg/ mL
MgSO4-7H20VWR97062-134HBSS 농도: 48 mg/ mL
Na2HPO4(이염기성 무수)VWR97061-588HBSS 농도: 48mg/mL
KRB 농도: 1.44g/L
NaClVWR97061-274HBSS 농도: 8000mg/mL
KRB 농도: 70.1g/L
NaHCO3VWR97062-460HBSS 농도 : 350 mg / mL
KRB 농도 : 21.0 g / L
압력 근 그래프 시스템Danish MyoTechnologies110P 및 120CP압력 근 그래프 시스템 :
prorgram, 캐뉼레이션 장치,
및 컨트롤러 유닛
압력 변환기Danish MyoTechnologies100106압력 변환기
Student Dumont # 5 집게미세 과학 도구91150-20스트레이트 집게
학생 Vannas 봄 가위미세 과학 도구91500-09마이크로 가위
조직 염료Bradley 제품1101-3생체 내 스트레치
초음파 변환기FujiFilm Visual SonicsLZ-550초음파 변환기 사용; 256개 요소, 40MHz 중심 주파수
VEVO2100FujiFilm Visual SonicsVS-20035
Wagner ScissorsFine Science Tools14069-12대형 가위
사 < 유량계 스프레드시트 에 사용되는 Mircosoft 엑셀 Microsoft 6278402 프로그램 측정을 위한 잉크 이미징에 사용되는 초음파

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