체외 전사 mRNA를 가진 1 차적인 대식세포의 고효율 형질감염

대식세포는 미생물, 세포 사멸 세포 및 세포 파편을 검출, 섭취 및 분해하는 것을 전문으로 하는 식세포입니다. 또한, 그들은 사이토 카인과 케모카인을 분비하고 T 세포와 B 세포에 항원을 제시하여 면역 반응을 조율하는 데 도움이됩니다. 대식세포는 또한 상처 치유, 동맥 경화증, 종양 발생 및 비만과 같은 수많은 다른 프로세스에서 중요한 역할을 합니다.

병원체 관련 분자 패턴(PAMPs) 및 손상 관련 분자 패턴(DAMPs)과 같은 비자기 분자를 검출할 수 있도록 대식세포는 광범위한 패턴 인식 수용체(PRR)를구비한다. 불행하게도, 이것은 또한 형질감염 시약³ 및 형질감염된 핵산^4,5,6,7이 종종 PR에 의해 비자기로 인식됨에 따라^2를 트랜스펙트하는 데 특히 도전적이다. 이러한 이유로, 화학적 또는 물리적^방법을 이용한 대식세포의 형질감염8은 일반적으로 형질감염된 핵산의 활성화 및 분해를 초래하거나, 심지어 는 DNA 또는 외국 RNA^9와같은 세포질 PAMPs/DAMPs의 인식 후에 촉발된 프로그램된 라이틱 세포 사멸의 한 형태인 형광핵산을 일으킨다. 벡터로서 아데노바이러스 또는 렌티바이러스와 같은 바이러스를 이용한 대식세포의 생물학적 형질감염은 종종 더 효율적이지만, 이러한 바이러스 벡터의 시공은 시간이 많이 소요되고 생체 안전수준 2^{장비(10,11)가}필요하다.

따라서, 대식세포는 집중적인 연구의 대상이지만, 분자 생물학의 가장 중요한 도구 중 하나이기 때문에 분자 수준에서의 기능 분석은 방해를 받으며, 외인성 발현을 위한 핵산 구성물의 형질전환은 거의 적용되지 않습니다. 이것은 수시로 보나 선의의 대식세포 보다는 오히려 대식세포 같이 세포주를 사용하기 위하여 연구원을 강제로 합니다. 핵산 구성 형질전환을 위한 응용분야는 돌연변이 또는 태그가 지정된 단백질 버전의 발현, 특정 단백질의 과발현, 각각의 녹아웃 배경에서의 단백질 재발현 및 다른 종으로부터의 단백질의 발현(예를 들어)을 포함한다. , Cre 재조합 또는 표적 유전자 녹아웃을 위한 RNA 및 Cas9를 가이드한다.).

여기에서, 우리는 플라스미드와 같은 DNA 템플릿에서 생성된 mRNA를 가진 뮤린 맥이원 대식세포 (PM) 및 골수 유래 대식세포 (BMDM)의 고효율 형질감염을 허용하는 프로토콜을 기술합니다. 중요한 것은, 이 프로토콜을 사용하여 생성된 시험관내 전사 mRNA는 면역원성을 감소시키고 안정성을 향상시키는 자연발생적 변형된 뉴클레오시드 5-메틸-CTP 및 의사-UTP를 함유하고^4,6,7,12,13. 더욱이, 시험관내 전사 mRNA의 5'-말단은 RIG-I 복합체^14,15에의한 인식을 방지하기 위해 남극 인산염에 의해 탈인성된다. 이는 시험관내 전사 mRNA의 선천적인 면역 인식을 최소화한다. 프로토콜을 수행하기 쉬운 경우, 50-65 %(후막 대식세포 (PM)와 85 % (BMDM) 사이의 형질 감염 비율은 세포 독성 또는 면역 원성이 관찰되지 않는 동안 도달합니다. 우리는 (i) 형질감염에 대한 면역학적으로 침묵된 mRNA가 플라스미드 및 (ii) 형질전환 절차 자체와 같은 DNA 구조로부터 어떻게 생성될 수 있는지 상세히 설명한다.

생쥐로부터의 대식세포 분리는 쾰른 대학의 윤리위원회에 따라 독일의 동물보호법에 따라 수행되었다.

참고: 장갑을 끼고 모든 단계를 수행하십시오. 세포의 오염을 방지하기 위해 층류 후드 아래에 모든 형질 감염 단계를 수행합니다. mRNA로 작업하기 전에 파이펫과 모든 표면을 70% 에탄올 및/또는 RNAE 분해 계면활성제(재료표)로청소하십시오. 모든 반응 튜브가 RNAE가 없고 멸균되었는지 확인하십시오. 희석을 위해 멸균된 RNAase 불물만 사용하십시오. 필터가 있는 파이펫 팁만 사용하십시오. 모든 파이펫 팅 단계 후 파이펫 팁을 변경합니다.

1. DNA 템플릿 생성

참고: 이 프로토콜을 사용하는 시험관 내 mRNA 전사에 대한 DNA 템플릿은 RNA 폴리머라제의 도킹을 허용하는 T7 운동 서열을 포함해야 한다. 관심 있는 단백질의 DNA 서열을 함유하는 플라스미드가 이미 정확하게 배향된 T7 운동 서열을 직접 상류에 포함하는 경우, 플라스미드의 선형화(단계 1.1 참조)가 수행되어야 한다. 그렇지 않으면, 중합효소 연쇄 반응에 의한 관심의 서열에 T7 프로모터를 부착한다(PCR, 단계 1.2 참조).

1. T7 프로모터 함유 플라스미드의 선형화
   1. 이미 관심 있는 서열의 스톱 코돈의 하류를 절단하는 제한 효소로 소화함으로써 올바르게 지향된 T7 프로모터 서열을 함유하고 있는 플라스미드를 선형화한다. 그렇지 않으면, 전사는 관심의 순서 후에 제대로 끝나지 않을 것이다.
      참고: 무딘 끝 또는 5' 오버행을 떠나는 제한 효소를 사용하는 것이 가장 좋습니다.
   2. 소화되지 않은 플라스미드 DNA대 소화되지 않은 아가로즈 겔 전기동동에 의한 플라스미드의 완전한 선형화를 확인한다.
   3. DNA 정제키트(표 오브 머티리얼)를이용하여 시험관 내 mRNA 전사를 위한 DNA 템플릿으로 사용하기 전에 선형화된 플라스미드 DNA를 정제하였다.
2. PCR에 의한 T7 프로모터 부착
   1. 다음 성분을 포함하는 순방향 프라이머를 사용(5' ~ 3'): 프로모터의 약 5개의 임의 bp 상류(예를 들어, GAAAT); T7 프로모터 서열(TAATACGActCACTATAG); 증가 전사 효율에 대한 두 개의 여분의 GS (GG); 표적 서열-개시 코던을 둘러싼 플라스미드 서열에 상동성인 타겟 서열 특이적 부분.
      참고: 코작 서열의 상류3-6 bp로 구성되어야 하며, 코돈 시퀀스, 코작 서열 및 스타트 코돈(일반적으로 GCCACC ATG G), 시작 코돈의 12-18 bp 하류로 구성되어야 한다. 관심서열이 KOZAK 서열또는 스타트 코돈들을 이미 함유하지 않은 경우, 이들은 단순히 프라이머 서열에 이들을 포함시킴으로써 이 단계에서 부착될 수 있다.
   2. 정방향 프라이머의_tm을 타겟 시퀀스에 상동한 부분을 고려하여 계산합니다.
   3. 디머 / 헤어 핀 형성을 평가하기 위해 쉽게 50 bp를 초과 할 수있는 전체 프라이머 시퀀스를 사용합니다.
   4. 스톱 코돈의 하류 어딘가에 위치한 역방향 프라이머를 사용합니다.
      참고: 관심시퀀스가 이미 스톱 코돈(stop codon)을 포함하지 않는 경우, 프라이머 서열에 간단히 포함시킴으로써 이 단계에서 부착될 수 있다.
   5. 전진 및 후진 프라이머를 사용하여교정(재료 표)을사용하여 고충실도 폴리머라제(자료 표)를 사용하여 PCR을 수행합니다.
   6. 아가로즈 겔 전기 동동에 의한 단일 생성 및 앰플리콘 크기의 생성을 확인합니다(예를 들어, 1% 아가로즈 겔 및 100V 정전류사용).
   7. DNA 정제 키트를 사용하여 시험관 내 mRNA 전사를 위한 DNA 템플릿으로 사용하기 전에 PCR 제품을 정제한다.

2. mRNA 생성

1. 시험관 내 mRNA 전사 키트의 모든 성분을 해동합니다(재료 표참조). 소용돌이 5 s와 2,000 x g에서2 s에 대 한 아래로 회전. 사용할 때까지 얼음을 유지하십시오.
2. 다음 순서로 0.5 mL 마이크로 원심 분리기 튜브에서 시험관 내 mRNA 전사에 대한 반응 혼합을 준비 (총 부피 40 μL): 20 μL의 10x ARCA/NTP 혼합 (시험관 내 mRNA 전사 키트에 포함); 0.25 μL 의 5-메틸-CTP (최종 농도 (f.c.) 는 1.25 mM; 총 CTP의 50%; 의사 UTP의 0.25 μL (f.c. 1.25 mM; 총 UTP의 50%); DNA 템플릿의 X μL; T7 RNA 폴리머라제 혼합물의 2 μL (체외 mRNA 전사 키트에 포함); RNAse 없는 H 2_O의Y μL.
   참고: X는 DNA의 적어도 1 μg를 포함하는 부피이다. 예를 들어, 625 ng/μL 스톡 솔루션으로부터 1.6 μL. Y는 총 부피 40 μL에 대한 예비 부피입니다.
3. 소용돌이 5 s와 2,000 x g에서2 s에 대 한 아래로 회전. 시험관 내 전사를 위해 열 믹서 상에서 400 rpm에서 30분 동안 37°C에서 배양한다.
4. 이어서, 템플릿 DNA의 제거를 위한 반응 혼합물에 직접 DNase I의 2 μL을 첨가한다. 소용돌이 5 s와 2,000 x g에서2 s에 대 한 아래로 회전.
5. 37°C에서 400 rpm에서 15분 동안 열 믹서에서 배양합니다. 대조군 겔(단계 3.3)에 대해 2 μL의 aliquot를 취하고 -80°C에서 보관한다.
6. 폴리(A) 테일링의 경우, 다음 성분을 이전 반응 혼합물에 직접 추가합니다(최종 부피 50 μL): 10x 폴리(A) 폴리라제 반응 완충액 5 μL 및 폴리(A) 폴리라제 5 μL(둘 다 시험관 내 mRNA 전사 키트에 포함됨). 소용돌이 5 s와 2,000 x g에서2 s에 대 한 아래로 회전.
7. 37°C에서 30분 동안 400 rpm에서 열믹서상에서 혼합물을 인큐베이션합니다. 대조군 겔(단계 3.3)에 대해 2 μL의 aliquot를 취하고 -80°C에서 보관한다.
8. mRNA의 5 ́ 말단의 탈인을 위해, 이전 반응 혼합물에 직접 다음 성분을 추가 (60 μL의 최종 부피에): RNAse-free H₂O의 3 μL; 6 μL 의 10x 남극 인산염 반응 완충제; 3 μL의 남극 인산염 (60 μL 반응 볼륨을 위한 15 단위). 소용돌이 5 s와 2,000 x g에서2 s에 대 한 아래로 회전.
9. 37°C에서 30분 동안 400 rpm에서 열 믹서상에서 혼합물을 인큐베이션합니다.
10. 열-불활성화 남극 인산염 80°C에서 2 분 동안 배양에 의해.
    참고: 이상적으로, 별도의 열 믹서를 사용하여 첫 번째 믹서가 원하는 온도에 도달 할 때까지 기다리지 마십시오.

3. mRNA 정화

1. 전용 RNA 정제키트(표 오브 머티리얼)를이용하여 시험관내 전사 mRNA를 정제한다.
   1. 2.10단계에서 mRNA 반응 혼합물에 용출 용액의 X μL을 첨가한다. 5번 뒤집어 섞으세요. 300 μL의 결합 용액 농축액을 추가하십시오. 부드러운 파이펫팅으로 5회 섞으세요.
      참고: X는 총 부피 100 μL에 대한 예비 볼륨입니다. 예를 들어, 60 μL mRNA 반응 믹스에 40 μL 용출 액을 추가합니다.
   2. RNAase 가 없는 에탄올 100 μL을 첨가합니다. 부드러운 파이펫팅으로 5회 섞으세요.
   3. 제공된 컬렉션 튜브 중 하나에 필터 컬럼을 배치합니다. 필터를 건드리지 않고 mRNA 반응 믹스를 필터의 중심으로 부드럽게 전달합니다. 실온(RT)에서 1분 동안 15,000 x g의 원심분리기.
   4. 조심스럽게 필터 컬럼을 들어 올리고 수집 튜브의 흐름을 폐기하십시오. 필터 컬럼을 동일한 수집 튜브에 다시 놓습니다.
   5. 500 μL의 세척 액을 추가하십시오 (처음으로 세척 용액을 사용하기 전에 RNAase가없는 에탄올 20 mL을 추가하는 것을 잊지 마십시오).
   6. RT에서 1분 동안 15,000 x g의 원심분리기를 반복하여 3.1.4-3.1.6단계를 반복하여 한 번 더 세척합니다.
   7. RT에서 최고 속도(17,900 x g)의원심분리기를 1분 간 사용하여 필터 컬럼에서 잔류 유체를 제거합니다. 조심스럽게 수집 튜브에서 필터 열을 가져 가라. 필터 열을 새 컬렉션 튜브에 배치합니다.
   8. 필터를 건드리지 않고 필터 중앙에 50 μL의 용출 버퍼를 추가합니다. 열 믹서에서 65 °C에서 10 분 동안 배양하십시오.
   9. RT에서 1분 동안 15,000 x g의 원심분리기를 제거하고 필터 컬럼을 제거하여 폐기합니다.
2. 용출 된 mRNA의 농도 와 순도를 측정, 예를 들어, 260 및 280 nm에서 흡광도를 측정하기 위해 마이크로 볼륨 분광광도계를 사용하여.
   참고: A260/A280 비율은 1.8-2.1이며 고도로 정제된 mRNA를 나타냅니다.
3. 변성 조건하에서 아가로즈 겔 전기영동에 의한 2.5단계 및 2.7단계에서 의aliquots를 분석하여 단일 제품의 존재를 확인하고, 정확한 전사체 길이 및 폴리(A)의 존재를 확인합니다(예를 들어, 20 mM3-(N-morpholino)를 함유하는 1.2% 아가로즈 겔을 사용함). 프로판설포닉산[MOPS], 5 mM 나트륨 아세테이트, 1 mM EDTA 및 20% 포름알데히드및 20 mM MOPS, 5 mM 나트륨 아세테이트, 1 mM EDTA 및 0.74 % 포름알데히드100 V 상수 전류에서 실행한다.
4. 정제된 mRNA를 용출관에 -80°C에서 형질전환될 때까지 저장한다. 형질감염에 대한 mRNA의 낮은 양만을 사용하는 경우, 반복된 동결 해동 주기를 피하기 위해 mRNA를 알리쿼트한다.
   참고: mRNA는 약 1년 동안 -80°C에서 보관할 수 있다.

4. 대식세포 준비

1. 자궁 경부 탈구에 의해 C57 / BL6 마우스를 안락사 (동성 및 6-24 주 생쥐사용).
   참고: 동일한 마우스는 PM(단계 4.2) 및 BMDM의 생성(단계 4.3 및 4.4)의 격리를 위해 사용될 수 있다. PM의 격리를 위해 적어도 2마리의 마우스를 사용한다. BMDM만 생성되는 경우 일반적으로 하나의 마우스만으로도 충분합니다.
2. 맥막 대식세포의 면역 자기 농축.
   1. 얼음 차가운 인산완충식염수(PBS) 8mL와 공기 2mL로 0.9 x 40mm 캐뉼라로 10mL 주사기를 채웁니다. PBS로 복강을 플러시합니다. 공기는 PBS의 누설을 최소화하는 거품을 형성합니다.
   2. 동일한 주사기로 복막 세척을 신속하게 수집하고 50 mL 원뿔 원심 분리 튜브로 옮김을 합니다. 필요한 경우 여러 마우스의 각막 세포를 결합합니다. 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다.
   3. 원심분리기 세포 현탁액은 4°C에서 5분 동안 650 x g에서. 상온액을 버리고 적혈구를 용해시키기 위해 30 s에 대한 0.2 % NaCl의 5 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단하십시오.
   4. 1.6% NaCl의 5mL를 총 부피 10mL에 추가하여 등소 조건을 재구성합니다. 4 °C에서 5 분 동안 650 x g에서 원심 분리기.
   5. 상복부를 버리고 자기 세포 선별 (MCS) 버퍼 (2 mM 에틸렌디아미네테트라 아세트산 [EDTA], PBS에서 5 % 소 혈청 알부민 [BSA]에서 97.5 μL에서 세포 펠릿을 다시 일시 중단 (예를 들어, 3 마리의 마우스가 플러시 된 경우, 29에서 29.29로 다시 일시 중단) ).
   6. 세포 현탁액의 97.5 μL당 CD11b 특이적 항체에 공액된 파라마그네틱 비드 2.5 μL을 추가합니다(예: 292.5 μL에 7.5 μL 추가).
   7. 궤도 셰이커에서 150rpm에서 15분 동안 얼음위에 배양합니다.
   8. 원심분리기 세포 현탁액은 4°C에서 5분 동안 650 x g에서, 상온액을 버리고 MCS 완충액의 1 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단한다.
   9. 총 부피 5mL에 4 mL의 MCS 버퍼를 추가하고 위아래로 세 번 부드럽게 피펫팅하여 셀을 세척하십시오.
   10. 4.2.8 단계와 4.2.9 단계를 총 3 회 두 번 반복하십시오.
   11. 세척 단계 동안 LS 컬럼을 자기 셀 구분기호에 놓습니다(재료 표참조). MCS 버퍼의 3mL로 컬럼을 헹급합니다.
       참고: 이러한 열이 막히게 될 수 있기 때문에 거품을 피하십시오.
   12. MCS 버퍼의 1 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 총 부피 4mL에 MCS 버퍼 3mL를 추가하고, 위아래로 세 번 파이펫팅하여 혼합합니다.
   13. 헹구된 LS 컬럼에 4 mL의 셀 현탁액을 전달합니다.
       참고: 다시 말하지만, 이러한 열이 막히게 될 수 있기 때문에 거품을 피하십시오.
   14. 열의 저장소가 완전히 비어 있는 때까지 기다립니다. 열이 떨어지는 것을 멈출 때까지 액체를 추가하지 마십시오.
   15. 열에 MCS 버퍼 3mL를 추가합니다. 그런 다음 열의 저장소가 완전히 비어 있는 때까지 기다립니다. 4.2.15 단계를 두 번 더 반복합니다.
   16. LS 컬럼을 15mL 원유 원심분리관에 놓습니다. 5mL의 MCS 버퍼를 열에 적용합니다. 2mL의 유체가 컬럼을 통과할 때까지 기다린 다음 플런저를 사용하여 나머지 부분을 튜브안으로 부드럽게 밀어 넣습니다.
   17. 원심분리기 세포 현탁액은 4°C에서 5분 동안 650 x g에서 상온액을 폐기한다.
   18. 10% 열불활성화 태아 송아지 혈청(FCS)(DMEM+FCS)으로 보충된 DMEM 1 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다.
   19. DMEM+FCS의 Neubauer 카운팅 챔버및 종자 세포에서 트라이판 블루 용액을 배양 플레이트에 계수하여 생존 가능한 세포의 수를 결정합니다.
       참고: 평평한 바닥 마이크로 티터 플레이트에서 100,000 셀 / 웰의 밀도에서 종자 PM. PM이 이들로부터 분리될 수 없기 때문에 조직 배양 처리 플레이트를 사용하지 마십시오. 대신 처리되지 않은 접시를 사용하십시오.
3. BMDM 의 생성
   1. 가위를 사용하여 뒷다리에서 피부와 근육을 제거합니다. 70% 에탄올로 각 다리를 짧은 침수로 씻으소서.
   2. 다리를 분리하고 가위로 절단하여 대퇴골과 경골의 양쪽 끝을 엽니 다.
   3. 0.6 mm x 30 mm 캐뉼라로 채워진 5 mL 주사기를 매우 낮은 내독소(VLE) RPMI 1640의 5mL로 채우고 열린 뼈에서 골수를 배양 접시로 씻어내시다.
   4. 4.3.1-4.3.3 단계를 반복하여 필요한 경우 여러 마우스의 골수를 결합합니다. 골수를 50 mL 원추형 원심분리관으로 옮긴다.
   5. 골수 현탁액을 650 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 상한액을 버린다.
   6. 적혈구 용해 완충액 (8.3 % NH₄Cl, 0.1 M Tris)의 5 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 RT에서 5 분 동안 배양하여 적혈구를 용해시합니다.
   7. 4° C에서 650 x g의 세포 현탁액을 5분 동안 원심분리하고 상한액을 폐기합니다.
   8. VLE RPMI 1640 배지의 1 mL에서 세포 펠릿을 10% FCS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1% HEPES, 1% 나트륨 피루바테 및 10 ng/mL 재조합 대식세포 콜로니 자극^{인자(RPMI+++++++++)로}보충하십시오.
   9. 총 부피 5mL에 RPMI^++++4mL를 추가합니다.
   10. 각 접시에 RPMI⁺⁺⁺⁺⁺ 배지 7mL를 파이펫팅하여 마우스당 5개의 92mm x 16mm 처리되지 않은 페트리 접시를 캠(재료 표참조)으로 준비합니다.
   11. 1 mL의 세포 용액을 5개의 준비된 배양 접시로 옮기고 37°C 및 5%_CO2에서배양한다.
   12. 4 일 후, RPMI^+++++의4 mL을 추가하여 세포를 먹이십시오. 6-7 일 후에 골수 세포는 BMDM으로 완전히 분화됩니다.
4. BMDM의 수확
   1. 배양 요리에서 배지를 완전히 제거하십시오. 각 요리에 PBS에 따뜻한 0.2 mM EDTA 5 mL을 추가합니다.
   2. BMDM을 분리하기 위해 셀 스크레이퍼로 전체 접시를 부드럽게 긁어냅니다. 50 mL 원원심분리관에 셀 현탁액을 결합합니다.
   3. 5가지 요리를 모두 다시 씻어내십시오. 5가지 요리 모두에 대해 PBS에서 따뜻한 0.2 mM EDTA의 5 mL동일한 볼륨을 사용하십시오. 이 셀 서스펜션을 이전 단계의 서스펜션과 결합합니다.
   4. 4° C에서 5 분 동안 650 x g에서 세포 현탁액을 원심 분리하고 상급을 폐기하십시오.
   5. VLE RPMI 1640 배지의 1 mL에서 세포 펠릿을 10% FCS, 1% HEPES, 1% 나트륨 피루베이트 및 10 ng/mL 재조합 M-CSF로 보충했지만 항생제는 없습니다(RPMI^++++++).
   6. RPMI^++++의 Neubauer 계수 챔버및 종자 세포에서 트라이판 블루 용액을 배양 플레이트에 계수하여 생존 가능한 세포의 수를 결정합니다.
      참고: 평평한 바닥 마이크로 티터 플레이트에서 50,000 셀 / 웰 최대의 밀도에서 종자 BMDM. BMDM이 이들로부터 분리될 수 있기 때문에 조직 배양 처리 플레이트를 사용하지 마십시오. 대신 처리되지 않은 접시를 사용하십시오.

5. mRNA를 가진 대식세포의 형질전환

1. mRNA 형질 감염 버퍼의 필요한 부피를 계산합니다.
   참고: 필요한 mRNA 형질 전환 버퍼의 부피는 잘 크기에 따라 달라집니다 : 6 웰 플레이트에서 형질 감염에 200 μL, 12 웰 플레이트에서 100 μL 등을 사용합니다. 항상 파이펫팅 손실로 인해 약간의 여분의 부피를 추가하십시오 (mRNA의 과도한 희석을 방지하기 위해 너무 많이하지는 않습니다). 예를 들어, 4 x 100 μL = 400 μL 대신 450 μL을 사용하여 12웰 플레이트의 4웰에서 트랜스펙트합니다.
2. mRNA 형질감염 시약의 필요한 부피를 계산합니다. mRNA 형질감염 시약은 1:50의 비율로 첨가된다. 예를 들어, mRNA 형질감염 시약의 9 μL은 450 μL의 최종 부피에 요구된다.
3. 필요한 mRNA의 총량을 계산합니다. 100,000개의 대식세포당 적어도 100ng은 효율적인 형질감염에 필요하며, 200 ng는 더 잘 작동합니다(예를 들어, 800 ng mRNA에서 400,000개의 대식세포를 트랜스펙트하기 위해).
   1. 형질감염되어야 하는 총 웰 수와 필요한 mRNA의 계산된 양을 곱합니다(예를 들어, 4개의 웰과 4개의 대식세포각각: 4 x 800 ng = 3,200 ng mRNA는 모든 웰에 대해 합계로 요구됩니다). 예를 들어 mRNA 스톡이 426.8 ng/μL인 경우 각각 400,000개의 대식세포가 있는 4개의 웰의 최적 형질 감염에 7.49 μL이 필요합니다.
4. mRNA 형질감염 완충제의 계산된 부피(단계 5.1.)를 mRNA 형질감염 시약(단계 5.2)과 mRNA(단계 5.3)에 대한 부피를 반응 튜브에 추가한다. 예를 들어, 450 μL - 9 μL - 7.49 μL = 433.51 μL.
5. mRNA 스톡을 해동하고 용출 튜브를 부드럽게 뒤집어 혼합합니다. mRNA 반응 완충액을 가진 반응 튜브에 mRNA(단계 5.3)의 계산된 부피를 추가합니다(상술한 예에서: 433.51 μL에서 7.49 μL).
6. 소용돌이 5 s와 2,000 x g에서2 s에 대 한 아래로 회전.
7. 소용돌이 mRNA 형질 감염 시약 5 s에 대 한 및 2 s에 대 한 스핀 다운 2,000 x g.
8. mRNA 형질감염 시약의 계산된 부피를 mRNA 형질감염 완충제 및 mRNA를 포함하는 반응 튜브에 첨가한다(상술한 예에서: mRNA 형질감염 시약의 9 μL).
9. 5 s에 대한 형질 전환 믹스를 소용돌이 2,000 x g에서2 s동안 스핀 다운 .
10. RT에서 15 분 동안 인큐베이션하십시오.
11. 한편, 대식세포의 배양 배지를 신선하고 따뜻한 배양 배지로 대체합니다(단계 4.2.18 및 4.4.5 참조).
12. 인큐베이션 단계 5.10 후, 웰의 크기에 적합한 부피로 대식세포를 함유하는 웰에 형질감염 혼합을 첨가한다(단계 5.1 참조). 웰의 중간에 외부에서 원에 드롭 으로 형질 전환 믹스를 추가합니다.
13. 부드럽게 잘에서 형질 전환 믹스의 균일 한 분포를 보장하기 위해 먼저 수직으로 다음 수평 방향으로, 플레이트를 흔들어. 이어서, 37°C 및 5%_CO2에서배양한다. 형질감염된 mRNA에 의해 인코딩된 단백질의 합성은 형질전환 직후에 시작될 것이다. 최상의 결과를 얻으려면 적어도 6 시간 동안 배양하십시오.
14. 배양 후, (면역)형광 현미경, 유세포 분석 또는^{면역블롯(16)에}의한 형질감염 효율을 분석하거나, 또는 형질감염된 대식세포를 사용하여 선택의 실험을 한다.

우리는 1차 대식세포16의형질감염에 대한 FLAG 태그가 있는 NEMO 및 IKKβ 변이체에 대한 mRNA 인코딩을 생성하기 위해 이 프로토콜을 성공적으로 사용했습니다. 플래그 태그가 지정된 야생 형 (NEMOWT)및 C54/347A 돌연변이 NEMO (NEMOC54/374A)에대한 플라스미드 인코딩은 이미 올바른 방향으로 T7 전차를 포함하고 있습니다(그림1A). 따라서, 우리는 시험관 내 전사를 위한 DNA 템플릿을 생성하기 위하여 플라스미드를 선형화할 뿐이 있었습니다. 이를 위해, 10 μg의 플라스미드 DNA를 5 μL Xbal으로 소화시켜 스톱 코돈의 단일 컷 3'으로 인해 플라스미드의 선형화를 초래했다. 플라스미드 DNA의 완전한 선형화는 아가로즈 겔 전기동동에 의해 확인되었다(도1B).

플래그 태그가 있는 야생형(IKKβWT)및 S177/181E 돌연변이체 IKKβ(IKKβS177/181E)에대한 플라스미드 인코딩은 T7 프로모터를 포함하지 않는다. 따라서, 우리는 시험관 내 전사를 위한 DNA 템플릿을 생성하기 위해 PCR에 의해 T7 프로모터를 부착하였다(도2A). 특정 PCR 생성, 즉 정확한 크기의 단일 생성물은 아가로즈 겔 전기동동에 의해확인되었다(도 2B).

각각의 DNA 템플릿을 사용하여 시험관내 전사 후, 우리는 변성 조건 하에서 아가로즈 겔 전기동에 의한 정확한 크기 및 폴리(A) 테일링의 단일 mRNA 생성을 검증하였다(도3).

이 프로토콜을 사용하여 생성된 mRNA가 1차 대식세포의 형질을 가능하게 하는지 확인하기 위해(PM의면역자기 농축 및 분화 상태의 유동 세포측정 분석을 위한B 참조), 우리는 eGFP(그림5A-C)에대한 mRNA 인코딩을 생성하고 유세포 분석(그림6A)에의한 형질감염 효율을 분석하였다. 치료되지 않은 마이크로티터 플레이트의 웰당 100,000 PM 또는 50,000 BMDM을 6, 9 또는 24 시간 동안 eGFP mRNA의 50, 100 또는 200 ng로 형질감염하였다. PM 및 BMDM 모두에서, 높은 수준의 eGFP 발현은 형질전환 후 6시간에서 검출될 수 있었다. 형질감염율은 형질감염된 mRNA의 양과 함께 증가하고 200 ng mRNA에 대해 가장높았다(도 6B,C). PM의 경우, 형질전환율은 형질전환 후 6~9시간에서 약 50-65%에이르렀다(도 6B). 형질감염 후 24시간에서, 형질감염속도는 eGFP 발현만료를 나타내는 실질적으로 더 낮았다. 따라서 PM은 하룻밤 사이에 형질 감염되어서는 안됩니다. BMDM의 경우, 형질전환율은 약 80-85%에 달하였다(그림6C). 24 시간 후에 형질 감염 비율에 있는 투하율은 BMDM에서 훨씬 적게 두드러졌습니다. 따라서, BMDM은 하룻밤 사이에 형질감염될 수 있다. PM(도6D,E)및 BMDM(도6F,G)에서형질감염된 세포에서의 eGFP발현 수준은 시간-및 투여 의존적 방식으로 증가하였다. 중요한 것은, 형질전환 시술은 형질전환 후 프로피듐 요오드화 양성(PI) 또는 부속생 V 양성 대식세포의 증가가 없었기 때문에 용리또는 세포사멸을 유도하지않았다(도 7A,B).

플래그 태그NEMO 또는 IKKβ 변이체에 대한 mRNAs 인코딩의 형질감염 효율은 면역형광 현미경 검사법에 의해 분석되었다. 12웰 플레이트의 웰당 300,000PM은 6h. 형질감염율에 대해 각각의 mRNA의 300 ng로 형질감염되었고, NEMO mRNAs에 대해 약 60%, IKKβ mRNAs에 대해 약 55%였다(도8A,B). 따라서, 그들의 형질감염률은 PM에 대한 약 55%의 일반적인 형질감염율을 나타내는 eGFP mRNA의 것과 유사하였다.

우리는 또한 Cre 재조합에 대한 mRNA 인코딩을 생성하기 위해이 프로토콜을 사용했다. NEMO플록스/플록스 마우스로부터 400,000 BMDM의 형질감염은 48시간 후 NEMO 단백질에 대한 거의 완전한 고갈을 초래한 12웰 플레이트의 12웰 플레이트당17개(그림 9)로BMDM의 고효율 트랜스펙션을 나타낸다.

PM 및 BMDM은 형질전환 후 IL-1β, IL-6 및 TNF의 검출 가능한 양을 분비하지않았다(도 10A,B). 더욱이, NF-kB 및 MAPK 신호경로는 형질감염 시술이 전염증성 시그널링을 활성화하지 않음을 나타내는형질감염(16) 후에 활성화되지 않았다. 우리는 또한 트랜스 감염되지 않은 대식세포16에비해 형질 감염 된 대식세포의 기능적 변화를 관찰하지 않았습니다.

그림 1: 올바른 방향으로 T7 프로모터를 이미 함유하고 있는 NEMO 인코딩 플라스미드의 선형화. (A)플래그 태그 NEMOWT 또는 NEMOC54/347A에대한 플라스미드 인코딩의 시퀀스 발췌. 올바른 방향과 KOZAK 서열 및 스타트 코돈에 가까운 T7 프로모터가 이미 존재합니다. T7 프로모터 영역, FLAG 태그 및 NEMO에 대한 코딩 시퀀스(CDS), 시작 및 정지 코돈 및 XbaI를 사용하여 선형화를 위한 제한 사이트는 색상 코딩된다. (B)Xbal을 가진 선형화 전후에 플라스미드를 나타내는 1% 아가로즈 겔을 대표한다; 1 μL의 미처리, 선형화 또는 정제된 선형화된 플라스미드 DNA를 차선당 적재하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: PCR에 의한 IKKß-인코딩 플라스미드에 대한 T7 프로모터 부착. (a)플래그 태그가 지정된 IKKβWT 또는 IKKβS177/181E에대한 플라스미드 인코딩의 서열 발췌. 플라스미드는 PCR에 의해 부착되는 적합한 T7 프로모터를 포함하지 않습니다. 정방향 프라이머의 위치, 방향 및 서열(추가될 T7 프로모터 서열을 포함)과 역입문서화살표로 지시된다. T7 프로모터 영역, FLAG 태그 및 IKKβ용 CDS 및 시작 및 정지 코돈은 색상으로 구분됩니다. (B)대표적인 1% 아가로즈 겔은 상기 명시된 프라이머를 이용하여 정확한 크기의 단일 PCR 제품의 생성을 검증한다. 정제된 PCR 제품의 1 μL을 차선당 적재하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 3: NEMO-및 IKKβ-인코딩 DNA 템플릿으로부터의 mRNA 합성. (a)대표적인 변성 1.2% agarose 젤을 함유하는 0.7% 포름알데히드가 정제된 mRNA를 나타내는 NEMO 및 IKKβ 컨스트럭트 전후 폴리(A) 테일링. NEMOWT의2 μL, NEMOC54/347A,IKKβWT 및 IKKβS177/181E mRNA를 레인당 적재하했다. 32 μL ssRNA 사다리를 RNA 길이 측정을 위해 적재하했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 4: PM의 면역자기 농축 및 BMDM의 분화 상태의 유동 세포측정 분석. (a)면역자기 농축 전후의 후막 세척에서 F4/80+/CD11b+ PM의 백분율을 유세포분석으로 분석하였다. (B)6일간의 분화 후 BMDM에 의한 F4/80 및 CD11b의 발현은 유세포측정에 의해 확인되었다. 10,000 또는 5,000 개의 세포는 각각 샘플 당 계산되었다. 데이터는 n=3개의 독립적인 실험의 평균 ±SEM으로 나타내며, 각각. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 및 **** P < 0.0001 학생의 t-시험에 의해. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 5: eGFP의 폴리(A) 테일링과 mRNA 합성. (a)eGFP용 플라스미드 인코딩의 시퀀스 발췌. 플라스미드는 PCR에 의해 부착되는 적합한 T7 프로모터를 포함하지 않는다. 정방향 프라이머의 위치, 방향 및 서열(추가될 T7 프로모터 서열을 포함)과 역입문서화살표로 지시된다. T7 프로모터 영역, eGFP용 CDS 및 시작 및 정지 코돈은 색상으로 구분됩니다. (B)상기 에 표시된 프라이머를 이용하여 PCR 후 정제된 앰플리폰을 나타내는 1% 아가로즈 겔을 대표한다. 정제된 PCR 제품의 1 μL을 차선당 적재하였다. (C)대표적인 변성 1.2% 아가로즈 겔을 함유하는 0.7% 포름알데히드가 폴리(A) 테일링 전후의 eGFP의 정제된 mRNA를 나타낸다. eGFP mRNA의 2 μL을 차선당 적재하했다. 32 μL ssRNA 사다리를 RNA 길이 측정을 위해 적재하했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: eGFP mRNA를 가진 맥막 대식세포 및 BMDM 둘 다의 고효율 형질감염. 대식세포는 제트메신저 또는 제트메신저 단독(mock)으로 복합된 eGFP mRNA의 50, 100 또는 200 ng를 사용하여 6, 9 또는 24h를 배양한 다음 유세포 분석으로 분석하였다. (A)실행 가능한 대식세포, 실행 가능한 eGFP+ 대식세포 및 PI+ (즉, 죽은) 대식세포의 집단을 정의하는 데 사용되는 게이팅 전략. 6 시간 동안 200 ng mRNA를 가진 형질감염에 대한 대표적인 데이터가 도시된다. (B, C) (B)PM 및(C)BMDM의 형질감염률은 유세포분석에 의한 생존 가능한 eGFP 양성 세포의 백분율을 분석하여 결정하였다(n=5-7 및 n=4-5 독립적인 실험). (D-G) eGFP의 발현 수준은 생존가능한(D)PM 및(F)BMDM의 평균 형광 강도(MFI)를 분석하고(E)PM 및(G)BMDM(n=5-7 및 n=4-5 독립적인 실험)의 생존 가능및 eGFP 양성 하위 모집단의 각각을 분석하였다. 10,000개의 세포를 샘플당 계수하였다. 데이터는 평균 ± SEM. n.s. = 유의하지 않음으로 표시됩니다. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 및 **** P < 0.0001 학생의 t-시험에 의해. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 7: 형질감염은 사멸 세포 사멸을 유발하지 않는다. 형질감염 유발 세포사멸(A)PM 및(B)BMDM은 PI 양성 및 아넥신 V 양성 세포의 백분율을 분석하여 결정하였다(n=5-7 및 n=4-5 독립적인 실험). 비감염 샘플에 존재하는 죽은 대식세포의 백분율(어느 정도의 세포 사멸은 처리되지 않은 플레이트의 사용에도 불구하고 우물에서 대식세포의 물리적 분리에 의해 야기되었다)는 각 형질감염 샘플에서 형질감염 시료에서 만 형질감염 절차에 의해 유발된 세포 사멸을 고려하도록 감산되었다. PI+,아넥신V+및 PI+/별관V+의 집단을 정의하는 데 사용되는 게이팅 전략은 6h에 대해 200 ng mRNA로 형질감염된 PM의 대표적인 데이터 세트에 대해 도시된다. 스타우로스포린(50 μM for 1 h)을 양성 대조군으로 사용하였다. 10,000개의 세포를 샘플당 계수하였다. 데이터는 평균 ±SEM. n.d. = 검출할 수 없음으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8: NEMO 및 IKK 구문에 대한 mRNA 인코딩을 사용한 형질감염 률. (A)NEMO 구문 및(B)IKK 구문에 대한 mRNA 인코딩을 이용한 형질감염 속도는 면역형광 현미경 검사법(n=4 독립적 실험)에 의해 정량화되었다. 스케일 바 = 4 μm. 데이터는 평균 ± SEM. n.t. = 형질감염되지 않음, n.s. = 유의하지 않음; * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 및 **** P < 0.0001 학생의 t-시험에 의해. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 9: Cre 재조합에 대한 mRNA 인코딩을 사용하여 NEMOfl/fl BMDM의 형질전환은 NEMO에 대한 거의 완전한 결핍을 초래한다. NEMOfl/fl 마우스로부터의 BMDM은 48시간 동안 Cre 재조합아제를 코딩하는 mRNA로 형질전환하였고, Cre-mediated 녹아웃의 결과로 NEMO 단백질에 대한 결핍은 NEMO 또는 β-actin을 인식하는 특정 항체를 사용하여 서쪽 얼룩에 의해 평가되었고 밀도 측정에 의해 정량화되었다(n=5 독립적인 실험). 데이터는 평균 ± SEM. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 및 **** P < 0.0001학생의 t-test에 의해 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 10: 형질감염은 전염증반응을 유도하지 않는다. (a)PM 및(B)BMDM은 NEMOWT 또는 NEMOC54/347A에대한 mRNA 인코딩으로 형질감염되었다. 양성 대조군으로서, 대식세포는 1의 감염의 복합성에서 리스테리아 단세포유전자에 감염되었거나 5 시간(PM) 또는 24시간(BMDM)에 대해 5 μg/mL LPS 또는 폴리(I:C)로 자극되었다. IL-1 β, IL-6, 및 TNF를 상체체내로 분비하여 ELISA(n=3독립적인 실험)에 의해 정량화하였다. 데이터는 평균 ± SEM. n.t. = 형질감염되지 않음, n.d. = 검출할 수 없음으로 나타내었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 공개 할 것이 없다.