방법 논문

체외 전사 mRNA를 가진 1 차적인 대식세포의 고효율 형질감염

DOI:

10.3791/60143

⸱

2019년 11월 9일

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1Institute for Medical Microbiology, Immunology and Hygiene, Faculty of Medicine and University Hospital Cologne, University of Cologne, 2Center for Molecular Medicine Cologne, 3Cologne Cluster of Excellence on Cellular Stress Responses in Aging-associated Diseases (CECAD), 4German Center for Infection Research (DZIF)

이 논문에서

요약

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대식세포, 특히 1차 대식세포는 비자기 기원의 분자를 검출하는 것을 전문으로 하기 때문에 트랜스펙트에 도전하고 있습니다. 우리는 플라스미드와 같은 DNA 템플릿에서 생성된 mRNA를 가진 1 차적인 대식세포의 고도로 능률적인 형질혈을 허용하는 프로토콜을 기술합니다.

초록

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대식세포는 비자기 기원의 분자를 검출하는 것을 전문화한 식세포이다. 이를 위해, 이들은 대량의 패턴 인식 수용체(PRR)를 구비한다. 불행하게도, 이것은 또한 형질전환 시약 및 형질감염된 핵산이 종종 PRR에 의해 비 자기로 인식되기 때문에 형질전환에 특히 도전하게 한다. 따라서 형질감염은 종종 형질감염된 핵산의 활성화 및 분해를 초래하거나 대식세포의 자살에도 초래한다. 여기에서, 우리는 복막 대식세포 (PM) 및 골수 파생 대식세포 (BMDM)와 같은 min의 1 차적인 대식세포의 고도로 능률적인 형질감염을 허용하는 프로토콜을 말합니다. 이 간단한 프로토콜을 사용하면 PM에 대해 약 50-65 %의 형질 감염 비율과 BMDM에 대한 약 85 %가 세포 독성 또는 면역 원성 관찰없이 달성됩니다. 우리는 플라스미드 및 형질전환 절차와 같은 DNA 구조에서 형질전환에 대한 mRNA의 생성을 상세히 기술한다.

서론

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대식세포는 미생물, 세포 사멸 세포 및 세포 파편을 검출, 섭취 및 분해하는 것을 전문으로 하는 식세포입니다. 또한, 그들은 사이토 카인과 케모카인을 분비하고 T 세포와 B 세포에 항원을 제시하여 면역 반응을 조율하는 데 도움이됩니다. 대식세포는 또한 상처 치유, 동맥 경화증, 종양 발생 및 비만과 같은 수많은 다른 프로세스에서 중요한 역할을 합니다.

병원체 관련 분자 패턴(PAMPs) 및 손상 관련 분자 패턴(DAMPs)과 같은 비자기 분자를 검출할 수 있도록 대식세포는 광범위한 패턴 인식 수용체(PRR)를구비한다. 불행하게도, 이것은 또한 형질감염 시약3 및 형질감염된 핵산4,5,6,7이 종종 PR에 의해 비자기로 인식됨에 따라2를 트랜스펙트하는 데 특히 도전적이다. 이러한 이유로, 화학적 또는 물리적방법을 이용한 대식세포의 형질감염8은 일반적....

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프로토콜

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생쥐로부터의 대식세포 분리는 쾰른 대학의 윤리위원회에 따라 독일의 동물보호법에 따라 수행되었다.

참고: 장갑을 끼고 모든 단계를 수행하십시오. 세포의 오염을 방지하기 위해 층류 후드 아래에 모든 형질 감염 단계를 수행합니다. mRNA로 작업하기 전에 파이펫과 모든 표면을 70% 에탄올 및/또는 RNAE 분해 계면활성제(재료표)로청소하십시오. 모든 반응 튜브가 RNAE가 없고 멸균되었는지 확인하십시오. 희석을 위해 멸균된 RNAase 불물만 사용하십시오. 필터가 있는 파이펫 팁만 사용하십시오. 모든 파이펫 팅 단계 후 파이펫 팁을 변경합니다.

1. DNA 템플릿 생성

참고: 이 프로토콜을 사용하는 시험관 내 mRNA 전사에 대한 DNA 템플릿은 RNA 폴리머라제의 도킹을 허용하는 T7 운동 서열을 포함해야 한다. 관심 있는 단백질의 DNA 서열을 함유하는 플라스미드가 이미 정확하게 배향된 T7 운동 서열을 직접 상류에 포함하는 경우, 플라스미드의 선형화(단계 1.1 참조)가 수행되어야 한다. 그렇지 않으면, 중합효소 연쇄 반응에 의한 관심의 서열에 T7 프로모....

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결과

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우리는 1차 대식세포16의형질감염에 대한 FLAG 태그가 있는 NEMO 및 IKKβ 변이체에 대한 mRNA 인코딩을 생성하기 위해 이 프로토콜을 성공적으로 사용했습니다. 플래그 태그가 지정된 야생 형 (NEMOWT)및 C54/347A 돌연변이 NEMO (NEMOC54/374A)에대한 플라스미드 인코딩은 이미 올바른 방향으로 T7 전차를 포함하고 있습니다(그림1A). 따라서, 우리는 시험관 내 전사를 위한 DNA 템플릿을 생성하기 위하여 플라스미드를 선형화할 뿐이 있었습니다. 이를 위해, 10 μg의 플라스미드 DNA를 5 μL Xbal으로 소화시켜 스톱 코돈의 단일 컷 3'으로 인해 플라스미드의 선형화를 초래했다. 플라스미드 DNA의 완전한 선형화는 아가로즈 겔 전기동동에 의.......

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토론

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여기에서 우리는 시험관 내 전사 mRNA를 가진 일반적으로 단단한 transfect 1 차 적인 대식세포의 고도로 능률적인 형질혈을 위한 프로토콜을 제시합니다. 중요한 것은, 이 프로토콜을 사용하는 대식세포의 형질감염은 세포 사멸을 유도하거나 형질감염 시약이나 형질감염된 mRNA가 비자기로 인식되지 않는다는 것을 나타내는 전염증성 신호를 활성화하지 않는다는 것이다.

mRNA의 질은 이 프로토콜을 사용하여 대식세포의 성공적인 형질화에 매우 중요합니다. 따라서, mRNA가 RNA와 접촉하지 않는다는 것을 주의해야 한다 (예를 들어, 오염된 완충제 또는 바이알을 통해). 의심스러운 경우 mRNA 분해를 확인하십시오 (예를 들어, 아가로즈 겔 전기 동동에 의해). 형질감염률 및 발현 수준은 이미 형질감염 후 6시간에서 최대치였다. 따라서, 관심 있는 단백질이 형질전환 후 초기 시점에서 분석에 충분한 수준으로 발현될 수 있다. 우리는 이것을 테스트하지 않았습니다. 더욱이, mRNA의 더 .......

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

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이 작품은 도이치 포르충제마인샤프트(SFB 670)의 지원을 받았다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
5-methyl-CTP (100 mM)Jena BiosienceNU-1138S-20 °에 저장했습니다. C
남극 인산가수분해효소New England BioLabsM0289-20°C에 저장되었습니다. C
남극 인산가수분해효소 반응 완충액 (10x)New England BioLabsB0289-20°C에 보관; C
anti-NEMO/IKKγ 항체InvitrogenMA1-41046-20°C에 보관됨; C
anti-β-actin 항체Sigma-AldrichA2228-20°C에 저장되었습니다.
C 페트리 접시 92,16 RT저장된Sarstedt821,473
Microbeads 마우스와 인간Miltenyi Biotec130-049-601저장된 캠 4 ° C
Cre recombinase + T7-Promotor 전방 프라이머Sigma-Aldrich5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGGCAGCCGCCACCATGTCC
AATTTACTGACCGTAC-3´, -20 ° C
Cre 재조합 효소 + T7-Promotor 리버스 프라이머Sigma-Aldrich5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG
C-3′, -20°C에 저장; C
DNA 정제 키트: QIAquick PCR 정제 키트Qiagen28104RT
eGFP + T7-Promotor 전방 프라이머Sigma-Aldrich5´-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGATCCATCGCCACCATGGTG
AGCAAGG-3´에 보관됨, -20°E에 저장됨; C
eGFP + T7-Promotor 리버스 프라이머Sigma-Aldrich5´-TGGTATGGCTGATTA
TGATCTAGAGTCG-3´, -20 ° C
Fast Digest buffer (10x)Thermo ScientificB64-20 ° C
FastDigest XbaIThermo ScientificFD0684-20 °에서 보관됩니다.
C 교정을 통한 고충실도 중합효소: Q5 고충실도 DNA-중합효소New England Biolabs IncM0491S-20°C에 보관됩니다. C
IKKβ + T7-Promotor 앞으로 뇌관Sigma-Aldrich5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGTTGATCTACCATGGACTACA
AAGACG-3′, -20 ° C
IKKβ + T7-Promotor 리버스 프라이머Sigma-Aldrich5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, -20 °에 저장; C
In vitro mRNA 전사 키트: HiScribe T7 ARCA mRNA 키트(폴리A 테일링 포함)New England BioLabsE2060 -20°에 보관; C
LS 컬럼Miltenyi Biotec130-042-401RT
MACS MultiStand에 보관Miltenyi Biotec130-042-303
mRNA 형질주입 완충액 및 시약에 저장됨: jetMESSENGERPolyplus 형질주입409-0001DE는 4°C에 저장됨; C
돌연변이 IKKβ IKK-2S177/181E 플라스미드Addgene11105-20°C에 보관됨; C
돌연변이 NEMOC54/347A 플라스미드Addgene27268-20 °에 저장됨; C
pEGFP-N3 플라스미드Addgene62043-20 °C에 저장됨; C
폴리 (I : C)Calbiochem528906-20 °deg에 저장됩니다. C
pPGK-Cre 플라스미드F.T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, 유도성 Cre 재조합효소의 새로운 변이체: Cre-PR 융합 단백질의 새로운 돌연변이는 향상된 감도와 확장된 유도성 범위를 나타냅니다. 핵산 Res. 29, 47e (2001). -20 °에 저장; C
pseudo-UTP (100 mM)Jena BiosienceNU-1139S-20 °C에 저장됨; C
QuadroMACS 분리기Miltenyi Biotec130-090-976RT
Rat-anti-mouse CD11b 항체, APC-conjugatedBioLegend1012124°deg에 저장했습니다. C
Rat-anti-mouse F4/80 항체, PE-conjugatedeBioscience12-4801-824°C에 보관됨; C
재조합 M-CSFPeprotech315-02-20°C에 보관됨; C
RNA 정제 키트: MEGAclear 전사 세척 키트ThermoFisher ScientificAM19084°°C; C
RNAse-degrading 계면활성제: RnasZAPSigma-AldrichR2020
E.coli O111:B4Invivogen저장됨 -20 ° C
야생형 IKKβ -Addgene11103; C
야생형 NEMO 플라스미드Addgene27268-20 °에 보관됨; 씨
는 는 은 은 CD11b에 에 는 는 는 는 C은 됨 은 RT는 은 은 는 은 는 는 은 의 RT Ultrapure LPS에 20 °에 저장된 플라스미드 은

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ley, K., Pramod, A. B., Croft, M., Ravichandran, K. S., Ting, J. P. How Mouse Macrophages Sense What Is Going On. Frontiers in Immunology. 7 (204), (2016).
  2. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and oppo....

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