무혈 식단으로 무혈 모기를 후두

벡터 매개 질병은 전 세계적으로 수백만 명의 인간에게 영향을 미치고 매년 수백만 명의 사망을 초래합니다. 그(것)들은 감염된 호스트에게서 혈액을 먹을 때 취득한 질병 생성 미생물 (원생 동물, 바이러스)에 감염된 곤충에 의해 전달됩니다. 이어서, 감염된 벡터는 다음 혈액 식사 동안 새로운 숙주에게 병원체를 전달할 것이다. 말라리아는 Anopheles 모기의 몇몇 다른 종에 의해 전달되고 세계 인구의 40%에 영향을 미치는 치명적인 벡터 품어진^{질병입니다 1.} 말라리아 protist 기생충은 400,000의 죽음 이상 에 책임 있고, 그 중 대부분은 5 세 이하 아이들입니다 (세계 보건 기구). 암컷 아노필레스 모기는 척추동물 혈액을 먹을 때 인간과 다른 동물 사이에 플라스모듐 속의 말라리아 기생충을 전달하며, 계란 생산 및 발달에 필요한^단계2.

말라리아 및 기타 신흥 치명적인 모기 벡터 매개 질병의 박멸을위한 현재의 전략은 곤충에서 사육 된 많은 모기의 야생으로 방출을 포함하는 혁신적인 모기 제어 전략^3,4,5의개발에 의존합니다. 그러나, 중요한 제한 요인은 효과적인 모기 사육 및 사육을 위한 신선한 혈액의 공급에 의존합니다. 척추 동물 혈액의 가변 구성은 모기 불임과 자손 적당에 부정적인 영향을 미칠 수 있으며 포로 사육 식민지의 신뢰성과 지속 가능성을 제한 할 수 있습니다. 모기 방출 및 통제 프로그램은 대규모 모기 생산 시스템과 대량의 척추 동물 혈액의 정기적 인 공급을 필요로한다. 이것은 모기 생산에 대한 주요 장애물이며 살아있는 동물의 사용과 관련된 일련의 윤리적 문제와 관련 까다로운 안전 규정으로 인한 물류 제한문제를 제기합니다. 이것은 모기 식민지의 유지 보수 및 보안의 비용을 높게 만들고 말라리아의 위협이 훨씬 더 큰 저소득 국가에서 특히 현재 모기 사육 관행의 지속 가능성에 도전합니다.

최근 연구는 척추동물 혈액식사를 모방하는 혈액대체제의 개발에 초점을 맞추고 있으나, 지금까지는^{6, 7,8,9에}한정된 성공만^이뤄지고있다. 성공적인 인공 식단은 (1) 전체 여성 모기 engorgement을 자극할 필요가 있고, (2) 트리거 vitellogenin 생산, (3) 실행 가능한 계란의 큰 배치를 생산하고, (4) 히스 자손^10을생성한다. 또한, 인공 식단은 표준 구성을 가지고 있으므로 연구 및 제어 목적으로 모기의 생산을 위해 더 신뢰할 수 있습니다. 성공적인 무혈 식단은 Aedes 모기 (곤잘레스와 한센^11에의해 검토됨)를 위해 개발되었지만 Anopheles spp. 기존 인공 식단에는 파고 자극제 (예 : ATP^10),계란 성숙을위한 단백질 공급원^6,12,탄수화물이 에너지의 원천으로, 아미노산 (aa)은 13 가지 의 원천이며, 아미노산 (aa)은¹³ 가지 의 주요 생산 인자입니다. 인공 혈액 무료 다이어트 또한 콜레스테롤을 제공 해야^15,계란 생산을 향상 시키는. 여기에서 우리는 여성 Anopheles 모기를 위한 인공 적인 무혈 식단을 설명하고 고품질 척추동물 혈액 식사에 일관되고 동등한 성과를 가지고 있다는 것을 보여줍니다.

마우스는 IHMT 동물 집에서 수득하였다. 동물 실험은 포르투갈 법과 실험실 동물의 사용에 대한 지침에 따라 엄격하게 수행되었다. 디레카오-제랄 드 베테리나리아, 미니스테리오 다 아그리큘라 두 데센볼비멘토 농촌 e 다스 페스카스, 포르투갈은 모든 연구 프로토콜을 승인했다 (ID 승인: 023351 및 023355).

참고: 모든 수유 검사를 ~26°C에서 수행합니다.

1. 모기

1. 26 °C에서 Anopheles coluzzii (전 Anopheles 감비아 M 형태) Yaoundé 균주 모기를 유지, 75% 습도 12 h:12 h빛에서: 어두운 주기. 결합을 보장하기 위해 표준 곤충 조건을 사용하여 모기를 집.
2. 작은 물 용기에 모기 새끼를 수집합니다. 어른 모기가 나타나고 짝짓기를 할 수 있도록 모기 장 안에 용기를 놓습니다. 10% 포도당 공급 용액을 제공합니다. 출현 3 일 후 흡입구를 사용하여 재고 케이지에서 필요한 수의 모기를 수집합니다.
3. 수유 시험 하루 전에 10 % 포도당 공급 용액을 제거하십시오.
   참고: 실험 기간 내내 3일된 모기를 사용하였다.

2. 모기 먹이주기

1. 인공 액체 다이어트의 준비
   1. 층류 캐비닛에서 멸균 조건하에서 인공 액체 식단을 준비하십시오. 초기 액체 식단(i-liq_diet에 다음을 첨가하여 풍부한 액상 식단(r-liq_diet)을 준비한다. 덜베코의 수정된 독수리 배지 [L-글루타민을 가진 높은 포도당], 표 1참조: 0.55 g/L ATP, 1 g/L 콜레스테롤, 그리고 200 g/L 소 혈 청 알부민 (BSA). 모든 재료를 철저히 혼합하고 0.45 μm 마이크로 필터를 사용하여 여과하십시오.
      참고 : 다이어트를 저장하지 마십시오; 그들은 저장 될 때 품질을 잃게로 각 실험에 대한 재고 솔루션에서 갓 다이어트를 준비합니다. 식단의 구성 요소는 표 1에기재되어 있습니다.
2. 마우스 혈액 수집
   1. 6-8주된 CD1 암컷마우스(근육근육)를케타민(120 mg/kg)과 자일라진(16 mg/kg)으로 자궁내 경로를 사용하여 마취시다.
   2. 마우스가 상이한 물리적 자극(예를 들어, 발가락 및 꼬리 핀치)에 반응하여 근육 반응을 보이지 않는 경우 심장펑크(그림 1)를수행한다.
   3. 혈전 형성을 방지하기 위해 1mg/mL 헤파린(나트륨 염)의 100 μL을 함유한 27G x 1/2°C(0.4 x 12 mm²⁾바늘로 멸균 된 1 mL 주사기를 사용하여 혈액을 수집하십시오. 수조를 사용하여 37 °C에서 혈액을 유지하십시오.
3. 인공 수유
   1. 흡입기를 사용하여 스톡 케이지에서 약 30마리의 암컷 모기를 수집합니다.
   2. 암컷 모기를 500 mL 종이 컵에 옮기고 탈출할 수 없도록 미세한 모기장 그물망으로 덮습니다. 플라스틱 튜브에 연결된 유리 피더를 적용하여 각 컵의 상단으로 일정한 물 흐름을 유지합니다(그림2). 원통형 튜브 및 피더에 일정한 물 흐름을 제공하여 내부 온도가 약 37.5 °C로 유지되도록 합니다.
      참고: 표준 유리벨 인공 수유^{장치(16)를} 사용하여 여성 모기에 제형식이 공급되었다.
   3. 파라핀 막막을 유리 피더의 입에 걸쳐 스트레칭하여 식사를 포함시킵니다.
   4. 수조를 사용하여 37°C에서 i-liq_diet r-liq_diet 미리 데운다. 유리 공급에 1 mL를 바하십시오. i-liq_diet, r-liq_diet 또는 신선한 마우스 혈액으로 어둠 속에서 모기를 60 분 동안 먹이세요. 26 °C에서 검사를 수행합니다.
4. 공급 속도의 평가.
   1. 인공 수유 후, 30 초에 -20 °C에서 모기를 마취.
   2. 완전히 격분한 암컷 모기의 수를 기록한다(그림3)
      참고 : 먹이 모기의 비율은 먹이 성공을위한 프록시로 사용됩니다.

3. 삶의 역사 특성

1. 계란 생산 및 불 임
   1. 브러시를 사용하여 완전히 응축된 암컷을 개별 케이지(20cm x 20cm x 20cm)로 옮김을 옮니다.
   2. 모기를 26 ± 1 °C, 75 % 습도 및 12 h : 12 h : 12 h 의 빛 : 10 % 포도당 광고 리비텀이있는 어두운 주기로 유지하십시오.
   3. 수유 후 48시간, 가습 된 여과지를 달걀 누워서 바닥에 추가합니다(그림 4). 핸드헬드 돋보기를 사용하여 계란 누워 종이를 추가 한 후 48 시간 및 72 시간에서 계란을 계산합니다. 계란을 수집하기 위해 증류수로 필터 종이를 홍수.
2. 유충 사망률
   1. 계란을 증류수로 채워진 쟁반(23cm x 15cm x 6cm)에 넣습니다(그림5). 실험 중에 트레이의 수위를 일정하게 유지합니다.
   2. 트레이 당 약 13 mg의 생선 사료로 매일 애벌레에게 먹이주세요. 모든 복제 트레이에 유사한 공급 체제를 적용합니다.
   3. 죽은 번데기와 애벌레를 매일 제거하십시오. 모든 번데어가 성인으로 발전했을 때 실험을 마무리하고 성인 남성과 여성의 수를 계산합니다.
   4. 해칭 및 사망 날짜를 등록하고 사망률을 계산합니다.
3. 근속 기간
   1. 각 다이어트 그룹의 F1 세대에서 성인 남성 15명과 성인 여성 15명 수컷과 암컷을 같은 케이지에 보관하십시오.
   2. 성인에게 10% 포도당 용액 광고 리비텀을 먹이게 하십시오. 죽은 성인을 매일 제거하십시오.
   3. 위에서 설명한 것과 동일한 온도, 습도, 광순환 조건 및 설탕 공급 체제에서 모기를 유지합니다.
   4. 사망 날짜를 등록하고 수명을 계산합니다.
4. 날개 길이 측정
   1. 감기-마취 5 일 된 F1 성인 모기 (남성과 여성) 각 다이어트 그룹에서 -20 °C에서 90 s.
   2. 스테레오스코프 아래에서, 집게로 각 모기의 흉부들을 부드럽게 잡고 복부 쪽을 위로 놓습니다.
   3. 메스를 사용하여 두 날개를 수집하고 장착 매체의 건조 한 방울을 포함하는 깨끗한 현미경 슬라이드에 배치합니다. 20G 바늘의 도움으로 커버 슬립의 테두리에 추가 장착 매체를 추가하고 천천히 날개에 커버 슬립을 낮춥습니다.
   4. 마이크로미터를 사용하여 스테레오스코프로 날개 길이를 측정합니다(그림6).

아래에 설명된 결과는 초기 액체 식단(i-liq_diet) 또는 신선한 혈액 식사에 공급된 풍부한 인공 식사(r-liq_diet)와 모기를 공급한 여성 Anopheles 모기의 성과를 비교합니다. 이 식단은 도 7에도시된 회로도 프로토콜에 따라 테스트되었습니다. 본 명세서에 기재된 r-liq_diet 특허의 일부입니다(PCT/IB2019/052967).

완전히 응고 된 여성의 비율

r-liq_diet 공급된 암컷 모기의 수(89%) 혈액에 공급 된 여성의 수보다 상당히 높았다 (56%) (그림8).

여성스러움과 다산

첫 번째 gonotrophic 주기에 대 한 여성 fecundity 및 불 임 i-liq_diet 및 r-liq_diet 영양 품질을 평가 하는 데 사용 되었다. 평균 24 ±11 계란신선한 척추 동물 혈액에 공급 하는 여성에 의해 마련 되었다, 반면 r-liq_diet 먹이 암컷 25 ± 5 계란의 평균 을 마련(표 2). i-liq_diet 먹이를 준 암컷은 알을 낳는 것이 관찰되지 않았다.

F1 사망률

F1 모기의 적합성은 척추동물 혈액에 공급된 식민지 사이 또는 r-liq_diet 평가되었습니다. 유충, 번데기 및 성인 사망률이 기록되었다. 가변성(평균 [SEM]의 표준 오차)는 r-liq_diet 공급한 모기에 비해 혈액공급모기(도 9 및 표 2)에서더 높았다. 혈액 또는 r-liq_diet 먹이 모기의 F1 세대는 비교 사망률 및 생존율을 했다.

F1 기대 수명

그것은 야생 성인 여성 모기가 한 달까지 살고 있지만 아마 1-2 주 이상 생존하지 않고 수컷이 약 일주일 동안 살고 꿀과 다른 설탕 소스에 독점적으로 공급하는 질병 통제 및 예방 센터에 의해 추정된다. 부모 음식 섭취량의 차이는 모기자손17의생존에 영향을 미칠 수 있다는 점에 유의하십시오. 우리의 실험에서, 성인 여성과 혈액에서 남성 (여성 24.5 ± 6.8; 남성 18.5 ± 6.9) 및 r-liq_diet (여성: 22.5 ± 8.1; 남성: 11.9 ± 6.9) 그룹은 유사한 평균 평균 수명을 가지고 있었다(표 3)여성에 비해 수명 증가 기간을 보였다.

F1 본체 사이즈

날개 길이는 성인의 신체 사이즈의 지표로 사용되었습니다. 다른 종에 비해, Anopheles 성인은 2.8 에 4.4 mm 날개 길이18사이 날개 길이를 가진 중소형 모기입니다. R-liq_diet 공급한 F1 Anopheles 모기의 성인 체크기는 예상 범위 내에 있었고, 혈액을 공급하는 곤충 모기와 유사하였다(그림10).

통계 분석

제시된 데이터는 적어도 3개의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다(달리 명시되지 않는 한). 오류 막대는 SEM을 나타냅니다. 데이터가 가우시안 분포를 따랐을 때, 독립 그룹은 학생의 t 시험을 사용하여 비교되었고, 그렇지 않으면 Mann-Whitney 시험이 적용되었다. 인공 식이 공급 그룹 간의 차이는 피셔의 정확한 시험을 사용하여 분석되었고 P ≤ 0.05에서 유의한 것으로 간주되었다.

그림 1: 심장 내 천자에 의한 CD1 마우스 혈액 수집. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 표준 인공 공급 장치. 유리 피더에는 여성 아노페레스 모기에게 공급되는 r-liq_diet 포함되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 인공 수유 후 모기를 아노헬레스. 왼쪽에서 오른쪽으로: r-liq_diet 제공 된 완전히 engorged 여성, r-liq_diet 제공 된 비-engorged 여성, 남성, 그리고 마우스 혈액을 제공 했다 완전히 engorged 여성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: Anopheles 계란 r-liq_diet 가진 암컷의 사후 공급 48 시간 낳은. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: L2 유충 단계는 계란으로부터 개발되어 여과지에서 수집되고 증류수를 함유하는 트레이에 놓였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: Anopheles coluzzii 여성 모기의 F1 세대에서 오른쪽 날개. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: 인공 식단 테스트의 회로도 프로토콜. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8: 암컷 모기의 먹이 비율은 인공 식이요법이나 혈액을 먹였다. 별표는 r-액체와 i-액체 규정식 및 혈액 공급통제단을 공급한 모기 사이 중요한 다름을 표시합니다. 양면 피셔의 정확한 검사: ****P ≤ 0.0001 (상대 위험: 0.4828, 95% 자신감 수준 [CL]: 0.3776 받는 번째 0.6194) r-액체 다이어트 대 혈액에 대 한, *P = 0.0335 (상대 위험: 1.379, 95% CL: 1.044 에 대 한 혈액. 파란색: fed; 빨간색: 먹이. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 9: F1 Anopheles coluzzii 모기의 사망률 및 남성/여성 비율에 제형화된 무혈 식사의 효과. 3개의 독립적인 실험이 각각 규정식 당 30개의 모기를 사용하여 수행되었습니다. 짝을 이루지 않은 t-검정은 혈액공급군과 r-liq_diet공급군(P값은 0.5047에서 0.8491로 다양함) 사이에 유의한 차이를 보이지 않았다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 10: 날개 길이. 변두리 세타를 제외한 R4+5 정맥까지의 축 절개로부터의 거리를 날개 길이를 결정하는데 사용되었다. 크기는 각 식이 그룹(평균 ± SEM)에서 5명의 암컷 및 5명의 남성에 대해 평가되었다. 값은 평균 ± SEM. 연어: r-liq_diet; 빨간색: 척추혈액. 페어링되지 않은 t-검정; 여성 왼쪽 날개: t = 1.300, df = 8, P = 0.2298; 남성 왼쪽 날개: t = 2.400, df = 8, P = 0.0432; 여성 오른쪽 날개: t = 1.300, df = 8, P = 0.2298; 남성 오른쪽 날개: t = 2.277, df = 7, P = 0.0569. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: i-액체 식이및 r-액체 식이의 조성물.

표 2: 아노필레스 콜루지 암컷이 생산한 달걀 배치. 각각 30마리의 암컷 모기를 사용하여 각 실험 식단에 대해 3개의 독립적인 실험을 수행하였다.

표 3: F1 아노헬레스 모기의 평균 수명. 인위적으로 공급된 F0에서 F1 모기의 장수는 동일한 식이 그룹 (15 명의 암컷과 15 명의 남성이 뒤따랐다)에서 오는 각 모기의 출생과 사망 날짜를 기록하여 평가되었다. 결과는 규정식 단 당 평균 모기 수명 으로 표현됩니다.

저자는 공개 할 것이 없다.