여기에서, 우리는 형질전환 성 외피염 예쁜꼬마선에서 녹색 형광 단백질을 발현하는 살아있는 뉴런 세포의 특정 그룹의 단순 분리를 위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 특정 뉴런에 초점을 맞춘 다양한 생체 내 연구를 가능하게하고 추가 단기 배양세포를 분리 할 수있는 능력을 갖는다.
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이 논문에서
요약
초록
노화 과정 동안, 많은 세포는 많은 노인 및 병리 조건의 기초가 세포 기능 장애로 이어지는 손상의 높은 수준을 축적. 유사 분열 후 뉴런은 노화에 의해 영향을받는 주요 세포 유형을 나타냅니다. 뉴런 노화의 여러 포유류 모델이 존재하지만, 그들은 확립하기 어렵고 비용이 많이 듭니다. 둥근 벌레 예쁜꼬마선충은 이 동물들이 짧은 수명, 사용 가능한 강력한 유전 도구 상자 및 잘 분류된 신경계를 가지고 있기 때문에 신경 노화를 연구하는 강력한 모델입니다. 본원에 제시된 방법은 형질전환 녹색 형광 단백질(GFP)의 발현에 기초하여 특정 세포의 원활한 분리를 허용한다. GFP를 발현하는 형질전환 동물 라인은 뚜렷한 세포 유형 특이적 프로모터로 소화되어 외부 표피를 제거하고 기계적으로 기계적으로 다양한 세포 유형을 함유하는 슬러리를 생성하도록 중단된다. 관심있는 세포는 형광 활성화 세포 선별을 통해 비 표적 세포로부터 분리되거나 반대로 GFP 결합 된 자기 구슬에 의해 분리됩니다. 단리된 세포는 제한된 시간 동안 배양되거나 실시간 정량적 PCR에 의한 전사 분석과 같은 세포 특이적 생체 분석에 즉시 사용될 수 있다. 따라서, 이 프로토콜은 C. elegans에있는 다른 신경 인구 내의 세포 특정 반응의 신속하고 강력한 분석을 허용합니다.
서론
지난 수십 년 동안, 메타조안 모델 유기체 인 Caenorhabditis 예쁜꼬마선충은 뉴런, 신경 회로 및 생리 및 행동 반응에서의 역할 및 노화 관련 신경 퇴행성 연구에 엄청난 자산이었습니다. 질병. C. elegans의 유일한 특징은 동물이 투명하다는 것입니다, 모든 성인 체세포의 혈통이매핑될 수 있도록 1. C. 예쁜꼬마선충은 또한 신경의 관리 가능한 양을 항구, 잘 이해되는 신경계의 형태와 연결로 이끌어 내는2. 불변 세포 혈통, 짧은 수명, 그리고 C. elegans에 사용할 수 있는 높은 처리량 유전 도구의 풍부는 다른 신경 인구 내의 노화의 연구를 위한 이상적인 모형 유기체합니다.
뉴런과 신경 퇴행성 질환의 노화는 복잡하며 각 장애에는 독특한 병리학 적 서명이 있습니다. 그러나, 파킨슨병및 알츠하이머병과 같은 이러한 장애의 많은 경우, 일반적인 특징은 잘못 접힌단백질의 점진적 하중3,4,5이다. 이 두 질병 에서, ....
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프로토콜
1. 세포 격리를위한 세 벌레의 준비 및 수집
참고: 아래에 설명된 것은 미네소타 대학의 케노하브디티스 유전학 센터(CGC) 균주 저장소에서 얻은 형질전환 unc-17:GFP균주(OH13083)에서 콜린성 뉴런의 분리입니다. 곰팡이 나 박테리아의 오염을 방지하기 위해 멸균 상태를 유지하는 것이 필수적입니다.
- T. Stiernagle16에의해 설명된 바와 같이 표백 방법을 통해 벌레를 준비하고 동기화합니다. 노화 실험을 위해, 난자 생성을 줄이고 계란 부화를 체포하기 위해 25 μM 의 플루오로데옥시우리딘 (FuDR)을 함유한 선충 성장 배지 (NGM) 플레이트에 판 벌레를 함유하고 있습니다. 한천 판을 정기적으로 검사하여 오염이나 달걀 부화로 인해 신뢰할 수 없는 결과를 초래할 수 있으므로 이를 방지합니다.
참고: unc-17:GFP세포의 경우, 전형적으로 3개의 100 mm x 15 mm NGM 플레이트는 충분한 양의 관심 있는 세포를 분리하는 데 사용된다16. - 웜을 수집하고 셀 격리를 위한 버퍼를 준비합니다.
- 15 mL 원엽 튜브에 벌레를 수집합니다. ....
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결과
여기에 기술된 프로토콜은 unc-17의특정 분리를 허용합니다 ::GFP 양성 콜린성 뉴런은 세포 유형 별 유전자 발현 프로파일링 및 최종과 같은 후속 생체 내 연구를 위해 둥근 벌레 C. elegans에서 패치 클램프 전기 생리학 측정을 위한 단기 배양.
그림 1은 unc-17::GFP양성 콜린성 뉴런을 정상 설정에서 나타낸다. unc-17 유전자는 C. elegans 바디 및 vesicular 아세틸콜린 막 횡단 수송기(17)를위한 부호를 통하여 발현된다. 이 유전자의 발현은 머리, 중체 및 꼬리 뉴런 및 뉴런 프로젝션에서 관찰될 수 있습니다.
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토론
둥근 벌레 C. 예쁜 꼬마는 신경 건강과 질병을 연구하는 잘 설립되고 강력한 모델입니다2. 이러한 동물을 조작할 수 있는 충분한 유전 적 도구와 정확하게 매핑 된 다양한 뉴런 유형의 관리 가능한 양을 사용하면 비교적 적은 양의 재료로 많은 양의 데이터를 수집 할 수 있습니다. 여기서는 전체 동물로부터 뚜렷한 뉴런을 분리하는 최적화된 방법을 설명합니다. 벌레의 외부 표피 단백질을 방해함으로써, 뉴런및 근육 세포를 포함하여 다양한 세포 유형의슬러리를 분리할 수 있다 5. 이러한 단리된 세포는 다양한 독특한 실험에서 사용될 수 있다. 유세포 분석 또는 항체 표지 자기 비드를 통해 세포 선별을 사용하는 능력은 특정 실험의 매개 변수에 의존하는 적응 기술을 허용합니다. 특정 C. elegans 세포 모형에서 RNA를 추출하는 것은 또한 각종 세포 프로세스의 더 철저한 검사 그리고 기계론적인 이해를 허용합니다.
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
우리는 제니퍼 폭스 박사와 칼리몬축 연구소의 회원들에게 통찰력있는 의견에 감사드립니다. 우리는 건강의 국가 학회에서 지원을 인정 (R01 GM108975 O.K.와 T32 GM107001-01A1 E.M.G.에).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 6웰 플레이트 | Fisher Scientific | 12-556-004 | |
| 한천, 분자생물학 등급 | VWR | A0930 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| 클로로포름 | 시그마 | 496189 | |
| Contess 자동 세포 계수기 | Invitrogen | Z359629 | |
| DTT | USBiological | D8070 | |
| 에탄올 | Decon Labs | 2701 | |
| FBS | 오메가 사이언티픽 | FB-02 | |
| 플루오로데옥시우리딘 | 시그마 | F0503 | |
| HEPES | 시그마 | H3375 | |
| 이소프로판올 | VWR | BDH1133 | |
| KCl | Amresco | O395 | |
| KH2PO4 | USBiological | P5110 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professionals | 7552 | |
| Leibovitz의 L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| MgSO4 | USBiological | M2090 | |
| Na2HPO4· 7H2O | USBiological | S5199 | |
| NaCl | VWR | X190 | |
| NaOCl (표백제) | Clorox | ||
| NaOH | Amresco | O583 | |
| 페니실린-스트렙토미센 | 피셔 사이언티픽 | 15140122 | |
| 펩톤 Y | USBiological | P3306 | |
| Pronase E | 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) | ||
| SDS, | Amresco | O227 | |
| SMT1-FLQC 형광 실체현미경 | Tritech Research | ||
| Sucrose | USBiological | S8010 | |
| SuperScript IV 원스텝 합성 키트 | , ThermoFisher | 12594025 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596026의 프로테아제 혼합물 | 페놀 및 구아니딘 이소티오시아네이트 용액 |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | T10Z82 | |
| α-GFP 마그네틱 비드 | MBL | D153-11 |
참고문헌
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100, 64-119 (1983).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. Th....
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재인쇄 및 허가
