거대한 바이러스 혼합물 분리를 위한 형광 활성화 세포 분류에 대한 대체 전략으로서의 단일 세포 마이크로 포부

요약

여기서, 우리는 감염된 아메바의 분리를 위한 단일 세포 마이크로 흡인 방법을 기술한다. 파우스토바이러스와 알려지지 않은 거대 바이러스에 감염된 Vermamoeba vermiformis의 바이러스 하위 집단을 분리하기 위해, 우리는 아래에 자세히 설명된 프로토콜을 개발하고 두 개의 저풍부 신규 거대 바이러스를 분리하는 능력을 입증했습니다.

초록

아메바 공동 배양 과정 동안, 하나 이상의 바이러스가 단일 웰에서 단리될 수 있다. 우리는 이전에 바이러스 집단에 적용된 종점 희석 및/또는 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 이 문제를 해결했습니다. 그러나 혼합물의 바이러스가 유사한 형태학적 특성을 가지고 있고 바이러스 중 하나가 천천히 증식하면 게놈 조립 단계에서 두 바이러스의 존재가 발견되고 바이러스가 추가 특성화를 위해 분리 될 수 없습니다. 이 문제를 해결하기 위해 우리는 매우 유사한 바이러스의 분리 및 복제를 허용하는 단일 세포 마이크로 흡인 절차를 개발했습니다. 본 작품에서, 우리는 이 대체 전략이 어떻게 우리가 Clandestinovirus ST1와 Usurpativirus LCD7의 작은 바이러스성 소집단을 분리하는 것을 허용하는지, 천천히 성장하고 용해 및 급속하게 성장하는 것에 비해 아메발 용해로 이끌어 내지 않는 거대한 바이러스를 제시합니다 파우스토바이러스. 순도 대조군은 특정 유전자 증폭에 의해 평가되었고 바이러스는 추가적인 특성화를 위해 생산되었다.

서론

핵세포질 대형 DNA 바이러스 (NCLDV)는 진핵생물^1을감염시키는 4개의 가족에 의해 정의된 극단적으로 다양합니다. 300 kbp 이상의 게놈을 가진 제1기 바이러스는 파라메치움 부르사리아 클로렐라 바이러스 1 PBCV1^2를포함하는 Phydcodnaviridae이었다. Mimivirus의 격리 및 첫 번째 설명은, 입자의 크기(450 nm)와 게놈(1.2 Mb)의 길이 모두에서 바이러스의 크기가 두 배로 증가한다는 것을 보여주었다^3. 그 이후로, 많은 거대한 바이러스는 아메바 공동 배양 절차를 사용하여 일반적으로 격리, 설명되었다. 상이한 형태와 유전적 내용을 가진 몇몇 거대한 바이러스는 마르세유바이러스, 판도라바이러스, 피토바이러스, 몰리바이러스, 세드라트바이러스, 팩만바이러스, 투판바이러스, 및 최근 을 포함하는 세포로부터 분리될 수 있다. 메두사 바이러스^4,5,6,7,

프로토콜

1. 아메바 문화

1. Vermamoeba vermiformis (균주 CDC19)를 세포 지원으로 사용하십시오.
2. 프로테아제-펩톤-효모 추출물-글루코스 배지(PYG)(표1)와아메바의 3 mL를 75 cm² 세포 배양 플라스크에 1 x 10 6 세포/mL의 농도로 첨가한다.
3. 28°C에서 배양을 유지한다.
4. 48 시간 후, 계산 슬라이드를 사용하여 아메배를 정량화.
5. 헹구려면 세포를 1 x 10⁶ 세포 / mL의 농도로 수확하고 아메배를 원심 분리하여 10 분 동안 720 x g로 제거하십시오. 셀/mL(표1)을참조하십시오.

2. 아메바에 있는 주식 바이러스의 전파

참고: 희석 전에, 충분한 신선한 배양을 얻기 위해 스톡 샘플을 배양한 다음 여과를 진행하는 것이 중요하다.

1. 기아 매체에 아메바 배양액 1 x 10^6을 사용하십시오.
2. 0.01의 감염 (MOI)....

결과

단세포 마이크로 흡인은 이 원고에 최적화된 미세 조작 과정이다(도1). 이 기술은 둥근, 감염된 아메바(그림 2A)의포획을 가능하게하고 감염되지 않은 아메바(그림 2)를포함하는 새로운 판에서 방출한다. 그것은 공동 문화 시스템에 적용 하 고 성공적으로 비 lytic 거 대 한 바이러스를 격리 하는 기능 프로토 타입. 이 접근법은 거대한 바이러스 분야에서 처음으로 사용되었으며 두 개의 새로운 저풍부 거대 바이러스를 분리할 수 있게 했습니다. 우리는 새로운 바이러스 Clandestinovirus ST1 및 Usurpativirus LCD7, 높은 풍부파우스토 바이러스에 비해 낮은 풍부했다 명명. 마이크로 흡인 절차 후 각 플레이트의 바이러스 존재를 분석하기 위해 15 마이크로 포부에 PCR을 적용했습니다. 우리는 순수한 우스르파티바이러스 (우스.......

토론

단일 셀 마이크로 흡인 처리의 지속 시간과 그 양호한 기능은 연산자 의존적입니다. 실험의 다른 단계에는 정밀도가 필요합니다. 워크스테이션의 미세 조작 성분의 사용은 마이크로 흡인 의 과정과 세포의 방출을 관찰하여 일정한 제어를 받아야합니다. 현미경 관찰에 의한 후속 조치는 세포의 포획 및 전달에 필요합니다. 숙련된 작업자는 10개의 세포를 분리하고 격리할 바이러스의 풍부에 따라 하나씩 다시 전송하는 데 1~2시간이 걸릴 수 있습니다. 조작 횟수는 다를 수 있습니다. 우리는 10 조작으로 시작하는 것이 좋습니다. 정의에 따르면, 우리는 알 수없는 바이러스의 본질적인 특성을 모른다. 따라서, 이러한 바이러스를 분리하는 성공을 최적화하기 위해 격리를 위한 다양한 전략의 사용 및 개발이 필요하다.

마이크로 흡인 과정은 살균되지 않은 조건 (미생물 안전 스테이션 외부의 벤치)에서 수행되므로 사용을 제한하고 인간 병원균 연구를위한 응용 프로그램을 방지합니다. 따라서 오염 물질을 제한하기 위.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Agarose Standard	Euromedex	Unkown	Standard PCR
AmpliTaq Gold 360 Master	Mix Applied Biosystems	4398876	Standard PCR
CellTram 4r Oil	Eppendorf	5196000030	미세흡인 공정 중 세포 제어
Corning 세포 배양 플라스크 150 cm2	Sigma-aldrich	CLS430825	Culture
코닝 세포 배양 플라스크 25 cm2	Sigma-aldrich	CLS430639	배양
코닝 세포 배양 플라스크 75 cm2	Sigma-aldrich	CLS430641	배양
DFC 425C 카메라	LEICA	Unkown	Observation/Monitoring
Eclipse TE2000-S Inverted Microscope	Nikon	Unkown	Observation/Monitoring
EZ1 advanced XL	Quiagen	9001874	DNA 추출
Glasstic Slide 10 with Counting Grids	Kova International	87144E	Cell count
Mastercycler nexus	Eppendorf	6331000017	Standard PCR
Microcapillary 20 µ m	Eppendorf	5175 107.004	Microaspiration and release of cells
Micromanipulator InjectMan NI2	Eppendorf	631-0210	Microcapillary positioning
Nuclease-Free Water	ThermoFischer	AM9920	Standard PCR
Optima XPN Ultracentrifuge	BECKMAN COULTER	A94469	바이러스 정제
페트리 접시 35 mm	Ibidi	81158	배양/관찰
멸균 주사기 필터 5 µ m	Sigma-aldrich	SLSV025LS	여과
SYBR 녹색 유형 I	Invitrogen	알 수 없음	형광 분자 프로브/유세포 분석
SYBR Safe	Invitrogen	S33102	Standard PCR; DNA 겔 염색
Tecnai G20	FEI	Unkown	Electron microscopy
Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor	BECKMAN COULTER	337922	Virus purification
Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm2	BECKMAN COULTER	344058	Virus purification