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방법 논문

HIV 표적의 항체 의존적 세포 식세포 분석에서 사용하기 위해 인간 모유에서 백혈구의 분리

6.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/60149

⸱

2019년 9월 6일

 , 
1Division of Infectious Diseases, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

이 논문에서

요약

모유는 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)를 전송하지만 HIV에 감염된 어머니가 모유로 기르는 유아의 15 %만이 감염됩니다. 모유로 기르는 유아는 ~ 105-10 8 이 세포가 understudyed 하더라도 매일8 개의 모계 백혈구를 섭취합니다. 여기에서 우리는 모유 백혈구의 격리및 그들의 식세포 용량의 분석을 기술합니다.

초록

항 레트로 바이러스 약물이없는 경우에도 HIV에 감염된 어머니가 모유를 수유한 유아의 ~ 15 %만이 감염되어 모유 (BM)의 강력한 보호 효과를 시사합니다. 깨끗한 물과 적절한 유아용 분유에 대한 접근이 신뢰할 수 없다면, WHO는 HIV에 감염된 산모에게 모유 수유를 중단할 것을 권장하지 않습니다. BM 전송을 줄이기 위해 여러 가지 요인이 함께 작동할 가능성이 높습니다. 모유로 기르는 유아는 매일 ~ 105-108 모계 백혈구를 섭취하지만, 크게 불분명남아있는 것은 BM의 항 바이러스 특성에 대한 이러한 세포의 기여입니다. 항체 의존성 세포 식세포증 (ADCP), HIV 표적에 대하여 BM 식세포에 의해 가장 필수적이고 보편적인 선천적인 선천적인 면역 반응의 한개. 세포는 수유의 다양한 단계에서 수득된 5개의 인간 BM 샘플로부터 분리되었다. 격리는 부드러운 원심분리를 통해 수행되었고, 그 다음에 우유 지방을 주의 깊게 제거하고 세포 펠릿을 반복적으로 세척시켰다. HIV 봉투(Env) 에피토프로 코팅된 형광 비드는 ADCP의 분석을 위한 표적으로 사용하였다. 세포는 백혈구를 확인하기 위해 CD45 표면 마커로 염색하였다. ADCP 활성이 HIV 특이적 항체 830A를 사용하여 대조군 실험 및 재현 가능한 측정가능한 위 유의한 것으로 나타났다.

서론

인간 모유 (BM)는 >90% 실행 가능한1모계 세포로 구성됩니다. 세포 조성은 수유의 단계, 어머니와 유아의 건강 상태 및 개인 변화에 의해 강하게영향을 받는데, 이는1,2,3,4. BM이 ~ 103-105 백혈구 / mL을 함유하고 있음을 감안할 때, 모유 수유 된 유아가매일~ 105-108 모계 백혈구를 섭취한다고 추정 할 수 있습니다. 생체 내 다양한 연구는 모계 백혈구가 유아에게 중요한 면역력을 제공하고 초기섭취5, 6,7,8의 이러한 부위를 훨씬 넘어서 는 기능성을 입증했습니다. ,9,10,11. 유아에 의해 섭취된 모든 모계 유래 세포는 유아의 백혈구12와함께 면역 기능을 수행하거나 보상할 가능성이 있다.

인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)의 어머니 -투 - 아이 전송 (MTCT)는 자원 제한 국가에서 위기 남아있다. 설사와 호흡기 질환이 자원 제한 국가에서 유아 중 사망률의 상당한 비율에 대한 책임이 있기 때문에, 이러한 질병은 독점적 인 모유 수유에 의해 크게 감소, HIV에 감염된 어머니에게 혜택 모유 수유는 위험13,14,15보다훨씬 큽니다. 깨끗한 물과 적절한 유아용 분유에 대한 접근이 신뢰할 수 없다면, WHO는 HIV에 감염된산모16에대한 모유 수유를 중단할 것을 권장하지 않습니다. BM을 통해 대략 100,000 선교사 훈련원은 매년 발생합니다; 아직, HIV에 감염된 산모에 의해 모유수유를 한 유아의 ~15%만이 감염되어 BM17,18,19,20,21의강력한 보호 효과를 시사한다. 수많은 요인이 전송을 방지하기 위해 함께 작동 할 가능성이 높습니다. 중요한 것은, BM에 있는 HIV 특정 항체 (Abs)는 HIV 감염22,23에서감소된 MTCT 및/또는 감소된 유아 죽음과 상관되었습니다. 크게 불분명 남아 있는 것은 그것의 항 바이러스 자질에 BM의 세포 분획의 기여.

많은 Abs는 면역 글로불린 분자의 '일정한' 영역에 의해 매개되는 다양한 항 바이러스 활동을 촉진하며, 결정화 가능한 단편(Fc)은 사실상 모든 선천성 면역 세포에서 발견되는 Fc 수용체(FcRs)와의 상호작용을 통해 사실상 모든 항바이러스 작용을 촉진합니다. 인간 BM24에서발견된다. 항체 의존성 세포 식세포증(ADCP)은 바이러스 감염의 허가를 위해 필요에 따라입증되었으며 HIV25,26,27의MTCT 예방의 경우 과소 연구되어왔다. 28세 , 29. HIV의 MTCT 예방에 BM 식세포에 의한 ADCP 활동의 잠재적 기여에 대한 지식의 빈약함을 감안할 때, 우리는 세포에 의해 매개 된 ADCP의 연구를 수행하기 위해 인간 BM에서 세포를 분리하는 엄격한 방법을 개발하는 것을 목표로했습니다. BM은 수유의 다양한 단계에서 얻은.

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프로토콜

이 연구의 각 참가자는 IRB 승인을 사용하여 시나이 산의 인간 피험자 보호 프로그램 (PPHS)의 지침 및 승인과 함께 윤리적 및 제도적 검토 위원회 (IRB) 승인에 따라 모집및 인터뷰되었습니다. 모유 샘플을 얻기위한 프로토콜.

1. 표적 마이크로스피어 준비

  1. 관련 표적 항원을 선택합니다.
    참고: 이 예에서는, 재조합 단백질 V1V2-2F5K가 사용되었고, 이는 네이티브 HIV 봉투30의삼각정 정점을 모방하도록 설계되었다.
  2. 제조업체의 프로토콜에 따라 상용키트(재료 표)를사용하여 생체 이식을 수행합니다.
    1. 제큐를 사용하여 5배 어금니 과잉에 대한 반응에 첨가하는 비오틴 시약의 mmol을 계산한다: mmol 비오틴 = mL 단백질 x (mg 단백질/mL 단백질) x (mmol 비오틴/mg 단백질) x (5 mmol 비오틴/mmol 단백질)30,31. 이어서 제식을 사용하여 첨가할 비오틴 시약의 μL을 계산한다: μL 비오틴 = mmol 비오틴 x (1,000,000 μL/L) x (L/10 mmol).
    2. 개봉 전에 비오틴을 실온에 평형화하십시오. 위의 계산에 따라 인산완충식염수(PBS)의 0.5-2.0 mL에 단백질을 용해시.
    3. 디메틸설폭사이드(DMSO)에서 10 mM의 비오틴 시약용액을 준비하고 단백질 용액에 10 mM의 적절한 부피를 첨가하고, 얼음상에서 2시간 또는 실온에서 30분 동안 배양반응을 한다.
  3. 단백질 농축기 (polyethersulfone [PES] 멤브레인, 3 kDa 분자량 컷 오프 [MWCO], 0.5 mL를 사용하여 과잉 비오틴을 제거; 재료 표) 제조업체의 지침에 따라.
    1. 샘플을 스핀 컬럼의 상부 챔버에 증착하고 최대 400 μL. Cap까지 PBS를 추가한 다음 이 샘플 챔버를 수집 튜브에 삽입합니다. 실온에서 12,000 x g에서 30 분 동안 원심 분리기.
    2. 흐름을 통해 버리고 PBS를 400 μL에 추가합니다. 흐름을 버리고 PBS를 100 μL에 추가합니다. 분광광도계별로 단백질 농도를 측정합니다.
      참고: 단백질은 사용할 때까지 -80°C에서 알리인용및 냉동될 수 있습니다.

2. 항체 의존세포 식세포증 (ADCP) 분석판 제제

  1. 1 μm 마이크로스피어에 생체 구성 단백질을 공액화 ('구슬'; 재료 표) 제조업체의 지침에 따라.
    1. 접합된 비드 의 플레이트 당, 200 μL의 소 혈청 알부민 (BSA)-PBS에서 200 μL의 스톡 비드 12 μl로 단백질 6 μg을 배양하고, 20 분마다 부드럽게 소용돌이치게 한다.
    2. 원심분리기는 5분 동안 13,000 x g에서 경상, 소용돌이를 부드럽게 버리고 0.1% BSA-PBS의 1200 μL에서 다시 중단합니다. 스핀을 반복하고 2 x를 씻으세요. 0.1% BSA-PBS의 1200 μL에서 다시 중단하십시오.
  2. 둥근 바닥 96 웰 플레이트에서 웰 당 비드 용액의 10 μL. 일반적으로 항체의 50 μg/mL 또는 1/100 혈청 희석에서 시작하여 2% HSA HBSS의 12 μL에서 관심 있는 항체 또는 면역 혈청의 희석을 준비합니다.
    참고: 샘플 데이터에서, 단일클론 항체(mAb) 830A를 사용하였다.
  3. 비드 플레이트에 적정 항체/세라 10 μL을 넣고 37°C에서 2시간 동안 배양합니다. 각 우물에 2% HSA HBSS의 200 μL을 추가하고 10 분 동안 2,000 x g에서 원심 분리기 플레이트를 추가하십시오.
  4. 눈에 보이지 않는 비드 펠릿을 방해하지 않도록 플레이트 우물에서 액체를 빠르게 전복하고 싱크대에 디캔팅하여 상판을 조심스럽게 제거하십시오.

3. 모유 세포 격리

  1. 이중 전자 또는 수동 펌프를 사용하여 표현 된 건강한 수유 여성에게서 인간의 모유를 얻으실 수 있습니다. 발현의 ~ 4 시간 내에서 세포를 분리, 실온에서 우유를 유지.
  2. 50 mL 튜브를 사용하여, 원심 분리기 50 mL 우유 800 x g에서 15 분. 조심스럽게 세포 펠릿을 방해하지 않고 두고있는 동안 탈지 우유와 지방을 부어. 튜브 벽에서 모든 지방을 제거하기 위해 보풀이없는 닦아 튜브의 내부를 닦으십시오.
  3. 행크의 균형 잡힌 소금 용액에 2% 인간 혈청 알부민 10 mL을 추가하십시오 (2% HSA HBSS [Ca2+ 또는 Mg++]가 없습니다). 세포 활성화 및 세포 자멸을 피하기 위해 부드러운 파이펫팅으로 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. 15 mL 튜브와 원심분리기로 10 분 동안 450 x g으로 옮긴다.
  4. 상급을 붓고 1.3 단계를 반복하십시오. 이어서, 예상 된 세포 수에 따라 2 % HSA HBSS의 1-2 mL에서 세포를 부드럽게 재중단하고, 혈세포 계측기 또는 자동화 된 세포 카운터에 의해 세포를 카운트하고, 또한 세포 생존가능성을 주목한다.

4. ADCP 분석

참고 : 여기에 설명 된 방법은 아커만 외32에서적응 .

  1. 각 ADCP 분석 판에 50,000개의 갓 단리된 BM 세포를 2% HSA-HBSS의 200 μL에서 잘 추가합니다. 37 °C에서 2 시간 동안 배양하십시오.
    1. 대조군 실험의 경우, 37°C에서 세포를 10 μg/mL 액틴 억제제(cytochalasin-D), 50 μg/mL FcR 차단제(FcBlock) 또는 플레이트에 첨가하기 전에 둘 다의 조합을 배양한다.
  2. 원심분리기 플레이트는 930 x g에서 10분 동안. 2% HSA HBSS의 200 μL을 추가하고 원심분리를 반복합니다. 2.7 단계에서와 같이 상급제를 조심스럽게 제거하고 세탁을 반복하십시오.
  3. 0.5 μg/mL(최종 농도)을 사용하여 생존을 위해 상수 및 얼룩 세포를 조심스럽게 제거하여 2% HSA HBSS의 50 μL에서 잘 당 450의 고칠 수 있는 생존 가능한 얼룩을 제거합니다. 어둠 속에서 실온에서 20 분 배양하십시오. 원심 분리기 플레이트는 930 x g에서 10 분 동안 2.7 단계에서와 같이 상판을 제거합니다. 2% HSA HBSS 및 원심 분리판의 200 μL을 다시 넣고 2.7단계에서와 같이 상판을 제거합니다.
  4. 생존성 염색 후, 관심 있는 백혈구 마커에 대한 얼룩 세포는, 예상 데이터에서 최적화된 농도에서 PE-마우스 항인간 CD45(클론 HI30)와 같은 CD45 특이적 얼룩을 최소한으로 포함한다(50 μL에서 1 μl/μL).
    참고: 관심 있는 모든 계보별 마커를 포함할 수 있습니다.
  5. 어둠 속에서 실온에서 20 분 배양하십시오. 원심 분리기 플레이트는 930 x g에서 10 분 동안 2.7 단계에서와 같이 상판을 제거합니다. 1% BSA HBSS의 200 μL을 추가하고 원심분리를 반복합니다. 상급을 제거합니다. 실온에서 30분 또는 4°C에서 하룻밤 동안 암흑에서 0.5% 포름알데히드의 200 μL에서 세포를 고정시다. 분석이 있을 때까지 어둠 속에서 냉장 보관하십시오.

5. 유세포분석에 의한 분석

  1. 초기 게이팅을 수행하여 전방 산란(FSC) 대 측면 산란(SSC) 플롯 및 파편(FSC = 5000보다 작은 재료)에서 이중을 제거합니다(그림 1참조). SSC 대 생존 력 얼룩(이 경우 V450) 플롯을 사용하여 죽은 세포(생존 성 얼룩에 대해 양수인 셀)를 제거합니다.
  2. SSC 대 CD45 플롯을 사용하여 광범위하게 설명된33,34와같이 주요 백혈구 클래스(과립구, 단핵구, 림프구)를 구별합니다.
    참고: 이 분류는 암시적이며 세포 유형을 확인하기 위해 계보별 마커가 필요합니다.
  3. 모든 CD45+ 세포에 대해, 또는 관심있는 각 백혈구 하위 집합에 대해, 형광 비드가 검출되는 플루오레세인 이소티옥시아네이트(FITC) 채널의 히스토그램에서 비드 양성 세포에 마커를 사용하여 ADCP 활성을 측정합니다.
    참고: 비드가 추가되지 않은 음의 제어 웰은 비드 양성 세포가 히스토그램에서 명백한 위치와 따라서 게이팅 마커를 배치할 위치를 나타냅니다.
  4. ADCP 점수를 (비드 양성 세포의 중간 형광 강도 [MFI])로 계산합니다( 양수 집단에서 총 CD45 + 세포의 %). 그래픽 소프트웨어를 사용하여 각 Ab/혈청 농도에서 점수를 플롯하고 AUC(언더 커브) 분석을 수행합니다.
    참고: AUC가 비특이적 음성 대조군 mAb의 ADCP 점수 AUC의 3배 표준 편차보다 큰 경우 ADCP는 양수로 간주됩니다(이 경우, 3865).

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결과

우유는 실온이나 쿨러에서 보관 할 수 있습니다 (냉동되지는 않지만); 그러나 우유가 매우 차갑게 유지되었을 때 생존 가능성이 감소(데이터가 표시되지 않음)를 관찰하고 주변 온도에서 간단하게 수집, 보관 및 운반이 더 간단하다는 점을 감안할 때, 시료를 줄이기 위해 냉장보관하지 않는 것이 좋습니다. 샘플 간 가변성. 산후 7-183일 동안 얻은 우유에서, 자동화된 세포 카운터에 의해 결정된 세포 농도는 16,083-222,857 세포/mL에서 구역 수색했습니다. 그림 1은 이중, 파편 및 죽은 세포를 제거하는 게이팅 전략을 보여 줍니다. 생존율 ~90-99%였다. 총 라이브 셀의 약 1.6-12.3%는CD45+ 백혈구(표1)였다. 대부분의 의도적인된 단핵구는 암시적인 SSC 대 CD45 게이팅34에기초하여, 앞서 설명한 바와 같...

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토론

본원에 기재된 ADCP 활성을 측정하기 위한 유세포 분석 기반 기술은 2011년30년에 처음 기술되었으며, 이후 80개 이상의 연구에서 견고하게 입증되고 인용되었다. 여기에 설명된 프로토콜은 이 기술을 1차 BM 세포와 처음으로 사용하기 위해 적응합니다. BM 세포에 의한 Fc 매개 기능의 이전 연구는 초유로부터 분리된 세포를 사용하여 산화 파열 또는 장기학 기반 식세포 분석법의 측정에 크게 제한되었습니다(출생 후 0-4일). 사실상 아무 연구도 초유 단계를 지나 인간 BM에 있는 세포를 검토하지 않았습니다. 초유 세포를 이용한 연구는 일반적으로 초유의 과립구가 혈액에서 분리된 것보다 덜 활동적이라는 결론을 내렸으며, 이는 '삼출자 세포'로서 의외의공간(35)으로옮겨진 것으로, 충돌하는 연구가 있지만 보고 유사한 식세포 및 살균 능력36.

수십 년 동안...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

우리는 원고 검토를 위해 마운트 시나이의 아이칸 의과 대학의 의학 및 미생물학과에서 수잔 졸라 - 파즈너 박사에게 감사드립니다. NIH/NICHD는 보조금 번호 R21 HD095772-01A1에 따라 이 프로젝트에 대한 자금을 제공했습니다. 또한, R. 파월은 시나이 산의 이칸 의과 대학, 감염증 학과의 기금으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1 &마이크로; m FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres Thermo FisherF8776
BD Pharmingen PE 마우스 안티-휴먼 CD45BD560975
소 혈청 알부민MP Biomedicals8810025
Corning V-바닥 폴리스티렌 96-웰 플레이트 코닝 3894
Cytochalasin DSigma22144-77-0
EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin 키트 Thermo Fisher21338
Falcon 15 mL 원추형 원심분리기 튜브Corning 
Falcon 50 mL 원뿔형 원심분리기 튜브Corning 352070
정착 가능한 생존력 얼룩 450 BD562247
포름알데히드 용액시그마252549 
칼슘, 마그네슘 또는 페놀이 없는 HBSS RedLife Technologies14175-095
인간 BD Fc 블록BD564219
인간 혈청 알부민MP Biomedicals2191349
Kimtech Science Kimwipes 섬세한 작업 와이퍼Kimberly-Clark Professional 34120
PBS 1x pH 7.4Thermo Fisher10010023
폴리스티렌 10 mL 혈청학적 피펫 코닝 4488
단백질 농축기 PES, 3K MWCO, 0.5mL피어싱88512
352196

참고문헌

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