Method Article

인간 장 유기체에서 지질 방울 형성의 특성화 및 정량화를 위한 형광 기반 분석

DOI:

10.3791/60150

⸱

October 13th, 2019

 ,  , 
1Division of Pediatrics, Department of Pediatric Gastroenterology, Wilhelmina Children's Hospital, University Medical Center Utrecht, Utrecht University, 2Regenerative Medicine Center, University Medical Center Utrecht, Utrecht University, 3Science for Life Laboratory, Department of Medical Biochemistry and Microbiology, Uppsala University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 지방산으로 자극시 인간의 장 유기 체에서 지질 방울 (LD) 형성의 특성에 대한 분석서를 설명합니다. 우리는 이 분석제가 LD 형성의 정량화를 위해 어떻게 이용되는지, 그리고 어떻게 LD 대형에 영향을 미치는 약에 대한 높은 처리량 검열을 위해 사용될 수 있는지 토론합니다.

Abstract

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식이 지질은 장 상피에 의해 자유 지방산 (FA)으로 채택됩니다. 이 FA는 세포내 트리글리세라이드(TG) 분자로 전환되며, 림프로 운반하기 위해 chylomicrons로 포장되기 전에 또는 세포내 저장을 위해 세포내 지질 방울(LDs)으로 운반됩니다. LDs의 형성을 위한 결정적인 단계는 TG 합성의 마지막 단계에서 디아실리세롤 아실트랜스퍼라제(DGAT)의 촉매 활성이다. LDs는 독성 지질 종을 버퍼링 하 고 다른 세포 유형에 세포 대사를 조절 하는 것이 중요 하다. 인간의 장 상피는 정기적으로 지질의 높은 농도 직면 하기 때문에, LD 형성항상성을 조절 하는 것이 매우 중요 하다. 여기에서 우리는 인간 장 오르가노이드에서 가장 일반적인 불포화 지방산, 올레산으로 자극시 LD 형성 (LDF)의 특성화 및 정량화에 대한 간단한 분석서를 설명합니다. LDF 분석법은 공초점 현미경, 형광 판 판독기 또는 유세포 측정에 의한 LD의 정량화를 허용하는 LD 특이적 형광 염료 LD540을 기반으로 합니다. LDF 분석실험은 인간 장 상피 세포에서 LD 형성을 특성화하거나 DGAT1 결핍과 같은 LD 대사에 영향을 미치는 인간(유전적) 장애를 연구하는 데 사용될 수 있다. 또한, 이 분석실험은 또한 장 내 또는 다른 유형의 오르가노이드에서 LD 형성의 결함을 복원하는 새로운 치료 화합물을 테스트하기 위해 높은 처리량 파이프 라인에서 사용될 수 있습니다.

Introduction

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지질은 인간의 식단의 중요한 구성 요소이며 전신 에너지 저장 및 신진 대사에 중요한 역할을합니다. 섭취 할 때, 식이 지질은 췌장 리파스에 의해 자유 지방산 (FFAs) 및 모노 글리세라이드 (MGs)로 저하됩니다. 이 기질은 그 때 장 상피의 장세포에 의해 채택되고, 여기서 그(것)들은 단글리세라이드 acyltransferases (MGAT) 효소에 의해 diglycerides (DG)에 처음으로 재에스테르화되고 그 후에 diacyglycerol에 의해 트리글리세라이드 (TG)에 아실트랜스퍼라제 1 (DGAT1)1. 마지막으로, 이들 TGs는 세포내 저장을 위한 림프계 또는 세포질 지질 방울(LDs)으로 수출하기 위한 chylomicrons중하나에 통합되어2,3. 다른 장기에 식이 지질을 배포 하는 chylomicrons 필요 하지만, LDs에 세포 내 지방 저장의 중요성은 완전히 명확 하지 않습니다. 그러나, LDs는 식사 후 16 시간까지 순환으로 지질을 천천히 방출하기 때문에 장에서 조절 기능을 수행하는 것으로 나타났습니다4. 더욱이, LDs는지방분해조건....

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Protocol

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본 명세서에 기재된 인간 조직을 이용한 모든 실험은 대학 의료 센터 위트레흐트(UMCU)의 윤리위원회에 의해 승인되었다. 조직 수집, 생성, 저장 및 유기노이드 사용에 대한 사전 동의는 빌헬미나 어린이 병원 (WKZ)-UMCU의 환자로부터 얻어졌습니다.

1. 문화매체 준비

참고: 이 프로토콜은 생체 안전 캐비닛 내부에서 수행해야합니다. 오르가노이드는 표준 세포 배양 지침에 따라 취급되어야 합니다.

  1. 기초 배양 배지를 준비합니다.
    참고:     성장 인자 없는 배양 배지는 기저 배지(BM)라고 합니다.
    1. 5 mL의 HEPES (1 M), 5 mL의 L-글루타민 (100x) 및 5 mL의 페니실린-스트렙토마이신 (5,000 U/mL)을 500 mL의 고급 덜베코의 변형 된 독수리 배지와 햄의 영양 혼합물 F-12를 첨가하여 BM 배지를 준비합니다.
    2. 준비된 BM 배지를 4°C에서 저장하고 최대 2개월 동안 사용하십시오.
  2. 제조업체의 프로토콜에 따라 R-spondin 및 Noggin 컨디셔닝 매체(CM)를 준비합니다.
      ....

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Results

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LD 형성의 적절 한 분석을 위해, 오르가노이드는 OA와 후속 염색으로 자극 하기 전에 너무 조밀 하 게 파종 해서는 안. 이것은 중첩된 오르가노이드가 형광을 방해할 수 있기 때문에 공초점 및 플레이트 판독기 판독에 특히 중요합니다. 적절한 오르가노이드 시드 밀도의예(도 1A)및 중첩된 오르가노이드를 가진 배양체(도1B)가도시된다. OA를 사용하여 샘플 자극의 가변성을 최소화하려면 하나의 실험 내에서 샘플 간에 유기체 크기 및 시드 밀도를 비교해야 합니다. 이것은 단일 세포의 동일한 수를 시드하여 가장 잘 제어됩니다. 그러나, 특정 organoid 라인이 일관되게 더 높은 재구성 효율성을 보여주고 그러므로 일관되게 더 높은 organoid 수를 보여주는 경우에 몇몇 조정이 필요할 지도 모릅니다.

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Discussion

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여기에서, 우리는 올레산으로 배양시 인간 장 오르가노이드에서 LD 형성을 결정하는 프로토콜을 제공한다. 이 방법은 LD 특이적 형광 염료 LD54018을기반으로 하며, 이는 오르가노이드 배양 내의 지질 방울의 총 부피의 특성화 및 정량화를 가능하게 한다. 인간의 장 내 오르가노이드 문화를 확립하고 유지하는 절차는13이전에 발표되었으며,이 프로토콜의 시각적 가이드도15.

이 프로토콜의 중요한 단계는 인간의 장 오르가노이드의 문화, 그리고 BSA에 OA의 적절한 융합이다. 오르가노이드의 배양은 줄기 세포 집단의 유지가 기능성 Wnt3A-CM에 크게 의존하기 때문에 배양 배지의 정확한 제형을 필요로 한다. Wnt3A-CM이 사내에서 제작되는 경우, 약 2개월의 만료 시간으로 인해 고도로 표준화된 워크플로우와 컨디셔닝 매체의 월별 생산을 권장합니다. 또한, 연.......

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Disclosures

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저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LD540을 아낌없이 제공해 주신 B. Spee에게 감사드립니다. 이 작품은 과학 연구 보조금에 대한 네덜란드 조직에 의해 지원되었다 (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) - S.M.

....

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Materials

2+2+

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
고급 DMEM/F12Gibco12634-028
B27 보충 Gibco17504-044
기저막 매트릭스 (matrigel)BD Biosciences356231
DAPISigma-AldrichD9542-1MG
DGAT1 억제제 (AZD 3988)Tocris Bioscience4837/10
지방산 무료 BSASigma-AldrichA7030
포름알데히드Klinipath4078-9001
글루타민 (GlutaMAX, 100x)Gibco15630-056
HEPES (1 M)Gibco15630-080
레이저 스캐닝 컨포칼 현미경LeicaSP8X
LD540위트레흐트 대학교 B. Spee 박사가 친절하게 제공
mEGFPeprotech315-09_500ug
N-아세틸 시스테인시그마 -알드리치A9165-100G
니코틴 아미드시그마 알드리치N0636-500G
노긴 생산 세포 (HEK293-mNoggin-Fc 세포)J. den Hertog, Hubrecht Institute
올레산시그마 -알드리치O1008-5G
p38 MAPK 억제제 (p38i) (SB202190)시그마 알드리치S7067-25MG
PBSCa
D8537-500ML
페니실린-스트렙토마이신(5,000 U/mL)Gibco15070-063
R-스폰딘 생산 세포(Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T 세포)R& D 시스템3710-001-01
TC 처리된 24 웰 플레이트Greiner-One662160
TC 처리된 검은색 투명 바닥 96 웰 플레이트Corning Life Sciences353219
TGFb 타입 I 수용체 억제제 (A83-01) Tocris Bioscience2939/10
Trypsin (TrypLE Express)Life Technologies12604021
Wnt-3A producing cells (L-Wnt-3A cells)MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute
Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor)Abcamab120129-10
/Mg 없이 Sigma-Aldrich

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism. Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).
  2. Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V.

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Lipid Droplet FormationHuman Intestinal OrganoidsOleic Acid StimulationConfocal MicroscopyFlow CytometryFluorescent Plate ReaderLD540 DyeDGAT1 InhibitorOrganoid CultureLipid Droplet Quantification

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