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방법 논문

화학 측정 접근을 통해 지층 각막의 생체 내 공초점 라만 스펙트럼에서 물, 단백질 및 지질을 해결

6.9K 조회수

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DOI:

10.3791/60186

⸱

2019년 9월 26일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Procter and Gamble, Beijing Innovative center, 2Procter and Gamble, Mason Business Center, 3Department of Dermatology, Beijing Children's Hospital, 4Chinese Academy of Inspection and Quarantine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기에서, 우리는 스펙트럼 이상치 제거및 주요 특징의 연속적인 추출을 위한 화학측정 접근과 결합된 임상 연구에서 인간 적인 과목에서 공초점 라만 스펙트럼의 수집을 위한 프로토콜을 제시합니다.

초록

생체 내 공초점 라만 분광법의 개발은 인간 피험자의 깊이 분해능으로 물, 단백질 및 지질을 직접 측정할 수 있게 합니다. 이 정보는 피부 관련 질병 및 스킨 케어 제품 성능 특성화에 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 화학측정을 활용하는 스펙트럼 데이터 세트의 공초점 라만 스펙트럼 수집 및 후속 분석을 위한 방법을 보여 준다. 이 방법의 목표는 데이터 수집을 위한 표준 프로토콜을 설정하고 데이터 분석을 위한 일반적인 지침을 제공하는 것입니다. 전처리(예: 이상값 스펙트럼 제거)는 임상 연구에서 대용량 데이터 세트를 처리할 때 중요한 단계입니다. 예를 들어 데이터 집합에 대한 사전 지식을 바탕으로 이상값 유형을 식별하고 이를 제거하기 위한 특정 전략을 개발하는 지침을 제공합니다. 주 성분 해석이 수행되고 하중 스펙트럼은 참조 재료의 스펙트럼과 비교하여 최종 다변량 곡선 분해능(MCR) 해석에 사용되는 구성요소 수를 선택합니다. 이 방법은 큰 스펙트럼 데이터 집합에서 의미 있는 정보를 추출하는 데 성공적입니다.

서론

임상 연구에서 생체 내 공초점 라만 분광법은 각질층 의 두께와 수분함량을1,2,3,4,및 의 침투를 추적하는 독특한 능력을 보여주었습니다. 활성 물질은 피부에 국소적으로 적용5,6. 비침습적 접근법으로, 공초점 라만 분광법은 진동 모드에 기초하여 분자 신호를 검출합니다. 따라서,라벨링7이필요하지 않습니다. 생체 내 공초점 라만 분광법은 기술의 공초점 특성에 따라 깊이 분해능으로 화학 적 정보를 제공합니다. 이 깊이 의존정보는 피부보호제품4,8,노화9,10,계절변화3, 피부장벽기능질환, 아토피 성 피부염11,12등 . 공초점 라만 분광법 (2,500-4,000cm-1)의고주파 영역에 는 물이 3,250-3,550 cm-1사이의 지역에서 뚜렷한 피크를 생성하는 많은 정보가 있습니다. 그러나, 약 2,800-3,000 cm-1사이에서 중앙에 있는 단백질과 지질의 라만 피크는, 신호가 주로 메틸렌 (-CH2-) 및 메틸 (-CH3) 군13에서 생성되기 때문에 서로 겹칩니다. . 이 중첩된 정보는 개별 분자 종의 상대적인 양을 얻을 때 기술적 인 도전을 제시합니다. 피크 피팅14,15 및 선택적 피크 위치12,16 접근법이 이 문제를 해결하기 위해 사용되었습니다. 그러나, 이러한 단일 피크 기반 방법은 동일한 성분으로부터 다중 라만 피크가 동시에17변화되기때문에 순수한 성분 정보를 추출하기가 어렵다. 최근 간행물18에서,MCR 접근법은 순수한 성분 정보를 해명하기 위하여 제안되었습니다. 이 접근법을 사용하여, 3가지 성분(물, 단백질 및 지질)을 생체 내 의 큰 공초점 라만 분광 데이터 세트로부터 추출하였다.

대규모 임상 연구의 실행은 생체 내 분광 데이터를 수집하는 개인에게 요구 될 수 있습니다. 경우에 따라 스펙트럼 수집은 하루에 여러 시간 동안 운영 장비를 필요로 할 수 있으며 연구는 몇 주 또는 몇 달까지 연장 될 수 있습니다. 이러한 조건하에서 분광 데이터는 분광 아티팩트의 모든 소스를 식별, 제외 및 수정할 수 있는 기술 적 전문 지식이 부족한 장비 운영자에 의해 생성될 수 있습니다. 결과 데이터 세트에는 분석 전에 데이터에서 식별하고 제외해야 하는 분광 이상값의 작은 부분이 포함될 수 있습니다. 이 백서는 MCR로 데이터를 분석하기 전에 임상 라만 데이터 세트를 "정리"하는 화학 분석 프로세스를 자세히 설명합니다. 이상값을 성공적으로 제거하려면 이상값의 유형과 이상값 분광기 생성의 잠재적 원인을 식별해야 합니다. 그런 다음 대상 이상값을 제거하기 위해 특정 접근 방식을 개발할 수 있습니다. 이를 위해서는 데이터 생성 프로세스 및 스터디 설계에 대한 자세한 이해를 포함하여 데이터 집합에 대한 사전 지식이 필요합니다. 이 데이터 집합에서 이상값의 대부분은 신호 대 잡음 스펙트럼이 낮으며 주로 1에서 유래하며 피부 표면 위에 수집된 스펙트럼(30,862개 중 6,208개) 및 2) 형광실 광(30,862개 중 67개)의 스펙트럼에 대한 강력한 기여도를 나타냅니다. 피부 표면 위에 수집 된 스펙트럼은 레이저 초점이 피부 표면에 접근하고 주로 피부 아래의 기기 창에 있기 때문에 약한 라만 반응을 생성합니다. 형광실내 광의 강한 기여도를 가진 스펙트럼은 계기판 작업자 오류 또는 피사체 이동으로 인해 생성되며, 이는 공초점 라만 수집 창이 피사체의 신체 부위에 완전히 가려지지 않는 조건을 생성합니다. 이러한 유형의 스펙트럼 아티팩트는 데이터 수집 당시 분광 전문가가 스펙트럼 수집 중에 식별하고 수정할 수 있지만, 이 연구에 사용된 훈련된 계측기 운영자는 치명적인 실패가 관찰되었습니다. 이상값을 식별하고 제외하는 작업은 데이터 분석 프로토콜에 통합됩니다. 제시된 프로토콜은 이 문제를 해결하기 위해 개발되었습니다. 피부 표면 위의 낮은 신호 대 잡음 스펙트럼을 해결하려면 피부 표면 위에 수집된 스펙트럼을 제거할 수 있도록 먼저 피부 표면의 위치를 결정해야 합니다. 피부 표면의 위치는 보충 도면 1에도시된 바와 같이 라만 레이저 초점이 피부의 절반과 피부의 절반인 깊이로 정의됩니다. 낮은 신호 대 잡음 스펙트럼을 제거한 후, 주요 성분 분석(PCA)이 구현되어 형광실 광피크가 지배하는 계수를 추출합니다. 이러한 이상값은 해당 요인의 점수 값에 따라 제거됩니다.

이 프로토콜은 MCR 프로세스에서 6개의 주요 구성 요소가 어떻게 결정되는지에 대한 자세한 정보를 제공합니다. 이 작업은 PCA 분석을 통해 수행된 다음 다른 수의 주 구성 요소로 생성된 모델에 대한 하중 간의 스펙트럼 모양 비교를 수행합니다. 인간 피험자뿐만 아니라 참고 자료의 데이터 수집을 위한 실험 과정도 자세히 설명되어 있습니다.

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프로토콜

이 연구는 1975년 헬싱키 선언의 윤리적 지침에 따라 베이징 아동 병원의 기관 검토 위원회의 승인을 받았습니다. 좋은 임상 실습을 위한 무형유산 가이드라인에 따라 실시되었다. 이 연구는 2015년 5월부터 7월까지 진행되었습니다.

1. 아토피 성 피부염을 가진 인간 적인 피험자에게서 생체 내 공초점 라만 스펙트럼의 수집

  1. 다음 기준을 준수하는 과목을 포함합니다.
    1. 4-18세 사이의 과목을 포함시다.
    2. 신체 표면의 5%-30%에 활성 질환 증상이 있는 경미한 아토피성 피부염(의사의 글로벌 평가에 따라 2 또는 3점)을 가진 피험자, 팔에 적어도 2개의 병변을 가진 피험자 포함.
    3. AD 질환과 직접 관련된 증상을 제외하고 건강에 좋은 대상을 포함합니다.
    4. 서면 동의를 제공하는 주제를 포함합니다.
    5. 개별 토폴로지 각도(ITA) 값이 테스트 위치에 40보다 높은 과목을 포함합니다.
  2. 다음 기준중 어느 한 가지를 충족하는 과목을 제외합니다.
    1. 현재 참여 중이거나 이전에 임상 연구에 참여한 과목을 이전 4주 이내에 모든 시험 시설에서 제외합니다.
    2. 암이 있거나 연구 전 5년 이내에 암에 대한 진단 또는 치료를 받은 대상을 제외하십시오.
    3. 당뇨병 과목을 제외.
    4. 피험자를 위험에 빠뜨리거나 연구 결과의 정확성을 방해할 수 있는 면역학적 또는 전염병이 있는 피험자를 제외합니다(즉, 간염, 결핵, HIV, AIDS, 루푸스 또는 류마티스 관절염).
    5. 기기 측정을 방해하거나 아토피 성 피부염에 만 피부의 명확한 평가를 방지 할 수있는 피부 상태가있는 과목을 제외. 예로는 매우 건조한 피부, 손상된 피부, 상처, 긁힘, 일광화상, 모반, 문신, 광범위한 흉터, 발진, 과도한 모발 성장 또는 여드름이 있습니다.
    6. 경구 면역 억제제를 사용하는 과목을 제외, 항생제, 또는 지난 달 동안 다른 전신 요법, 사소한 진정제를 제외하고.
    7. 조사자의 의견으로 는 연구 참여에서 그들을 배제 하는 다른 의료 조건과 과목을 제외.
    8. 시험 영역에서 색소 침착이 높은 피험자는 제외합니다.
  3. 그림 1A에나타난 바와 같이 아토피성 피부염 연구 참가자의 병변 부위를 라벨및 병변 부위 또는 그 근처에 있는 3 cm x 4cm 영역으로 표시한다.
  4. 그림 1B에나타난 바와 같이 비병변 부위에 동일한 마커(예를 들어, 왼쪽 팔뚝 대 오른쪽 팔뚝)를 표시합니다.
  5. 도 2A 및 도 2B에도시된 바와 같이 표시된 바디 부위를 생체 내 공초점 라만 계측기의 창과 밀접한 접촉에 놓는다. 실내 조명이 바디 부위에 미치는 영향을 피하기 위해 전체 창을 덮습니다.
  6. 라만 데이터 수집을 수행합니다.
    참고 : 기기는 17mW의 전력으로 671 nm 레이저를 사용하여 2cm-1 및 50x 현미경 검사법 목표 (NA = 0.9 오일 침지)의 스펙트럼 해상도를 가지고 있습니다. 파장은 내장 된 네온 아르곤 램프의 스펙트럼을 사용하여 보정됩니다. 강도 교정은 NIST(국립 표준 연구소) 유리 교정 표준의 스펙트럼을 측정하여 수행됩니다.
    1. 그림 2C에 나와 있는 스펙트럼이 관찰될 때까지 초점을 이동한 다음 초점을 피부 표면에서 10 μm 떨어진 곳에 이동합니다.
    2. 2,510cm-1-4,000cm-1 주파수 영역에서 2 μm 단계 크기로 26단계에 대한 데이터 수집을 시작합니다. 1 초의 노출 시간을 사용하고 ~ 10-15 분 총 지속 각 영역에 대한 8 개의 복제를 측정합니다.

2. 참조 자료에서 공초점 라만 스펙트럼의 컬렉션

  1. 참고 자료, 인간의 피부 지층각질 19의주요 구성 요소를 배치, 공초점 라만 악기의 창에 (재료표참조 : 소 혈청 알부민 (BSA), 탈이온수 (DI 물), 세라마이드, 콜레스테롤, 무료 지방산, 스쿠알렌).
  2. 상기와 동일한 수집 파라미터를 사용하여 재료의 외부에서 재료 중심으로 연속적으로 참조 재료의 라만 스펙트럼을 수집한다.
  3. 각 라만 스펙트럼 아래 영역을 2,510-4,000cm-1 범위 사이에 통합하고 이 26개의 측정에서 상위 3개의 최대 값 포인트를 식별합니다. 최종 기준 재료 스펙트럼을 얻기 위해 이러한 세 지점에서 라만 스펙트럼을 평균화합니다.

3. 화학 측정 분석을 통해 이상값 스펙트럼 제거

  1. 피부 표면을 확인하고 피부 외 스펙트럼을 제거합니다.
    1. 파일 확장프로그램을 '.ric'에서 '.mat'으로 변경하고 .mat 파일을 MATLAB 소프트웨어 플랫폼에 로드합니다.
    2. 분석 에서 가져온 데이터 집합을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 기준선(자동 가중 최소 사각형)을 사용하여 기준선을 수정합니다 | 기타 도구 | PLS_Toolbox 소프트웨어에서 기본 설정으로 전처리합니다.
    3. 2,910-2,965 cm-1 사이의 값을 합산하여 MATLAB의 합계 함수를 통해 그림 3A에 표시된 26단계 측정에서 각 라만 스펙트럼 아래의 강도 값을 가져옵니다.
    4. MATLAB의 린스페이스 함수를 사용하여 26-260에서 계측기 오프셋 값(그림 3B의X축 값)을 보간합니다.
    5. MATLAB의 스플린 방법을 사용하여 강도 값을 26에서 260까지 보간하고 새로 생성된 260 위치 값을 활용합니다.
    6. MATLAB의 폴리핏 및 폴리벌 함수를 사용하여 260포인트의 새로운 강도 값 세트를 가져옵니다. 먼저 260 위치 및 강도 값을 폴리핏 함수에 대해 X 및 Y 입력으로 사용합니다. 도 값을 20으로 설정합니다. 그런 다음 출력 계수와 260 확장 위치 값을 폴리val의 입력으로 사용하여 최종 260 강도 값을 얻습니다.
    7. MATLAB의 최대 및 최소 함수를 사용하여 새로 보간된 260강도 값의 최대 및 최소 점을 식별합니다.
    8. 최대 강도 값과 최소 강도 값의 합계를 2로 나누어 평균 강도 값을 계산합니다.
    9. 평균 강도 값에 가장 가까운 260 강도 값(3.1.6 단계에서 계산)에서 강도 값을 식별하고 해당 위치 값을 피부 표면으로 설정합니다. 그림 3B에표시된 대로 이 위치 값을 X축의 영점으로 설정합니다.
    10. 영점 및 공지된 2 μm 스텝 크기에 따라 다른 모든 위치 값을 변경합니다.
    11. 위치 값에 따라 피부 표면 위에 수집된 모든 스펙트럼을 제거합니다.
    12. 나머지 데이터를 PLS_Toolbox로 가져와 데이터 집합을 만들고 "RamanData.mat"의 이름을 바꿉니다.
  2. 룸 라이트 효과로 이상값 스펙트럼을 제거합니다.
    1. 라만 스펙트럼 데이터 세트(RamanData.mat)를 제거한 후 피부 외 스펙트럼을 제거하고 PCA 분석을 구현합니다.
    2. MATLAB 플랫폼 아래PLS_Toolbox 소프트웨어에 데이터 집합을 로드하고 데이터 집합을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 분석 | PCA.
    3. 전처리 접근 법으로 정규화를 선택하고 교차 유효성 검사에 대해 없음을 선택합니다.
    4. 보조 그림 2에표시된 대로 PCA 분해 해석에 대한 세 가지 구성 요소를 사용합니다.
    5. 생체 내 라만 계측기의 수집 창상에서 커버를 제거하고 참조 재료 데이터 수집에 사용되는 동일한 파라미터를 사용하여 고주파 영역에서 실내 광 스펙트럼을 수집합니다.
    6. 추가 도 3에나타난 바와 같이 룸 라이트 배경 스펙트럼과의 비교를 통해 실내 조명 효과 요인을 식별합니다.
    7. 정상보다 훨씬 높은 해당 점수 값을 가진 스펙트럼을 제거합니다(이 연구에서 0.16인 전체 데이터 집합의 점수 값의 99.8% 이상).

4. MCR 분해 분석의 구성 요소 수 선택

  1. 위에서 설명한 것과 동일한 접근 방식(섹션 3.1.2)을 사용하여 라만 스펙트럼 기준선을 수정합니다.
  2. 위에서 설명한 대로 전처리된 데이터 집합에 대한 PCA 분석을 수행하고(섹션 3.2) "PQN"- "평균 중심"을 선택하지 않고 "정규화"가 아닌 "평균 중심"을 선택하고 구성 요소 수(20)와 함께 로그값(20)을 기본 값으로 플롯합니다. 구성 요소 선택 단추를 클릭하여 분해 분석을 선택하고 Y 값으로 로그(고유 값)를 선택합니다. MCR 해석에 사용되는 구성 요소의 수로 3~8개 선택합니다.
  3. MCR 분석을 수행합니다.
    1. 데이터 선택 버튼을 통해 데이터 집합을 MCR_main소프트웨어(20)에 로드합니다.
    2. 구성 요소 수 단추의 측정을 클릭하여 구성 요소 수(3~8개)를 선택합니다.
    3. 초기 추정 탭 아래에 있는 순수 버튼을 클릭하고 변수 선택 탭의 방향 에서 농도를 선택한 다음 수행 단추를 클릭합니다.
    4. 확인 단추를 클릭한 다음 계속 단추를 다음 페이지로 이동합니다.
    5. 다음 페이지에서 계속을 클릭한 다음 부정성 프로필 탭이 있는 종의 구현 및 Nr. 아래에서 fnnl및 6을 각각 선택합니다. 계속 단추를 클릭합니다.
    6. 이 페이지의 섹션 4.3.5와 동일한 매개변수를 선택하고 계속을클릭합니다.

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결과

본 임상 연구에서, 생체 내 공초점 라만 스펙트럼은 4-18세부터 28명의 피험자로부터 수집되었다. 위에서 언급한 데이터 수집 프로토콜로 총 30,862개의 라만 스펙트럼이 수집되었습니다. 이 큰 스펙트럼 데이터 집합에는 그림 4A와같이 20% 스펙트럼 이상값이 포함되어 있습니다. 낮은 신호 대 잡음 이상치 스펙트럼은 피부 표면을 결정한 후 제거된 다음 PCA를 통해 실내 조명 기능을 사용하여 스펙트럼을 식별했습니다. 이 PCA 모델의 세 번째 요소는 룸 라이트 피크를 식별합니다. 이는 동일한 공초점 라만 계측기를 사용하여 연구 현장에서 별도로 수집된 형광실내 광스펙트럼과 인자 3의 하중 스펙트럼을 비교하여 확인된다(보충도 3참조). 그림 4 B는 이 프로세스 후에 대부분의 이상값 스펙트럼이 제거됨을 나...

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토론

프로토콜의 섹션 2 및 3에 설명된 바와 같이 데이터 수집 동안, 각 깊이 프로파일은 적색 원에서 강조 표시된 미세한 이미지에서 어두운 영역을 찾아계측기 창과 피부 사이의 접촉이 있는 영역에서 수집되었습니다. 그림 2C. 이러한 영역이 위치되면, 데이터 분석 절차에 대한 피부 표면의 위치를 정확하게 결정하기 위해 피부 표면 위의 깊이 프로파일을 시작하는 것이 중요했습니다. 피부 표면의 위치는 이어서 해당 깊이 프로파일에서 각 스펙트럼의 상대 깊이를 결정하는 데 사용되었다. 프로토콜의 섹션 1에서 언급한 바와 같이, 피부 표면 위의 깊이 프로파일 10 μm를 시작하면 피부 외부에 5개의 데이터 포인트가 생성됩니다. 이를 통해 피부 표면의 양쪽에서 최대 및 최소 신호 강도의 위치를 성공적으로 결정할 수 있습니다. 또한 이러한 영역은 높은 형광 배경 신호를 생성하기 때문에 펜 자국과 주근깨와 같은 더 높은 색소 부위를 포함하는 위치를 측정하는 것을 피...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

저자는 기업 기능 분석 및 개인 클렌징 케어 부서의 재정 지원을 크게 인정합니다. 우리는 분석 부이사 인 재스민 왕 (Jasmine Wang)과 롭 가드너 (Robb Gardner) 박사의 지도와 지원에 대해 감사드리며 데이터 수집에 대한 그녀의 도움을 준 리 양 (Li Yang)에게 감사를 표하고 싶습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
소 혈청 알부민시그마-알드리치
콜레스테롤시그마-알드리치
콜레스테롤 3-황산나트륨시그마-알드리치
D-에리스로-디하이드로스핑고신시그마-알드리치
DI 물Milipore(18.2MΩ)로 정제
Gen2-SCA 피부 분석기River Diagnostics, 로테르담, 네덜란드Gen2
Matlab 2018bMathwork2018b
N-behenoyl-D-erythro-sphingosineAvanti Polar Lipids, Inc.
N-리그노세로일-D-에리스로-스핑가닌(세라마이드)Avanti Polar Lipids, Inc.
올레산,시그마-알드리치
, 팔미트산,시그마-알드리치
팔미톨레산, 시그마-알드리치
, PLS_Toolbox 버전 8.2Eigenvector Research, Inc.8.2
RiverIConRiver Diagnostics, 네덜란드 로테르담버전 3.2
스쿠알렌시그마-알드리치
스테아르산시그마-알드리치
, ,

참고문헌

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  21. Choe, C., Choe, S., Schleusener, J., Lademann, J., Darvin, M. E. Modified normalization method in in vivo stratum corneum analysis using confocal Raman microscopy to compensate nonhomogeneous distribution of keratin. Journal of Raman Spectroscopy. , (2019).
  22. Wise, B. M., et al. Chemometrics tutorial for PLS_Toolbox and Solo. Eigenvector Research, Inc. 3905, 102-159 (2006).

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