파지 디스플레이 펩타이드 라이브러리를 사용하여 섬유아세포 성장 인자 수용체2를 표적으로 하는 소형 펩타이드의 스크리닝 및 식별

요약

본 명세서에서, 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리를 사용하여 FGFR2에 결합하는 작은 펩티드를 스크리닝하기 위한 상세한 프로토콜을 제시한다. 우리는 시험관내에서 FGFR2를 향한 선택된 펩티드의 친화도 및 세포 증식을 억제하는 능력을 추가로 분석한다.

초록

인간 섬유아세포 성장 인자 수용체(FGFR) 패밀리는 세포 증식, 생존, 이동 및 분화를 포함한 다양한 생물학적 활동에 관여하는 4개의 멤버, 즉 FGFR1, FGFR2, FGFR3 및 FGFR4를 포함한다. 돌연변이 또는 유전자 증폭 사건으로 인해 FGFR 신호 통로에 있는 몇몇 수차는, 암의 각종 모형에서 확인되었습니다. 따라서, 최근 연구는 FGFRs의 치료 표적화와 관련된 전략 개발에 초점을 맞추고있다. 단클론 항체, 파이프 라인에 몇 펩티드 기반 억제제. 여기서, 우리는 FGFR2의 길항제로 작은 펩티드를 스크리밍하는 파지 디스플레이 기술을 이용한 프로토콜을 제공한다. 간략하게, 파지-디스플레이 펩티드라이브러리를 FGFR2로 코팅된 플레이트에 배양하였다. 이어서, 언바운드 파지를 TBST(TBS + 0.1% [v/v] 트웬-20)에 의해 세척하고, 결합된 파지를 0.2 M 글리신-HCl 완충액(pH 2.2)으로 용출하였다. 용출된 파지는 더욱 증폭되었고 다음 바이오패닝 라운드에 대한 입력으로서 사용되었다. 바이오패닝의 3라운드에 이어, 개별 파지 클론의 펩티드 서열은 DNA 염기서열 분석으로 확인되었다. 마지막으로, 스크리마한 펩티드를 합성하고 친화성 및 생물학적 활성을 분석하였다.

서론

섬유아세포 성장 인자 수용체(FGFRs)는 생체 내 세포 증식, 상처 치유 및 혈관신생에 중요한 역할을^한다. 다양한 종양에서 관찰되는 FGFR 신호의 비정상적인 활성화^2,3,4,5는 유전자 증폭, 유전자 돌연변이, 염색체 수차 및 과도한 리간드 분비를 포함한다⁶ . FGFRs를 표적으로 하는 많은 억제제는 임상 시험에서 유망한 치료 효과를 보여주었으며 주로 세 가지 유형으로 분류됩니다: (1) FGFR의 세포내 도메인에 결합하는 소분자 키나아제 억제제, (2) 길항제를 표적으로 하는 길항제 세포 외 세그먼트, 및 (3) FGF 리간드 트랩^6. 몇몇 소분자 키나아제 억제제는 시험관내 및 생체내 모두 좋은 치료 효과를 가지고 있지만^7,그들 대부분은 표적 특이성이 좋지 않으며 고혈압^8과같은 부작용을 나타낸다. 길항제의 대다수는 단일클론 항체

프로토콜

1. 시약 준비

1. LB (리소제니 국물) 매체: 트립톤 1g, 효모 추출물 0.5 g, NaCl 0.5 g을 H₂O. 오토클레이브 100 mL에 녹여 4°C에서 보관합니다.
2. 테트라 사이클린 재고: 1:1 에탄올:H₂O. -20°C에 보관하고 사용하기 전에 소용돌이에 20 mg/mL을 준비하십시오.
3. IPTG/X-gal 용액: 0.5 g의 IPTG(이소프로필 β-D-1-티오갈라코피라노사이드)와 X-gal 0.4 g(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴라일 β-D-갈락토사이드)을 DMF 10 mL(디메틸 포마미드)에 섞는다. 용액은 어둠 속에서 1년 동안 -20°C에서 보관할 수 있다.
4. LB + 테트라 사이클린 (Tet) 플레이트 : 바토 트립톤 1 g, 효모 추출물 0.5 g, NaCl 0.5 g, 한천 100 mL에서 H₂O. 오토 클레이브를 100 mL로 디스브하고 70 °C로 식힙니다. 테트라사이클린 스톡 100 μL을 넣고 접시를 붓습니다. 접시를 어둠 속에서 4 °C에서 보관하십시오.
5. LB + IPTG /X-gal 플레이트: 바토 트립톤 1 g, 효모 추출물 0.5 g, NaCl 0.5 g, 한천 100 mL에 H₂O. 오토클레....

결과

FGFR2표적화하는 고친화성 소형 펩티드를 획득한다.

FGFR2를 대상으로 하는 파지를 스크리플하기 위해 이 연구에서 박사-7 라이브러리를 사용했습니다. 워크플로의 개략적 표현은 그림 1에나와 있습니다. 이 과정에서, 파지 입력(PFU)의 수는 변하지 않은 반면, FGFR2 단백질의 코팅 농도는 점차 감소하였다. 파지 역가의 결과는 회수된 파지의 수가 점차 증가하고, 3라운드 후, 1라운드와 비교하여 65배 증가하였다(표1).

다음으로, 3라운드 후 파지 클론을 무작위로 골라 시퀀싱을 위해 파지 DNA를 추출했습니다. 스크리닝에 의해 수득된 대표적인 펩티드(WRARVPL)를 SP1로 명명하였다. 이어서 합성되었고, 그 분자량은 질량 분석법으로 측정되었다.

토론

조합 파지 라이브러리는 표적 분자를 결합하고 그들의 기능을 조절할 수 있는 새로운 펩티드의 높은 처리량 스크리닝을 위한 강력하고 효과적인 공구입니다^13. 현재 파지 디스플레이 펩타이드 라이브러리는 광범위한 응용 을 가지고 있다. 예를 들어, 수용체^{단백질(23)}및 비단백질 표적^24,25,질병 특이적 항원 모방^13,세포 특이적 펩타이드^{26, 27,}또는 조직/장기 특이적 펩타이드^{21,28,29 및}펩티드 매개 약물 전달 시스템의 개발

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.22 &무; m 필터	Merck Millipore	MPGP002A1
35 cm2 작은 접시	온도	150460
70% 에탄올	광저우 화학 시약 공장	64-17-5-96
gIII 시퀀싱 프라이머			합성 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.에서.
96-웰 플레이트	Nest	701001-2
Agar	Beyotime	ST004D
Bacto-Tryptone	Oxoid	L0037
BALB/c 3T3 셀	ATCC	CRL-­ 6587
BSA	Biodragon	BD-M10110
CCK-8 키트	DOJINDO	CK04
DMEM	Hyclone	sh30243.01
DMF	Newprobe	PB10247
EDTA	Invitrogen	15576028
FGF2 단백질	Sino Biological Inc.	10014-HNAE	순도 >95%
글리신	시그마	G8898-1KG
IPTG	Beyotime	ST097
ITC200 시스템	MicroCal 오메가
NaCl	시그마	S6191
NaHCO3	광저우 화학 시약 공장	144-55-8
NaI	Bidepharm
NaOH	광저우 화학 시약 공장	1310-73-2
PEG– 8000	Sigma	P2139-250
Ph.D.-7 파지 디스플레이 펩타이드 라이브러리 키트	New England BioLabs	E8100S	Ph.D.-7 파지 라이브러리, E. coli ER2738 숙주 균주 및 M13KE 제어 파지
재조합 FGFR2 세포 외 도메인 단백질	Sino Biological Inc.	10824-H08H	> 97%
Biochem Ltd.(중국 상하이)의	소형 펩타이
트라사이클린	시그마	S-SHS-5
트리스	시그마	SLF-T1503
Tween-20	Beyotime	ST825
X-gal	Beyotime	ST912
효모 추출물	옥소이드	LP0021

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