마이크로 파이펫 포부로 전기 형성 및 기계적 특성 측정에 의한 거대한 Unilamellar 하이브리드 소포의 Obtention

요약

이 프로토콜의 목표는 마이크로파이펫 흡인에 의해 거대 소포의 막 기계적 특성을 안정적으로 측정하는 것입니다.

초록

인지질및공중합체에서 얻은 거대 소포는 제어 및 표적 약물 전달, 진단을 위한 바이오센서 내 생체 분자 인식, 인공 세포를 위한 기능성 멤브레인, 바이오영감 마이크로/나노 반응기 개발 등 다양한 응용 분야에서 이용될 수 있습니다. 이러한 모든 응용 분야에서 멤브레인 특성의 특성화는 근본적으로 중요합니다. E. Evans가 개척한 기존 특성화 기술 중 에는 면적 압축성 계수, 굴곡 계수 및 용해 응력 및 변형과 같은 멤브레인의 기계적 특성을 측정할 수 있습니다. 여기서, 우리는 지질 또는 공중합체 (또는 둘 다)의 박막에서 거대한 소포를 얻기 위한 모든 방법론 및 상세한 절차, 마이크로파이펫의 제조 및 표면 처리, 및 이전에 언급한 모든 파라미터의 측정으로 이어지는 흡인 절차를 제시한다.

서론

인지질(liposomes)으로부터 얻은 거대 소포는 1970년대부터 기본 세포막 모델^1로서널리 사용되어 왔다. 1990 년대 후반에, 그들의 지질 유사체^2,3에관하여 명명된 폴리머의 자기 조립에서 얻은 포식어는, 급속하게 약한 기계적 안정성 및 가난한 모듈형 화학 기능을 가진 리포좀에 대한 흥미로운 대안으로 나타났습니다. 그러나, 그들의 세포 생모방 특성은 세포막의 주성분인 인지질로 구성되어 있기 때문에 리포좀에 비해 다소 제한적이다. 더욱이, 그들의 낮은 막 투과성은 막을 통해 종의 통제된 확산이 요구되는 약 납품 같이 몇몇 응용에서 문제가 될 수 있습니다. 최근, 하이브리드 폴리머-지질 소포 및 멤브레인을 설계하는 블록 공중합체와 인지질의 연관성이^4,5연구의증가의 대상이 되고 있다. 주요 아이디어는 각 구성 요소의 이점 (지질 이중층의 생체 기능 및 투과성 및 폴리머 멤브레인의 기계적 안정성 및 화학적 다양성)을 시너지 효과로 결합하는 법인을 설계하는 것입니다: 제어 및 표적 약물 전달, 진단을위한 바이오 센서 내의 생체 분자 인식, 인공....

프로토콜

1. 마이크로 파이펫 제조

참고: 여기에서는 내경이 6~12μm이고 테이퍼 길이가 3-4mm인 마이크로파이펫이 필요합니다. 마이크로파이펫 제조의 상세한 방법은 다음과 같은 것으로 설명되어 있다.

1. 보로실리케이트 유리 모세관을 풀러의 드로바에 넣고 손잡이를 조여 끝부분 중 하나를 고정시다.
2. 조심스럽게 히터 챔버의 측면에있는 구멍을 통해 유리를 밀어.
3. 다른 쪽 끝에 있는 클램핑 노브를 아래로 조입니다.
4. 원하는 사양을 달성하기 위해 팁의 크기와 테이퍼 길이를 제어합니다. 이를 위해 가열 온도, 당김, 속도, 지연 및 압력과 같은 기술적 파라미터를 최적화합니다. 다음은 사용되는 프로그램의 예입니다.
   열: 550 °C
   당기기: 10 (기계 범위: 임의 의 단위에서 0-255)
   속도: 30 (범위: 0-255 임의의 단위)
   지연: 1 (범위: 0-255 임의의 단위)
   압력: 500 (범위: 0-999 임의 의 단위)
5. PUL L을 클릭하여 프로그램에서 정의한 이벤트를 실행합니다. 모세관은 두 개의 마이크로 파이펫으로 분리되어 마이크로 포지를 사용하여 치수를 조정해야합니다.
....

결과

앞서 언급한 프로토콜을 통해 우리는 인지질에서 얻은 다른 합성 거대 단일 라멜라 소포 (GUV)를 연구했습니다 : 2-oleoyl-1-팔미토일 -sn-glycero-3-phophocholine (POPC), 삼중합체: 폴리 (에틸렌 옥사이드)-b-Poly (디메틸실록산)-b-폴리(에틸렌옥사이드) (PEO₁₂-b-PDMS₄₃-b-PEO₁₂₎이전 연구에서 합성된^13,및 디블록 공중합체 폴리(디메틸실록산)-b-폴리( 에틸렌옥사이드) (PDMS₂₇-b-PEO_17). 인지질 POPC를 가진 삼중블록 공중합체 PEO8-b-PDMS22-b-PEO_8의 협회가 생성된 GHUV(Gia.......

토론

마이크로파이펫 코팅은 신뢰할 수 있는 측정을 얻기 위한 핵심 포인트 중 하나입니다. 마이크로파이펫에 소포의 부착을 방지해야 하며, 코팅은 BSA, β-카제인 또는 서파실과 함께 문헌^{17,18,19,20,21에서}일반적으로 사용된다. 코팅 절차의 세부 사항은 거의 언급되지 않습니다.

BSA의 용해는 좋은 용해화를 달성하기 위해 교반 하에서 적어도 4 시간 동안 수행되어야한다. 그럼에도 불구하고, 여과 단계는 여전히 마이크로파이펫 팁을 방해할 수 있는 임의의 응집체를 제거하기 위해 요구된다. BSA가 잘 용해되지 않은 경우, 그것의 대부분은 여과에 의해 제거되며, 코팅은 효과가없을 것입니다. 이상.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
마이크로피펫 설계에 필요한 장비 및 재료
borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100-4	외경 및 내경 각각 1mm 및 0.58mm.
Sutter Instrument Co.를	설치했습니다	FB255B	2.5mm*2.5mm 상자 필라멘트
화염/갈색 마이크로피펫 풀러	셔터 계기 Co.	모델 P-97
Microforge	NARISHGE Co.	MF-900	2개의 대물렌즈(10x 및 32x)가 장착된
BSA로 피펫 팁을 코팅하기 위한 재료
소 혈청 알부민 분획 V(BSA)	시그마-알드리치	10735078001
일회용 1ml 주사기 Luer Tip	Codan	62.1612
일회용 10ml 주사기 Luer Tip	Codan	626616
일회용 5 ml 주사기 Luer Tip	Codan	62.5607
일회용 아세테이트 셀룰로오스 필터	Cluzeau Info Labo	L5003SPA	Pore size: 0.22µ m, 직경 : 25mm
유연한 용융 실리카 모세관 튜브	Polymicro 기술.	TSP530660	내경 536µ m, 외경 660&마이크로; m,
포도당	시그마 - Aldrich	G5767
주사기 500 &마이크로; L luer Lock GASTIGHT	Hamilton Syringe Company	1750
시험관 회전 믹서	Labinco	28210109
Micromanipulation 설정
알루미늄 광학 레일, 1000mm 길이, M4 나사, X48 시리즈	Newport
감쇠 광학 테이블	Newport		외부 진동을 방지하기 위해 현미경의 지지대로 사용됩니다.
Micromanipulator	Eppendorf	Patchman NP 2	모듈 유닛(X, Y 및 Z 이동을 위한 모터 유닛)은 어댑터를 통해 도립 현미경에 장착됩니다.
마이크로미터	Mitutoyo Corporation	350-354-10	Digimatic LCD 마이크로미터 헤드 25,4mm 범위 0,001mm
플렉시글라스 물통(100ml)	집에서 만든
TCS SP5 도립 컨포칼 현미경(DMI6000)에는 공진 스캐너와 침수 대물렌즈(HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I)가 장착되어 있습니다.	Leica
X48 레일 캐리어 80 mm 길이, 1/4-20, 8-32 및 4-40 스레드	포함 Newport
자당 및 양서류 용액 준비용 재료
2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Sigma-Aldrich
클로로포름	VWR	22711.244
L-&알파;-포스파티딜에탄올아민-N-(리사민 로다민 B 설포닐)	시그마-알드리치	810146C	로다민 태그 지질
자당 시	그마-알드리치	S7903
Electroformation 설정
10 µ L 유리 모세관 링 캡	Hirschmann	9600110
일회용 1ml 주사기 Luer Tip	Codan	62.1612
H 그리스	Apiezon Apiezon	H 그리스	실리콘 프리 그리스
인듐 주석 산화물 코팅 유리 슬라이드	Sigma-Aldrich	703184
Needle	Terumo	AN2138R1	0.8 x 38mm
저항계(멀티미터)	Voltcraft	VC140
톨루엔	VWR	28676.297
전압 발생기	Keysight	33210A

필라멘트는 .