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방법 논문

교모세포종에서 기능적으로 연관된 miRNAs의 특성화 및 유전자 치료를 위한 인공 클러스터로의 엔지니어링

5.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/60215

⸱

2019년 10월 4일

 , 
1Department of Neurosurgery, Brigham and Women's Hospital-Harvard Medical School

이 논문에서

요약

여기서 설명된 것은 생물학적으로 상승적인 miRNAs및 그들의 조립체를 짧은 트랜스게네인으로 특성화하기 위한 프로토콜이며, 이는 유전자 치료 애플리케이션을 위한 동시 과발현을 허용한다.

초록

건강과 질병에 있는 microRNAs (miRNAs)의 생물학적 관련성은 단 하나 miRNA의 작용 보다는 오히려 많은 동시에 통제된 miRNAs의 특정 조합에 현저하게 의존합니다. 이러한 특정 miRNAs 모듈의 특성화는 치료에서의 사용을 극대화하는 근본적인 단계입니다. 이는 조합 특성이 실질적으로 악용될 수 있기 때문에 매우 관련이 있습니다. 여기서 기재된 것은 교모세포종에서 의질성 염색질 압압기의 조절과 관련된 특정 miRNA 시그니처를 정의하는 방법이다. 접근은 첫째로 정상 조직에 비교된 종양에서 통제되는 miRNAs의 일반적인 단을 정의합니다. 분석은 특정 세포 상태 도중 동시 표현되는 miRNAs의 하위 단을 강조하는 차등 배양 조건에 의해 더 구체화됩니다. 마지막으로, 이 필터를 만족시키는 miRNAs는 자연적으로 존재하는 miRNA 군집 유전자의 발판에 근거를 둔 인공 polycistronic transgenes로 결합되고, 수신 세포로 이 miRNA 모듈의 과발현을 위해 이용됩니다.

서론

miRNAs는 암4,5를포함하여 많은 질병에 대한 광범위한 유전자 치료 접근법의 개발을위한 타의 추종을 불허하는 기회를 제공합니다1,2,3. 이는 이들의 작은 크기6,간단한 생물발생7,및 협회에서 기능하는 자연적인 경향을 포함하여 이들 생물학적 분자의 몇 가지 독특한 특징을 기반으로한다 8. 많은 질병은 종종 복잡한 생물학적 기능의 조절에 수렴하는 특정 miRNA 발현 패턴을 특징으로한다9. 이 방법의 목적은 먼저 특정 세포 기능에 대해 시너지 효과를 내는 miRNAs 그룹을 식별하는 전략을 정의하는 것입니다. 따라서, 다운스트림 연구 및 응용 분야에서 이러한 miRNA 조합의 재확립을 위한 전략을 제공한다.

이 방법은 여러 miRNAs의 기능 적 분석을 한 번에 허용하여 많은 수의 mRNA를 동시에 타겟팅하여 질병의 복잡한 풍경을 재구성합니다. 이 접근법은 최근에 1) 뇌암에서 동시에 하향 조절되는 3개의 miRNAs 의 그룹을 정의하기 위하여 채택되고 2) 방사선 또는 에 의한 유전자 독성 스트레스에 반응할 뿐만 아니라 신경 분화 도중 강한 동시 발현 패턴을 나타낸다 DNA 알킬화제. 아래에 기술된 클러스터링 방법에 의한 3개의 miRNAs의 조합 재발현은 암세포의 생물학과 심오한 간섭을 초래하며 전임상 연구를 위한 유전자 치료 전략으로서 용이하게 사용될 수 있다10. 이 프로토콜은 miRNA 연구 및 그 번역 응용에 관여하는 사람들에게 특히 관심이 있을 수 있습니다.

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프로토콜

1. 교모세포종에서 기능적으로 연관된 miRNAs의 특성화

  1. 교모세포종 대 뇌의 광범위한 차동 miRNA 발현 분석
    1. 첫째, 종양에서 가장 현저하게 조절된 miRNAs를 결정합니다. 이것은 적어도 세 가지 다른 방법을 사용하여 달성 될 수있다 :
      1. 시퀀싱 데이터11에대한 https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga 발견 된 암 게놈 아틀라스를 채굴하십시오.
      2. 신선한 수술시편(12)으로부터마이크로어레이 분석을 수행한다.
      3. 이전에 게시된 데이터 집합13을사용합니다.
        참고: 어떤 방법을 선택하든, 출력은 종양 생물학과 통계적으로 (직접 또는 반비례) 상관되는 대량 miRNAs 세트를 제공합니다. 이 초기 그룹은 아래에 설명된 바와 같이 식 변경에 대한 보다 동적 분석을 수행하여 가장 엄격한 기능 연관성을 표시하는 miRNAs의 하위 집합의 식별을 위해 추가로 분석되는 miRNA 풀을 구성합니다.
  2. 조건별 miRNA 발현 분석
    1. 세포 분화의 유도:
      1. 사전 코팅된 폴리-D-리신(PDL) 플라스틱 접시를 사용하여 단층 배양형성을 선호합니다. 접시 코팅의 경우, PDL을 100 μg/mL의 농도로 물에 녹입니다. 25cm2표면당 용액 1mL를 사용하십시오. PDL 용액을 적용한 후 PBS 6시간으로 2x 헹구.
      2. 동일한 양으로 인간 신경 줄기 세포 플레이트 (100,000 세포 / 5 mL) 줄기 세포 매체 (신경 기저 배지 + B27 보충 + 20 ng / mL EGF / FGF), 성상 세포 분화 배지 (DMEM + 10 % FBS), 또는 신경 분화 배지 (신경 기저 배지 + B27) 보충, + 2 μM 레티노산)14. oligodendrocyte 분화를 위한 프로토콜IGF-1의 추가 필요 (200 ng/mL) EGF/FGF 제거 후14,15.
      3. 세포 도금 후, 37°C, 5%CO2에서1주일 동안 인큐베이터에 놓는다.
    2. RNA 추출:
      1. 7일 후, 인큐베이터로부터 세포를 제거하고 배지를 제거한다.
      2. PBS (5 mL)로 세포를 씻으하십시오. 그런 다음 용염 시약 1 mL을 추가하여 세포를 용해시키고 세포를 1.5 mL 마이크로 퍼지 튜브로 긁어 세포 스크레이퍼를 사용하여 제거합니다. 용해 된 세포를 포함하는 튜브를 실온 (RT)에서 5 분 동안 유지하십시오.
      3. 제조업체의 지침에 따라 총 RNA 분리를 진행하십시오.
    3. miRNA 발현 분석:
      1. 1.1단계에서 확인된 특정 miRNAs의 차등 발현을 실시간 PCR에 의한 3가지 분화 패턴 중에서 정량화하고, TaqMan 프로브를 사용하고, 역전사 및 PCR 증폭을 위한 제조업체의 프로토콜을 따르는 것( 그림 1).
  3. 스트레스 별 과제에 의한 miRNA 클러스터 검증
    1. 배양 G34 교모세포종 줄기 같은 세포신경기질 배지 + B27 보충제 + 20 ng/mL EGF/FGF. 25cm2 낮은 부착 플라스크에서 5 mL에 1 x 106 셀로 시작합니다.
    2. 도금 후 48시간부터, 다음과 같이 5일마다 DNA 알킬로미드(TMZ)의 농도를 두 배로 늘입니다.
      1. 5 일간 5 μM으로 시작하십시오. 5 일 후, 배지를 제거하고 테모졸로미드없이 신선한 배지로 교체하여 살아남은 세포가 회복될 수 있도록하십시오. 48 시간 후, 10 μM TMZ를 추가하고 또 다른 5 일 동안 배양하십시오.
      2. 1.3.2.1 단계를 반복하면, 적어도 100 μM의 농도가 도달하고 세포가 약물10에내성이 될 때까지 매번 TMZ 농도를 두 배로 한다.
    3. 병렬 실험에서 G34 세포를 다음과 같이 조사하십시오.
      1. 25 cm2 낮은 부착 플라스크에서 5 mL에서 1 x 106 세포를 도금 한 후 48 h부터 시작하여 2 Gy의 에너지로 세포를 조사합니다 (광자 방출을 제공하는 모든 조사자는 허용됩니다). 세포를 인큐베이터로 되돌리고 방해하지 마십시오. 48 시간 후, 추가로 세포를 조사 2 에너지의 Gy.
      2. 총 10Gy의 에너지가 투여 될 때까지 1.3.3.1 4 x 단계를 반복합니다.
      3. 세포를 인큐베이터로 되돌려 놓고 다운스트림 분석 전에 적어도 5 일 동안 신선한 배지에서 회복시키십시오.
    4. 저항의 유도 후, 용해 시약을 사용하여 용해 세포를 제조 업체의 프로토콜에 따라 총 RNA를 추출.
    5. 단계 1.2.1(도2)에기재된 바와 같이 섹션 1.1-1.2에서 확인된 특정 miRNAs의 발현을 분석한다.
  4. 클러스터된 miRNA의 기능적 수렴 특성화
    1. miRNA 표적화 예측 도구를 사용하여 얻은 섹션 1.2-1.3에 정의된 각 miRNA의 예측 타겟을 획득합니다.
      참고: 우리는 일반적으로 TargetScan에 의존, 그 알고리즘은 주기적으로 업데이트로16. 추가 예측 도구는 miRanda17,miRDB18및 DIANA-miRPath19입니다. 이러한 모든 프로그램은 무료 웹 기반 응용 프로그램입니다.
      1. Targetscan의 첫 페이지에서 미리 채워진 드롭다운 메뉴에서 관심 있는 miRNA를 선택합니다. 제출 단추를 클릭합니다.
      2. 다운로드 테이블 링크를 사용하여 결과 대상 목록을 스프레드시트로 다운로드합니다(추가그림 1).
      3. 거짓 긍정 예측의 가능성을 줄이려면 다운스트림 분석에서 보존된 사이트 열 내에 대상만 포함합니다. 또한 추가miRNA 예측 프로그램(위 참조)을 사용하고 모든 알고리즘에 공통적인 표적만 을 포함하여 추가의 엄격성을 얻을 수 있습니다.
    2. ToppGene Suite20를 사용하여 유전자 온톨로지 범주에 따라 생성된 표적을 분류하여 각 miRNA에 공통적인 경로의 농축을 평가합니다.
      1. HGNC 심볼을 입력 유형으로 사용하여 "트레이닝 유전자 세트" 창에서 1.4.1단계에서 얻은 표적목록을 붙여넣습니다. [제출 > 시작]을 클릭합니다. 이 프로그램은 입력된 유전자 목록에 대한 가장 중요한 "Go" 범주를 보여주는 출력 표를 제공할것이다(보충 도 2).
    3. 마지막으로 공통 경로 또는 세포 과정의 조절에 각 miRNA의 기여를 확립하기 위해 (이 경우, 크로마틴 조절), 특정 세포 과정에 관여하는 유전자의 전체 목록에 대해 1.4.1 단계에서 얻은 각 표적을 확인하십시오. 즉, 염색질 조절), 생물정보학 및 진화 유전체학 웹사이트에서 제공되는 벤 다이어그램 함수를 사용하여 http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn.
      참고: 이 프로그램은 동시에 여러 그룹의 교차를 허용합니다(그림 3). 각 miRNA에 의해 제공되는 특정 고유 표적은 다운스트림 기능 실험을 위해 추가되고 선택됩니다.
      1. 프로그램의 첫 페이지에 각 miRNA또는 각 창에 대한 관심대상 mRNA인 경우 목록을 업로드하거나 복사/붙여넣습니다. 고유한 식별자로 각 목록의 이름을 지정합니다.
      2. 제출을 클릭합니다. 이 프로그램은 각 섹터의 유전자 수와 함께 벤 다이어그램의 시각적 출력뿐만 아니라 각 하위 집합 및 교차 조합에 대한 mRNAs의 전체 목록을 제공합니다.

2. miRNA 모듈을 다각성 형질전환 클러스터로 조립

  1. miR-17-92 클러스터 궤적에 기초한 형질전환 스캐폴드의 제조
    1. Ensembl 게놈브라우저(21)로부터miR-17-92 클러스터의 뉴클레오티드 서열을 얻었다. ~800염기 쌍 "코어" 서열은 코어 서열의 상류(5') 및 다운스트림(3') 모두 궤적및 적어도 200-뉴클레오티드 플랭크 서열의 모든 6개의 인코딩된 miRNA 헤어핀을 포괄한다.
    2. 위의 시퀀스를 단어 편집 프로그램에 붙여 넣습니다.
    3. miRBase22에서검색하여 6개의 네이티브 헤어핀 각각의 순서를 정의합니다. 이전에 확인된 "코어" 서열의 범위 내에서 이러한 시퀀스를 각각 표시합니다. 각 헤어핀 사이의 모든 서열은 이식유전자의 올바른 처리에 중요한 스페이서 서열을 나타냅니다.
    4. 각 헤어핀의 5' 및 3' 말단모두에서 3-5개의 뉴클레오티드를 제외하고, "코어" 서열로부터 기본 헤어핀 서열을 제거하고, 이는 새로운 헤어핀에 대한 수용자역할을 할 것이다.
  2. 여러 miRNAs를 코딩하는 새로운 이식 유전자 구축
    1. miRBase로부터 이식유전자에서 과발현되는 miRNA의 헤어핀 서열을 구한다. 마이크로 프로세서 절단 부위인 특정 뉴클레오티드를 주의 깊게 주의하십시오.
    2. 제거된 헤어핀(단계 2.1.4)을 단계 2.2.1에서 얻은 원하는 miRNAs의 헤어핀 서열로 교체합니다.
    3. 이식유전자의 양쪽 측면 영역에 원하는 제한 서열을 추가하여 원하는 전달 벡터로 서브클로닝을 용이하게 합니다. 선택한 제한 시퀀스가 시퀀스 자체에 없는지 확인합니다.
    4. 음성 대조를 위해, 각 성숙한 miRNA의 자연적인 20-뉴클레오티드 서열을 대체하기 위하여 20-뉴클레오티드 스크램블 서열을 이용하십시오. https://genscript.com/tool/create-scrambled-sequence 같은 온라인 도구를 사용하여 이러한 스크램블 시퀀스를 생성합니다.
  3. 이식유전자의 2차원 구조 검증
    1. RNA 구조 예측 소프트웨어 프로그램 RNAweb Fold23에전체 형질전환 서열을 복사합니다.
    2. 표준 프로그램 설정을 사용하여 진행을 클릭합니다.
    3. 그래픽 출력을 분석, 특히 잘 정의 된 헤어 핀의 존재와 마이크로 프로세서 절단 사이트에 적어도 11 개의 뉴클레오티드 근접 이중 가닥 줄기 구조의 존재. 또한, 헤어핀 서열 내의 분기점이 없는지 찾아보십시오(그림4).

3. DNA 합성에 의한 형질전환

  1. 키메라 miRNA 클러스터의 설계 및 실리코 검증 후, 상용공급업체(24)로부터 DNA 합성을 이용한 작업 서열을 얻고 벡터 및 이식유전자 전달내로 다운스트림 클로닝을 진행한다. 생체외전달(10) 및 아데노 관련 바이러스(AAV)를 생체내 두개내전달(25)에렌티바이러스 벡터를 사용하였다.

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결과

이 방법은 신경 분화 동안 특별히 공동 발현되는 뇌종양에서 일관되게 하향 조절되는 3개의 miRNAs 모듈의 특성화를허용(도 1)후 종양 생존 반응에 관여 치료(그림 2). 이것은 복잡한 온코제닉 크로마틴 억압경로를 조절함으로써 달성됩니다. 이러한 공동 발현 패턴은 이들 3개의 miRNAs 중에서 강력한 상승활성을시사한다(도 3). 따라서, miRNA의 작은 크기와 간단한 생체 발생을 활용하여, 이 프로토콜의 두 번째 부분은 교모세포종 세포에서 3개의 miRNAs의 발현을 동시에 재현할 수 있는 이식유전자(도4)를설계하는데 사용되었다. 생체외 및 생체 내 모두, 종양 생물학 및 유망한 번역 적용가능성에 상당한 간섭이 있음(...

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토론

이 프로토콜은 단독으로 기능하는 것이 아니라 miRNA가 그룹에서 작업함으로써 생물학적으로 관련이 있다는 개념에 기초하며, 이들 그룹은 특정 세포 문맥26에의해 전사적으로 결정된다. 번역 관점에서이 접근을 정당화하기 위해 세포 / 조직에서이 다중 miRNA 패턴을 재현 할 수있는 후속 프로토콜이 도입됩니다. 이는 miRNA의 비교적 단순한 생체 발생을 이용하여 가능하며, 이에 의해 마이크로프로세서에 의한 특징적인 miRNA 헤어핀의 인식이 필요하고 정확한 miRNA처리(27)에충분하다. 동시에, 이 최소한의 요구 사항은 어떤 납품 벡터로 장착될 수 있는 짧은 DNA 순서 안에 포함된 원하는 miRNA 모듈의 발현을 위한 백본으로 자연적으로 발생하는 miRNA 클러스터의 유전 적 스캐폴드의 사용을 허용합니다 선택의 여지가 있습니다. 이 프로토콜의 주요 요구 사항은 적절한 절단을 허용하기 위해 헤어핀 구조와 줄기 성분의 충분한 길이를 유지하는 것입...

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공개 사항

저자는 이해 상충을보고하지 않습니다.

감사의 글

저자는 지원과 건설적인 비판에 대한 하비 쿠싱 신경 종양학 연구소의 구성원에게 감사하고 자합니다. 이 작품은 NINDS 보조금 K12NS80223 및 P. P에 K08NS101091에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.4 % 낮은 용융 온도 아가로스 IBI 사이언티픽IB70058
0.45 &마이크로; M 멸균 필터 유닛Merck MilliporeSLH033RS
1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브Eppendorf22431081
6-Well plates Greiner Bio-One657160
무감각 마우스 (FoxN1 nu/nu)Envigo069(nu)/070(nu/+)
B-27 보충 Thermo Fisher Scientific12587010
세포 배양 플라스크Greiner Bio-One660175
세포 스크래퍼, 16cmSarstedt83.1832
세슘 137 방사선 조사기 JL Sheperd and Associates핵심 시설 (하버드 의과대학)
클로로포름시그마-알드리치439142-4L
DMEM, 고포도당, 피루브산 써모 피셔 사이언티픽11995040
Dulbecco' S 인산염 완충 식염수 Gibco14190144
Eosin Y 솔루션 시그마-알드리치E4009
태아 소 세럼 Sigma-AldrichF9665
포르말린 솔루션Sigma-AldrichHT501128
GlutaMAX 보충제 Thermo Fisher Scientific35050061
HEK-293American Type Culture CollectiATCC CRL-1573
Hematoxylin solutionSigma-Aldrich1051750500
Human primary glioma stem-like cells (GBM62)제공: Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women' s Hospital, Boston, MA)
Human primary glioma stem-like cells (MGG4)Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA)제공렌
티바이러스 벡터 pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFPSystem BiosciencesCD511B-1
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific11668019
Microcentrifuge 냉장Eppendorf모델 번호 5424 R, 카탈로그 번호 5404000138
장착 매체 Thermo Fisher Scientific4112APG
Nalgene 고속 폴리카보네이트 라운드 바텀 원심분리기 튜브 써모 피셔 사이언티픽 3117-0380PK
NanoDropThermo Fisher Scientific2000c
신경전구세포(NPC)Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women' s Hospital, Boston, MA)
Neurobasal Medium Thermo Fisher Scientific21103049
Nikon eclipse Ti 전동 형광 현미경 시스템Nikon, Japan14314
Opti-MEMThermo Fisher Scientific31985088
PCR 튜브 시그마-알드리치CLS6571-960EA
페니실린-스트렙토마이신 Thermo Fisher Scientific15140122
페트리 디쉬 94/16 Greiner Bio-One632180
폴리-D-라이신 시그마- 알드리치P4707
재조합 인간 EGF 페프로텍 AF-100-15
재조합 인간 FGF-basic 페프로텍 AF-100-18B
레티노산Gibco12587-010 
RNA Miniprep KitDirect-zolR2050
S1000 열 순환기 Bio-Rad1852196
소형 동물 이미지 유도 마이크로 조사기 Xstrahal Life Sciences, UKCore facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA)
Sorvall WX+ 초원심분리기 써모 피셔 사이언티픽 
StemPro Accutase Thermo Fisher ScientificA1110501
StepOne Real-Time PCR 시스템응용 바이오시스템 
SterilGARD 생물 안전 캐비닛 The Baker CompanySG403A-HE
설탕시그마-알드리치S9378
T98-G미국형 문화 수집ATCC CRL-1690
TaqMan MicroRNA 역전사 키트 Thermo Fisher Scientific4366596
TaqMan Universal PCR Master MixThermo Fisher Scientific4324018
TemozolomideTocris Bioscience2706
Tissue-Tek 최적 절단 온도 Fisher ScientificNC9636948
TRIzol 시약 Thermo Fisher Scientific15596026용해 시약
U251-MGAmerican Type Culture CollectiATCC HTB-17
U87-MG American Type Culture CollectiATCC HTB-14
ViraPower 렌티벡터 표현 시스템 Thermo Fisher ScientificK4970-00
물, HPLC 등급FisherW54
Xylene 시그마-알드리치534056
750001004376357

참고문헌

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