여기에서, 우리는 RNA 염기서열 분석 및 RT-qPCR를 위한 Drosophila 남성 부속부전 (이차 세포)에서 특정 세포 집단을 해리하고 분류하는 프로토콜을 제시합니다. 세포 분리는 해부, 프로테아제 소화 및 기계적 분산을 요구하는 다단계 해리 과정 후 GFP 발현 이차 세포의 FACS 정제를 통해 달성된다.
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이 논문에서
요약
초록
기관의 기능을 이해하려면 종종 구성 세포 집단의 역할을 이해하는 것이 유용합니다. 불행히도, 개별 적인 세포 인구의 희미함은 수시로 분자 연구 결과를 위한 충분한 물자를 얻기 위하여 어렵게 만듭니다. 예를 들어, Drosophila 남성 생식 시스템의 부속동맥에는 두 가지 뚜렷한 분비 세포 유형이 포함되어 있습니다. 주요 세포는 선의 분비 세포의 96 %를 구성하고, 보조 세포 (SC)는 세포의 나머지 4 %를 구성하는 동안 (남성 당 약 80 세포). 두 세포 모형이 정액 액체의 중요한 분대를 생성하더라도, 단지 몇몇 유전자는 SCs에 특정하기 위하여 알려집니다. SCs의 희소성은, 지금까지, 이 중요한 세포 모형의 전사성 분석 연구 결과 방해했습니다. 여기서, RNA 추출 및 시퀀싱을 위한 SC의 정제를 허용하는 방법이 제시된다. 프로토콜은 SC 특정 GFP 리포터를 표현하는 파리에서 먼저 땀샘을 해부한 다음 개별 세포를 얻기 위해 프로테아제 소화 및 기계적 해리를 이 땀샘을 복종시키는 것으로 구성됩니다. 이러한 단계에 따라, 개별, 살아있는, GFP 표시 세포는 RNA 정제를 위한 형광 활성화 세포 선별기 (FACS)를 사용하여 분류된다. 이 절차는 다운스트림 RT-qPCR 및/또는 RNA 시퀀싱을 위한 조건당 ~40남성으로부터 SC 특이적 RNA를 하루 동안 산출합니다. 절차의 신속성과 단순성은 다른 유전자형 또는 환경 조건에서 많은 다른 파리의 전사체가 단기간에 결정될 수 있게 합니다.
서론
기관은 여러 세포 유형으로 구성되어 있으며, 각각 은산 기능을 가지고 있으며 때로는 매우 다른 유전자 세트를 발현합니다. 기관이 어떻게 기능하는지 에 대한 정확한 이해를 얻으려면 이 기관을 구성하는 각 별개의 세포 유형을 연구하는 것이 종종 중요합니다. 가능한 기능을 탐구하는 데 사용되는 주요 방법 중 하나는 전사체 분석입니다. 이 강력한 방법은 활성 프로세스 및 경로를 밝히기 위해 세포에서 유전자 발현의 스냅 샷을 제공합니다. 그러나, 분석의 이 모형은 수시로 훨씬 더 풍부한 이웃 세포에서 정제되어야 하는 희소한 세포 인구를 위해 어렵습니다. 예를 들면, Drosophila 남성 부속동맥은 2개의 분비 세포 모형의 1 차적으로 위로 위로 한 기관입니다. 2개의 세포 모형의 희소한 이 선의 세포의 단지 4%를 포함하는 것과 같이, 세포 모형 특정 전사체 분석의 사용은 이 세포의 기능을 결정하는 것을 돕기 위하여 이용되지 않았습니다.
부속동맥(AGs)은 곤충의 남성 생식기관의 기관입니다. 그(것)들은 정액 액체의 단백질의 대부분의 생산에 책임 있습니다 (정액 액체 단백질 (SFPs) 및 부속 동맥 단백질 (Acps)). 이들 SFPs 중 일부는 짝짓기 후 반응(PMR)이라고 불리는 짝짓기 여성의 생리적 및 행동 반응을 유도하는 ....
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프로토콜
1. 초파리 라인 사용 및 남성의 컬렉션
- 이 프로토콜의 경우 주 세포가 아닌 SC에서 GFP를 발현하는 남성을 사용하십시오. 여기서, AbdB-GAL4 드라이버(참고18에기재됨)가 UAS-GFP(염색체 2상)와 재결합되어 사용된다. 다른 적절한 드라이버도 사용할 수 있습니다. 상이한 돌연변이 조건 하에서 SC의 분리를 위해, SC 특이적 GFP 라인을 포함하는 선으로 돌연변이를 교차한다.
- 각 유전자형에 대해 약 25개의 건강한 처녀 남성을 2회 분량으로 수집하고, 신선하게 만든 Drosophila 식품을 곁들인 바이알에서 3-4일 동안 25°C에서 나이를 먹습니다.
참고: 나이, 짝짓기 상태, 영양 및 사회 환경이 각각 생식 생물학에 영향을 미치기 때문에 이러한 매개 변수를 제어하기 위해 엄격한 프로토콜을 따라야합니다. 처녀 남성은 25 °C에서 pupal eclosion 후 3-4 일 동안 숙성되고 12 h /12 h의 빛 / 어두운 주기로, 표준 옥수수 식사 - 한천 - 효모 음식에, 유리병 당 20-25 남성의 그룹에서.
2. 솔루션 및 재료 준비
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결과
여기에 제시된 프로토콜은 한 실험자가 Drosophila 남성 액세서리 땀샘으로부터 이차 세포를 분리하고 하루 동안 RNA를 추출할 수 있게합니다(그림 1).
우리는 Abd-B-GAL4 구문(18)을 사용하여 이차 세포(SC)를 라벨을 붙이지만 주세포(MC)는 GFP(그림2A)로표시하지 않습니다. 이 절차의 한 가지 목적은 SC의 야생형 전사체를 얻는 것입니다(야생형은 GFP 및 GAL4를 발현하는 형질전환 파리에서 얻어지므로 반전된 쉼표로 작성됩니다). 또 다른 목적은 다른 조건에서 그들의 유전자 발현을 공부할 수 있는 빠르고 쉬운 절차를 통해 SC R.......
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토론
가상 디스크와 같은 초파리 조직에서 세포 해리를 위한 방법은 이미23에기재되어 있다. 단순히 액세서리 땀샘에 이러한 절차를 사용 하려는 우리의 시도 실패, 이 새로운 프로토콜을 개발 하는 우리를 격려. 프로테아제 소화와 기계적 삼각화는 시술의 성공을 위해 우리가 고민하는 중요한 단계였으며, 따라서 실험자가 만족스러운 결과를 얻을 수 있도록 섹션 2에서 5절에 많은 메모를 배치했습니다. 해리가 성공하기 위해서는 펩티다아제는 내강내 의 점성 정액과 동맥 주위의 근육 층에 의해 보호되는 액세서리 선 세포에 도달해야합니다. 땀샘의 원위 부분을 해부하는 것은 따라서 중요했다 (단계 3.6). 또한, 격렬한 흔들림(단계 4.1)으로 적어도 60분 동안 소화가 필요하였다. 트립신 용액(예: 트립플)을 가진 부드러운 해리는 기계적 해리가 될 때까지 선 무결성과 세포 생존가능성을 보존했습니다. 트립신 용액과 관련하여 파파인 또는 콜라게나아제의 첨가는 해리를 개선시켰습니다(완벽한 해리는 .......
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공개 사항
저자는 공개가 없습니다.
감사의 글
우리는 Karch 연구소의 구성원, iGE3 게놈 판형, 제네바 대학의 유동 세포 분석 핵심 시설, FACS 프로토콜을 설정한 장 피에르 오브리-라체인예 박사에게 감사드립니다. 우리는 IGV에 읽기를 시각화에 그의 도움 루카 Stickley 감사합니다. 우리는 인물을 재사용할 수 있는 부드러운 허락을 주신 것에 대해 감사드리며, 글을 쓰는 창의력을 발휘하라는 메시지를 전해주신 편집자분들께 감사드립니다.
이 연구는 제네바 주(CI, RKM, FK), 스위스 국립 연구 기금(www.snf.ch)과 클라라즈 재단(FK)의 기부금에 의해 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 24웰 조직 배양 플레이트 | VWR | 734-2325 | |
| 해부 | |||
| Bunsen | |||
| Draq7 0.3 mM | BioStatus | DR71000 | |
| 플라스틱 마이크로튜브 1.5 mL | Eppendorf | ||
| FACS | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | |
| 미세 해부 겸자 | |||
| 태아 소 혈청 | Gibco | 10270-106 | 사용 전 열 비활성화 |
| 부 | |||
| 얼음 양동이 | |||
| ImProm-II 역 전사 시스템 | Promega | A3800 | |
| MasterPure RNA 정제 키트 | 진원지 | MCR85102 | |
| Nextera XT 키트 | illumina | https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html | |
| P1000 | Gilson | ||
| P20 | Gilson | ||
| P200 | Gilson | ||
| Papain | 50U/mL 재고 | ||
| PBS | 집에서 만든 | ||
| 페니실린-스트렙토마이신 | Gibco | 15070-063 | |
| PolydT 프라이머 | |||
| 랜덤 헥사머 프라이머 | |||
| RNA 6000 피코 키트 | 애질런트 | ||
| 슈나이더' s Drosophila medium | Gibco | 21720-001 | |
| SMARTer cDNA 합성 키트 | Takara | https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits | |
| SYBR CFX 적용용 마스터 믹스 선택 | biosystems | 4472942 | |
| 써모 셰이커 | 항저우 Allsheng intruments | MS-100 | |
| Tipone 1250 μ L 눈금 팁 | Starlab | S1161-1820 | |
| Tipone 200 μ L 베벨 팁 | Starlab | S1161-1800 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604013 | |
| Vortex |
참고문헌
- Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annual Review of Entomology. 56, 21-40 (2011).
- Carmel, I., Tram, U., Heifetz, Y. Mating induces developmen....
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