방법 논문

콜라겐 유도 관절염 모델에서 조직 염증의 분자 경로를 평가하기 위한 마우스 발 처리를 위한 저온 분쇄 프로토콜

DOI:

10.3791/60229

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2019년 10월 30일

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1Immunology, Janssen Research & Development, Inc.

이 논문에서

요약

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액체 질소 냉동고 밀을 사용하여 뮤린 발을 처리하는 극저온 분쇄 방법은 조직에서 추출 된 RNA 또는 단백질의 수율과 품질을 개선하고 염증과 관련된 분자 프로파일의 분석을 가능하게하기 위해 개발되었습니다. 응답.

초록

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국소 조직에서 의 분자 변화를 프로파일링은 생체 내에서 치료 후보의 작용의 메커니즘(들)을 이해하는 데 매우 중요하다. 관절염 연구 분야에서, 많은 연구는 뼈의 복잡한 혼합물로 구성된 염증 관절에 초점을 맞추고, 연골, 근육, 기질 세포와 면역 세포. 여기에서, 우리는 극저온 통제된 환경에서 균일한 분쇄된 견본으로 불을 붙인 마우스 발을 중단하는 믿을 수 있고 강력한 기계적인 방법을 설치했습니다. 단백질 및 RNA 분해제는 국소 조직에서 관련 질병 경로의 단백질 및 전사 종점 및 분자 특성을 가능하게 하기 위해 처리되었습니다.

서론

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류마치스성 관절염 (RA)는 피부, 심혼, 폐 및 눈과 같은 기관의 합동 그리고 추가 관절 에 있는 지속적인 대칭 활막염을 가진 만성 조직 선동적인 질병1. 면역 반응의 전신 발현은 인간 환자에서 분명하지만, RA 병리학의 특징 중 하나는 활액 상 조직내 면역 세포의 침투및 활액 섬유 아세포의증식2.

인간 RA와 유사하게, 마우스 콜라겐 유도 관절염 (CIA) 모델은 활액 조직 및 전신 구획에 있는 활성 면역 반응으로 강한 조직 염증을 이끌어 냅니다. CIA 모델에 대한 상이한 마우스 균주의 감수성은 주요 조직 적합성 복합체(MHC) haplotype 및 항원 특이적 T 세포 및 B 세포 상호작용3,4로연결된다. 또한, 자가 항체 생산, 면역 복합체 침착, 골수성 세포 활성화, 활액 면역 침윤을 통한 다관절 증상 및 판누스 형성을 포함한 인간 RA의 많은 병원성 경로도 이 모델에서 분명하게 드러납니다. 5,6. 수사관은 항 염증 성 사이토 카인 치료의....

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프로토콜

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모든 동물 실험은 얀센 R&D의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 정책에 따라 수행되었습니다.

1. 극저온 냉동고 밀 기반 분쇄 방법

  1. CIA 연구의 종료에, 희생 마우스와 함께 1.5% 이소플루란 다음 자궁 경부 탈구.
  2. 티슈 처리 당일, 모든 기구(주걱, 갈기 바이알 등)를 드라이 아이스에 최소 10분 동안 식히십시오.
  3. 그림 1A에묘사 된 모피 선에서 가위로 뒷발을 잘라 .
  4. 각 발을 1.5 mL 미세 원심 분리튜브로 옮기고 액체 질소에 즉시 얼린 다음 냉동 발을 -80 °C에서 보관하십시오. 샘플을 1주일 이상 냉동 보관하지 마십시오.
  5. 그림 1B에 나타난 바와 같이 액체 질소로 냉동실 밀을 채우고 적어도 10 분 동안 평형화하십시오.
  6. 처리되지 않은 시료를 드라이 아이스에 보관하고 동결 해동 주기를 피하십시오.
  7. 한 뒷발을 바닥 강철 플러그로 미리 냉각된 대형 폴리카보네이트 연삭 바이알에 옮기고, 미리 냉각된 강철 임팩터를 삽입하고 미리 냉각된 ....

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결과

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여기서, 우리는 도 2A에서CIA 마우스의 앞발에서 추출된 RNA의 대표적인 겔 이미지 시각화를 보여준다. 28S rRNA 및 18S rRNA 대역은 모든 샘플이 충분한 양의 손상되지 않은 RNA를 가지고 있음을 나타냅니다. 다음으로, 도 2B에서단백질 BCA 분석을 기반으로 총 단백질 농도의 대표적인 산산도를 보여 준다. 순진한 마우스, CIA 마우스 또는 다양한 치료법하에 CIA 마우스로부터의 총 단백질 농도는 그룹 전반에 걸쳐 비교된다. 단백질 추출물에서 염증성 사이토카인 및 케모카인의 농도를 결정하기 위해 Luminex 분석을 수행했습니다. 우리는 도 2C에서정규화된 사이토카인 및 케모카인(pg/mg 총 단백질)의 .......

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토론

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활액 조직에서 분자 경로를 평가하는 강력한 과학적 근거가 있지만, 뮤린 CIA 모델의 면역 프로파일링에 대한 많은 보고서는 말초 혈액에 초점을 맞춘 반면 염증이있는 발의 단백질 및 RNA 분석 데이터는 다소 제한적입니다. 이 편견에 대한 몇 가지 가능한 이유가 있습니다 : 뮤린 발목 관절은 ~ 2cm보다 크지 않습니다. 영향 받은 지역은 조직 분쇄기, 유봉 및 박격포, 실리카 비드 중단, trituration 또는 효소 소화와 같은 전통적인 방법을 사용하여 균질화하기 어려운 피부, 뼈 및 결합 조직으로 이루어져 있습니다. 이러한 방법은 전형적으로 불완전한 균질화, 낮은 단백질 또는 RNA 수율, 또는 단백질 분해 및 핵산 분해로 인한 일관되지 않은 품질을 초래한다. 본 명세서에 기재된 견고한 방법은 단일 균일한 샘플에서 질병의 분자 시그니처를 확립하기 위한 다운스트림 프로테오믹 및 전사 프로파일링 노력을 가능하게 하는 균질분쇄 된 냉동 분말을 생성하는 상세한 절차를 제공합니다. 소스.

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공개 사항

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저자 BJ, SH, ML, RM, ML, TO 및 FS는 Janssen 연구 및 개발 Inc.의 직원이며 모회사인 Johnson & Johnson, Inc.의 주주입니다.

감사의 글

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저자는 이 원고의 출판을 지지해 준 에디스 얀센과 나빈 라오와 제니퍼 타운에 대한 비판적 검토에 감사를 표하고자 한다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
5mm 스테인리스 스틸 비드Qiagen69989
베타-메르캅토에탄올SigmaM6250RNASE 효소를 억제하는 시료 환원제
바이오분석기 키트 Agilent5067-1511RNA 적격성 평가 키트
b-메르캅토에탄올SigmaM6250
세포 배양 등급 WaterCorning25-055-CIWater
Cell lysis stock solution, Cell Signaling9803
Eppendorf TubeEppendorf22363204Microfuge tube
Eppendorf tube centrifuge box, Nalgene5055Box, eppendorf tube를 수평 튜브 배열로 고정하기 위한
Labellast 247, Variable Speed RockerBenchmark ScientificBR5000
Freezer MillSpex Sample Prep6875Freezer/Mill 발을 분쇄 분말로 가공하기 위한
Spex Sample Prep6801폴리카보네이트 바이알 발을 분쇄 분말로 가공하기 위한
Pierce BCA 키트Pierce23225총 단백질 정량화를 위한 키트
프로테아제 억제제 칵테일 세트 1Calbiochem539131프로테아제 억제제
단백질 BCA 키트Pierce23225
Quantigene 키트, ThermofisherQP1013bDNA 분석 키트
냉장 마이크로 원심분리기Eppendorf5417R원심분리
RLT 완충액,Qiagen79216RNA 추출 완충액
RNeasy 미니 키트, RNeasy컬럼, RLT 완충액 및 RW1 완충액을 포함한Qiagen74104
ShakerBenchmark ScientificBR5000로커/셰이커
주걱VWR10806-412분말 이송용 주걱
스테인레스 스틸 비드Qiagen69989단백질 추출 중 혼합용 비드
튜브 추출기Spex Sample Prep6884분쇄 바이알 상단 제거용 추출기
VortexerVWR10153-838시료 혼합
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참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Firestein, G. S. Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Journal of Clinical Rheumatology. 11, S39-S44 (2005).
  2. McInnes, I. B., Schett, G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. New England Journal of Medicine. 365

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재인쇄 및 허가

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